Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Özet

Bu protokolde, yeni sentezlenen veya yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili proteinleri ve histon modifikasyonlarını incelemek için yeni bir BrdU-ChIP-Slot-Western tekniğini açıklıyoruz.

Özet

Histon deasetilaz 1 ve 2 (HDAC1,2) DNA replikasyonunun bölgelerine yerleşemez. Önceki bir çalışmada, seçici bir inhibitörü ve genetik demonte sistemi kullanılmasıyla, çoğalma çatala ilerlemesi ve memeli hücrelerinde doğmakta olan kromatin bakım HDAC1,2 için yeni fonksiyonlar göstermiştir. Ayrıca, yuva leke ile brom-deoksiüridin (BrdU) -etiketli DNA kromatin immunoprecipitation (ChIP) birleştiren ve Batı nicel doğmakta olan DNA ile ilişkili proteinler veya histon modifikasyonu ölçmek için analizler bir BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği kullanılmıştır.

Aktif bölünen hücreler HDAC1,2 selektif inhibitörü ile tedavi edilebilen veya HDAC1 ve HDAC2 karşı siRNA'lar transfekte edilmiş ve daha sonra, yeni sentezlenmiş DNA, timidin analog bromodeoksiüridin (BrdU) ile etiketlenmiştir edildi. Önemli bir hücre döngüsü tutuklama veya apoptozis varken BrdU etiketleme nedeniyle HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybına bağlı olarak bir zaman noktasında yapılmıştır. Aşağıdakı lBrdU histon asetilasyonu bakışı, Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) veya kromatin remodeler hücrelerin Abeling spesifik antikorlar ile gerçekleştirildi. BrdU etiketli giriş DNA çökeltilmiş (veya chiped) DNA daha sonra slot blot tekniği kullanılarak bir membran üzerine noktalar ve UV kullanılarak immobilize edildi. Her yuvaya doğmakta olan DNA miktarı, kantitatif bir anti-BrdU antikoru ile Western analizi kullanılarak değerlendirildi. Yeni sentezlenen DNA ile ilişkili histon asetilasyonu işaretleri ve kromatin Remodeler seviyeleri üzerindeki HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybı etkisinin daha sonra kontrol numunelerine ile muamele edilmiş örneklerde elde edilen BrdU-yongası sinyali normalize ederek belirlenir.

Giriş

Kusurlu DNA onarım ve / veya DNA replikasyon hücre ölümünü tetikleyebilir genom istikrarsızlık, önemli bir nedeni vardır. Tek onarılmamış çift iplikli sonu hücre ölümüne neden ¹ için yeterlidir. Kromatin organizasyonu geçici, hem çoğaltma sırasında değişmiş ve ^2,3 onarmak ve bu süreçlerin bütünlüğünü genom için bir tehdit neden olacaktır sırasında epigenetik bilgileri korumak için başarısızlık olduğunu. HDAC3 veya HDAC1,2 fonksiyon kaybı genotoksik strese (DNA hasarının) ve hücre ölümüne yol açan ^4-9 S-faz ilerlemesi, DNA replikasyonu ve onarımı engellemektedir. Bu nedenle, kanser hücrelerinde replikasyon, onarım ve kromatin bozabilir ve bu da büyümeyi durdurur ve hızlı bir şekilde büyüyen bir kanser hücrelerinde seçici hücre ölümünü teşvik DNA hasarına neden seçici HDAC inhibitörlerinin kullanımı pratik bir stratejidir.

DNA replikasyonu sırasında, kromatin hızla sökülüp ve daha sonra DNA çoğaltılması takip yeniden birleştirilen. Yeni synthesized histon H4 kromatinden üzerine K5 ve K12 kalıntılarının (H4K5K12ac) ve aşağıdaki birikimi asetillenebilir edilir hızla histon deasetilazların (HDAC'ler) ^10,11 tarafından deasetile edilir. Histon deasetilasyonu ile oluşmakta olan kromatin bütünlüğünü korumak için hücrelerin hatası da, DNA hasarı ve hücre ölümüne neden olabilir çatal çöküşü, yol açabilir. Biz son zamanlarda HDAC1,2 selektif inhibisyonu artırır histon asetilasyonu (H4K5ac, H4K12ac ve H4K16ac) ve azaltılmış çoğaltma çatal ilerlemesi ile ilişkilidir doğmakta kromatin üzerinde SMARCA5 kromatin remodeler aktivitesini inhibe olduğunu gösterdi çatal çöküşü artmış ve çoğaltma strese bağlı DNA hasarı ⁶ arttı . Bu nedenle, HDAC inhibitörü tedavisi hızla bu hücrelerin döngüsü olarak, kanser hücrelerinde çok hızlı bir şekilde, DNA hasarı ve ölümü tetikleyebilir ve S-fazı yoluyla birçok kez geçmek için oluşmakta olan kromatin yapısını değiştirebilir. Bu HDAC'ler histon asetilasyonunu ve protein Bindi düzenleyen nasıl işlediğini anlamak önemlidirng memeli hücrelerinde DNA replikasyonu korumak için.

Kantitatif histon asetilasyonu ve DNA replikasyonu sırasında doğmakta olan DNA ile ilişkili SMARCA5 kromatin Remodeler miktarını ölçmek için, bir modifiye ChIP tahlil BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği denilen geliştirmiştir. Bir yarık kullanılarak zar üzerine arzu edilen bir protein ya da histon modifikasyonu kromatin, immüno-çökeltme (chip) takiben, henüz olgunlaşmamış DNA miktarı BrdU etiketli yonga DNA batı analizi kullanılarak tespit edilebilir çips numunesi olarak (timidin analoğu BrdU ile işaretlenmiş) transfer Leke aygıt. Bu tekniği kullanarak, H4K16ac (kromatin paket yer alan bir marka) ve ISWI aile üyesi SMARCA5 (kromatin SWI / SNF ilişkili matris ile ilişkili aktin bağımlı regülatör) kromatin remodeler S-fazı hücrelerinde doğmakta olan DNA ile ilişkili olduğunu göstermiştir ^6. Biz de doğmakta olan H4K16ac işareti DNA replikasyonu sırasında ⁶ HDAC1,2 tarafından deasetile olduğunu gördük. H4K16ac inhibeISWI aile üyesi SMARCA5 ¹² kromatin remodeler aktivitesi. Bu nedenle, BrdU-CHIP-Slot-Batı tekniği kullanılarak, DNA replikasyonu sırasında kromatin remodeling düzenlenmesinde HDAC1,2 işlevlerini bağlayabilirsiniz. Bu nedenle, BrdU-çip-Slot Blot tekniği kantitatif oluşmakta olan DNA'ya bağlanan proteinlerin ya da bunların post-translasyonel modifikasyonlar, birleşme ve ayrılma dinamiklerini ölçmek için güçlü bir yaklaşım.

Protokol

BrdU Etiketleme aşağıdaki 1. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP)

1. DMSO veya HDAC1,2 seçici önleyicileri, ya mevcudiyetinde kültür NIH3T3 hücreleri, daha önce tarif edildiği ^{gibi, 6.}
2. DMSO veya HDAC1,2 seçici inhibitörler ile işlendikten sonra, steril doku kültürü kaputu hücrelere BrdU ekleyin. Steril 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içinde 60 dakika için bromodeoksiüridin bir 20 uM nihai konsantrasyon (BrdU) ile 10 mi NIH3T3 ortamda kaplanmıştır 2 x 10 ^6, NIH3T3 hücreleri inkübe edin.
3. % 1 bir son konsantrasyonda kültür ortamına doğrudan formaldehid eklenerek DNA çapraz bağ hücre içi proteinlerdir. Bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığında formaldehid ile 2 x 10 ⁶ NIH3T3 hücreleri inkübe edin.
4. 125 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar glisinin eklenmesi ile çapraz bağlanma Quench. Bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
5. Ortamı çıkarın ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne PBS içinde hücreleri toplamak. Spin cel4 ° C'de 5 dakika boyunca 956 x g'de ls. Buz soğukluğunda PBS ile iki kez hücre pelletini yıkayın. Tüp PBS çıkarın. Kullanılana kadar -80 ° C'de PBS (süpernatant) olmadan çapraz bağlanmış hücre pelletini saklayın.
6. 500 ul FA140 tamponu eklenerek çapraz bağlanmış hücre topağından lizat hazırlanması (50 HEPES KOH mM pH 7.5, NaCl 140 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat) proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiştir.
7. Numuneleri% 35 güçte ve 15 sn darbesi ile beş kez, 0.9 sn ve 0,1 sn kapalı ayarı sonicating ile kromatin Kayma. Numunelerin ısınmasını önlemek için sonication her turdan sonra buz üzerinde tüpler tutun.
   1. Farklı sonicators arasında değişecektir kesme verimliliği gibi bir DNA jel üzerinde kesme kontrol edin. Sonikasyon kontrol etmek için, 0.16 M 'lik bir konsantrasyon NaCI eklenerek çapraz bağ ve ters adımları 1.17.1 gerçekleştirin. - 1.22. Run kesme olup olmadığını kontrol etmek için% 1.5 agaroz jel üzerinde 10 ul DNA yıkandı500 bp ortalama bir yoğunlukta bp 700-300 arasında.
8. 4 ° C'de 17.949 x g'de 10 dakika süre ile sonikasyon santrifüj örnekleri takip eder ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın.
   1. Imalatçının protokolüne göre, ticari protein tahlil kiti kullanılarak protein tahmin gerçekleştirin. Deney ve kontrol örneklerinin ChIP için lizatın eşit miktarda kullanın. Genellikle, ChIP reaksiyon başına toplam lizatın 1 mg kullanın.
9. Proteaz inhibitörü kokteyli içeren FA140 tamponu kullanılarak protein A-agaroz% 50 bulamaç hazırlanır. Proteaz inhibitör kokteyli 1/10 hacim. Toplam numune sayısına göre gerekli boncuk hacmini hesaplayın.
   1. FA140 tamponu ile yıkayın Protein A-agaroz taneleri iki depolama tamponunu çıkarın ve% 50 bulamaç yapmak için tanelere FA140 tamponuna eşit hacmi ekleyin.
   2. , Spesifik olmayan boncuklara bağlanan proteinler kaldırmak Protein A-agaroz ve% 50 bulamaç 50 ul için30 dakika boyunca bir mikser içinde rotisserie sabit ucu-üzerinde uca döndürülerek 4 ° C'de örnekleri cubate.
10. Bir dakika boyunca 4 ° C'de 956 x g'de örnekleri dönerler. Süpernatant toplayın ve 8 ul H4K16ac antikor veya süpernatana 1 mg / ml SMARCA5 antikorun 5 ul (5 ug) ya da eklenmesi ile imüno gerçekleştirin. Bir et lokantası mikserde sabit uç-over-end rotasyon ile 4 ° CO / N inkübe edin.
11. 'Giriş' kontrol için ekstraktı 1 / 10th kaydedin ve kenara -20 ° C'de ayarlayın. Giriş IP örnekleri ile birlikte çapraz bağlanmış ters olması gerekmektedir.
12. Negatif kontrol numunesi olarak immüno-tavşan IgG eşit miktarda (1 mg / ml 5 ul) kullanın.
13. Ertesi gün, ekstraktı% 50 protein A-agaroz bulamacın 50 ul ve rotasyon ile 4 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe edilir.
14. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 956 x g'de santrifüj ile agaroz boncuklar Pelet, dikkatli bir şekilde süpernatan ve wa kaldırmaardışık olarak, aşağıdaki tampon maddeleri ile boncuk sh. Tampon hazırlıkları ise, sağ kullanımdan önce proteaz inhibitörleri ekleyin.
    1. Düşük Tuz İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ile yıkanır (FA140 pH 7.5 HEPES KOH 50 mM nihai konsantrasyona NaCl 140 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat içinde) için sonu aşırı uç rotasyon ile 4 ° C 'de 5 dak.
    2. Yüksek tuz İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ile yıkanır (FA500 pH 7.5 HEPES KOH 50 mM nihai konsantrasyona NaCl 500 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat içinde) için sonu aşırı uç rotasyon ile 4 ° C 'de 5 dak.
    3. LiCİ İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ucu-üzerinde uç rotasyon ile 4 ° C 'de 5 dakika süre ile (Tris-Cl pH 8.0, LiCI 250 mM,% 0.5 NP-40 ve% 0.5 sodyum deoksikolat, 10 mM nihai konsantrasyon) ile yıkayın.
15. Yukarıda tarif edildiği gibi yıkama sonrasında, 200 ul yıkama çözeltisi ve incubat (% 1 SDS ve 100 mM sodyum bikarbonat nihai konsantrasyon) ekleyinoda sıcaklığında ucu-üzerinde uç rotasyon ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ör.
16. Oda sıcaklığında 956 xg'de örnekleri Spin ve yeni bir 1.5 ml'lik tübe eluat aktarın. Ek 200 ul yıkama solüsyonu ile adımı yineleyin 1.15.
17. Taşıma ürününden 400 ul için, 0.16 M 'lik bir konsantrasyon NaCI ekleyin ve iyice karıştırın.
    1. Buna ek olarak, bir kenara bırakıldı 10 ul girişi (adım 1,11) 400 ul yıkama çözeltisi eklenmekte ve hem de çapraz giriş örnekleri ters 0.16 M'lik bir konsantrasyona kadar NaCl ilave edin. 5 saat boyunca 65 ° C su banyosu içinde inkübe edilerek örnekleri çapraz bağlanması ters.
18. Ters-çapraz bağlanmış, ayrılmış malzeme% 100 EtOH 1 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve 2 için -80 ° C'de inkübe - 3 saat ya da -20 ° CO / N oranında. 15 dakika boyunca 17.949 x g'de örnekleri Spin ve etanol atın.
19. Pelet yıkamak için 800 ul% 70 etanol ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17.949 x g'de Spin ve etanol atın. Herhangi bir kalıntı etanol çıkarmak için kısaca Spin. 1 için 37 ° C 'de numuneler hava-kurutun0 dakika geriye kalan etanolü atmak üzere.
20. 90 ul RNase DNA ve DNaz serbest su içinde çözülür ve 0.2 mg / ml nihai konsantrasyonda 2 ul 10 mg / ml RNase ekleyin. 30 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C'de inkübe edin.
21. 10 ul 10x Proteinaz K tamponu (100 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM EDTA, pH 8.0,% 5 SDS) eklenir. İyice karıştırın ve 1 saat süre ile 42 ° C 'de 1 ul Proteinaz K inkübe ekleyin.
22. Imalatçının protokolüne göre, ticari PCR saflaştırma kiti kullanılarak giriş ve yonga DNA saflaştınlır ve 50 ul su içinde elüt DNA. Sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın DNA arasında değişir.

2. Yuva yonga DNA bölgesinin Leke Analizi

1. 280 değerinde bir spektrofotometre kullanılarak mil üreticinin protokolüne göre aşama 1,22 tarif edildiği gibi 50 ul su içinde elüt giriş ve yonga DNA verimini ölçün.
2. Algılama lineer aralığında olan giriş eşit hacimlerde (50 | il) veya immünopresipitasyon DNA al.
   1. Örneğin, eğer girişDNA verimi 1.5 ng / ml, daha sonra (toplam DNA ng veya 45) 30 ul almak ve su ile 50 ul hacmi hale getirilmesidir. Faktör ChIP için Adım 2.1 tamamını 50 ul eluat alıp 2.3 adıma geçin.
3. 0.4 N NaOH, kısa bir süre vorteks ve 10 saniye boyunca 956 x g'de santrifüj 2.5 hacmi eklenerek 50 ul giriş veya immünopresipitasyon DNA'yı denatüre ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
4. 10 sn için 956 x g'de 1 M Tris-HCl, 175 ul, pH 6.8, girdap, santrifüj eklenerek denatüre DNA nötralize ve buz üzerinde örnekleri yer.
5. Aşağıda tarif edildiği gibi Slot Blot analizi için bir giriş seri dilüsyonu ve immünopresipitasyon DNA hazırlayın.
   1. Adımları 2.3 takip - 350 ul toplam numune hacmi elde etmek için 2.4 (örneğin, 50 ul giriş / yonga DNA, 125 ul 0.4 N NaOH, 175 ul 1 M Tris-HCI, pH 6.8).
      Not: Yukarıda belirtilen örnek için, giriş DNA 45 ng 0.129 ng / ml olarak sona erecek.
   2. Giriş DNA, üç tüp etikets, 100, 50 ve 25 ve 100 ul, 50 ul ve denatüre edilmiş DNA, ve nötralize örnek 25 ul olarak. Nükleaz içermeyen su ile 100 ul son hacim sağlayın. ChIP DNA, etiket 200, 100 ve 50 ve 200 ul ekleyin üç tüp, 100 ul ve denatüre ve nötralize DNA örneği 50 ul. Nukleaz ücretsiz su ile 200 ul son hacim yapın.
6. Slot Blot düzeneğinin büyüklüğüne zar kesilir. Önce 20x SSC içinde membran ve kurutma kağıtları Öncesi ıslak ve DNA eklemeden önce. Üreticinin protokolüne uygun olarak slot blot cihazının içine monte edin.
7. Uygun yuvalara adım 2.5.2 den Pipetleyin DNA. Zeta-prob zar üzerine DNA çekmek için yavaşça vakum uygulayın. Tüm numuneler aparatı sayesinde geçtikten sonra vakum durdurun.
   1. Aparat sökün ve hemen UV çapraz bağlayıcı kullanılarak zar üzerine DNA hareketsiz. UV çapraz bağlayıcı DNA tarafı yukarı ve au kullanınçapraz bağlayıcı ayarı tocrosslink. Üreticinin protokolü takip edin.
8. Batı blotting gerçekleştirerek yuvası leke üzerinde BrdU Algılama.
   1. PBS içinde yağsız kuru süt,% 5 zara antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek üzere, oda sıcaklığında 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (PBST) içeren bir membran bloke.
   2. Birincil anti-BrdU antikoru (1: 500 seyreltme) ilave PBST içinde% 1 yağsız kuru süt içinde seyreltilir ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 3 saat primer antikor ile leke inkübe edin. Primer antikor inkübasyondan sonra PBST ile üç kez membran yıkayın.
   3. Blot HRP-konjuge anti-fare ikincil antikor ekleyin (1: 5000 seyreltme) ile, 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. İkincil antikor inkübasyondan sonra PBST ile üç kez membran yıkayın.
      NOT: Tamamen birincil ve ikincil antikor inkubasyon sırasında membran kapsayacak antikorların yeterli hacim kullanın.
9. ECL karışımı hazırlayın ve leke ac eklemeküreticinin protokolüne kordlardan seçilir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ECL karışımı ile membran inkübe edin.
   1. , Bir X-ışını kasetine membran yerleştirin X-ışını filmine maruz membranı ve üretici protokolü kullanılarak leke gelişir.
   2. Üreticinin protokolüne göre, Resim J yazılımı kullanılarak blot tarama sonra giriş ve chiped DNA için elde edilen sinyal, sayısal olarak. Nicelendirilmesi için, ölçüm doğruluğunu sağlamak amacıyla tespit doğrusal aralığı içindedir sinyali kullanılır.

Sonuçlar

HDAC1,2 seçici önleyicileri özgüllüğünü belirlemek için, Hdac1,2 ^{FL / FL} ve HDAC3 ^{FL / FL} fibrosarkom hücreleri kullanıldı. Adenovirüs içeren Cre rekombinaz (Cre Ad-) bu hücrelerde Hdac1,2 ve HDAC3 silmek için kullanılmıştır. Hdac1,2 ^{FL / FL} ardından Ad-Cre enfeksiyonu Hücreler, H4K5ac sağlam bir artış gözlenmiştir. 233 ya da 898 ile Hdac1,2 knockout hücre tedavisi 233 ve 898, bu ...

Tartışma

Bu yazıda tarif edilen protokol, yeni çoğaltılmış ya da doğan DNA protein veya translasyon sonrası modifiye edilmiş formları varlığını göstermek için nispeten hızlı bir yöntemidir. Buna ek olarak, bu teknik, bir protein ya da doğan DNA ile değiştirilmiş bir biçiminin bağlanma-ayrılma kinetikleri ölçmek için bir olanak sağlamaktadır. Bu teknik zarif iPOND teknolojisi ¹³ tamamlayıcıdır. IPOND teknolojisinde, yeni sentezlenmiş DNA, etil deoksiüridin (edu) ile etiketlenir. Bir biyotin konjuge sonra tıklama kimyas...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-BrdU (westernler)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Aktif Motif	39167
Zeta-Probe GT Membran	Bio-Rad	162-0197
Formaldehit	Fisher	BP531-500
Protein A agaroz	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinaz K	Sigma	P4850
PCR Saflaştırma Kiti	Qiagen	28106
Glisin	Sigma	G7403
Proteaz inhibitörü kokteyli	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Tavşan IgG & nbsp;	Kırlangıç	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Şirketi	19628
Sodyum deoksikolat	Sigma	D6750
Sodyum bikarbonat	Sigma	S-4019
Etanol	Decon Laboratuvarları	04-355-222
DEPC ile arıtılmış su	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodyum hidroksit	Mallinckrodt GenAR ve nbsp;	MAL7772-06
20x SSC	Yaşam Teknolojileri	15557-036
Yağsız kuru süt	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ışını filmi	Genesee Sci	30-101
Geliştirici	Konica Minolta	SRX-101A
UV Çapraz Bağlayıcı	Stratagene	XLE-1000
Sonikatör	Branson Sonifier  Dijital Ultrasonik Hücre Bozucu	Model: 450
Santrifüj	Eppendorf	Model: 5810R
Su banyosu	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spektrofotometre	ThermoScientific	Model: 1000
Yuva Leke aparatı	Schleicher ve Schuell Minifold II	44-27570
Doku Kültürü İnkübatörü	Thermo Scientific	Series II 3110 Su Ceketli CO2 İnkübatörleri