Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

10.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53673

⸱

26 Şubat 2016

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

Bu makalede

Özet

Supraspinal projeksiyonlar ağrı algısı ve diğer davranışlar için önemlidir ve serotonerjik lifler bu lif sistemlerinden biridir. Bu çalışma, bu serotonerjik liflerin sonlandırılmasını araştırmak için kombine CLARITY/CUBIC protokolünün fare omuriliğine uygulanmasına odaklanmıştır.

Özet

omuriliğe uzun inen lifler lokomosyon, ağrının algılanması ve diğer davranışları için çok önemlidir. Bu lif sistemlerinin çoğunluğunun omurilik fiber sonlandırma desen iyice herhangi türde araştırılmamıştır. omurilik proje serotonerjik lifler, histolojik bölümlerde sıçanlar ve opossum incelenmiştir ve fonksiyonel önemi omurilikte kendi fiber sonlandırma desen çıkarılabilir dayanmaktadır. CLARITY ve KÜBİK tekniklerinin gelişmesiyle birlikte, lif sistemi ve serotonerjik supraspinal yolların önceden bilinmeyen özelliklerini ortaya çıkarmak için büyük olasılıkla omurilik dağıtımını, araştırmak mümkündür. Burada, kombine açıklık ve KÜP teknikleri kullanarak fare omurilik serotonerjik lifler görüntüleme için ayrıntılı bir protokol sağlar. yöntem combin ile doku hidrojel solüsyonu ve aydınlatılması ile bir fare perfüzyon gerektirirreaktifler temizleme tirme. Omurilik dokusu hemen altında iki hafta içinde temizlendi ve serotonin karşı sonraki immunofluorescent boyama az on gün içinde tamamlanmıştır. Bir çoklu foton floresan mikroskop ile, doku taranmış ve bir 3D görüntü OsiriX yazılımı kullanılarak yeniden inşa edildi.

Giriş

Supraspinal projeksiyonlar, ağrı algısı gibi çeşitli davranışların modülasyonundan sorumludur. Nosiseptif bilgi taşıyan projeksiyonlardan biri, arka beyin rafesinden ve bitişik retiküler çekirdeklerden1,2 kaynaklanan serotoninerjik lifler içerir. Fizyolojik ve farmakolojik çalışmalar, arka beyindeki raphe çekirdeklerinin elektriksel stimülasyonundan sonra omuriliğin dorsal boynuzunda serotonin salınımının arttığını göstermiştir3-5. Sıçan ve keseli sıçanda, serotonerjik raphespinal lifler sadece dorsal boynuz6-8'de değil, aynı zamanda ara bölge7,9,10, ventral boynuz7,11 ve hatta lamina 1012,13'te de yoğun terminallere sahiptir. Farede benzer bir çalışma yoktur. Bu çalışma, fare omuriliğindeki arka beyin raphe çekirdeklerinden ve bunların bitişik retiküler çekirdeklerinden kaynaklanan serotonerjik liflerin sonlandırma paternini, yakın zamanda yayınlanan CLARITY14 yöntemi ve modifikasyonu olan CUBIC15 kullanarak haritalamayı amaçladı.

Omuriliğin konvansiyonel floresan veya peroksidaz immünohistokimyası, omuriliğin gri cevherindeki serotonerjik liflerin 30-40 μm kalınlığındaki kesitlerdeki dağılımını açıkça göstermektedir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, beyaz maddedeki serotonerjik lif yollarının ve gri maddedeki teminatlarının sürekliliğini göstermez. Histolojik kesitlerin 3 boyutlu rekonstrüksiyonu, lif yolları hakkındaki bilgimizi ilerletmiş olsa da, histologlar ve anatomistler için dokuda kesmenin neden olduğu küçük bozulmalar nedeniyle tek bir yolu takip etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu engeli aşmak için, bir dizi araştırmacı tüm doku yapısını şeffaf hale getirmek ve değiştirilmemiş dokunun görüntüsünü tek bir video dosyasında toplamak için çeşitli protokoller geliştirmiştir17-21. Şimdiye kadar, Deisseroth'un grubu14,15 tarafından geliştirilen berrak, lipid değişimli, akrilamid hibritleştirilmiş sert, görüntüleme/immün boyama uyumlu, doku hidrojeli (CLARITY) tekniği ve Susaki ve ark.16 tarafından geliştirilen CUBIC en başarılı olanlardır. Protokollerin yayınlanmasından bu yana, birçok araştırmacı bu teknikleri sadece beyin22-25 değil, aynı zamanda kalp, böbrekler, bağırsak ve akciğerler26,27 dahil olmak üzere biyolojik dokuların çeşitli yönlerini araştırmak için kullanmaya başlamıştır.

Fare omuriliğini hidrojel solüsyonu (CLARITY) ile sabitleyerek ve CUBIC reaktifleri ile temizleyerek (bu, orijinal CLARITY protokolü14,15 tarafından tarif edilenden çok daha hızlı bir yöntemdir), 2-3 mm uzunluğunda bir omurilik dokusu bloğu iki hafta içinde temizlendi ve serotonin için immünofloresan boyama sekiz gün içinde tamamlandı. Sadece kimyasal ajanların bir kombinasyonu ile konvansiyonel immünohistokimya, yaklaşık bir ay içinde bir 3D video dosyasında tek tek lif yollarının bir görüntüsünü oluşturmak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri tüm işlemler (onaylı ACEC numarası 14 / 94A ise) New South Wales Üniversitesi'nde Hayvan Bakım ve Etik Komitesi (ACEC) yönergeleri izleyin.

Şeffaf Fare Omurilik 1. Hazırlık

  1. Buz Hidrojel Çözüm hazırlanması
    1. % 16 paraformaldehit solüsyonunun hazırlanması (PFA)
      1. 70 ml önceden ısıtılmış damıtılmış su (50-55 ° C) içine 16 g paraformaldehit tozu eklenir ve paraformaldehit çözünene kadar ısıtılmış bir manyetik karıştırıcı üzerinde karıştırılmıştır. Not: çözüm üzerinde 55 ° C ısı ve paraformaldehit zehirli olduğunu unutmayın izin vermeyin.
      2. bir silindir paraformaldehit çözeltisini ve 100 ml damıtılmış su ilave edilir. 4 ° C buzdolabı kullanarak paraformaldehit çözümü soğutun.
    2. su distile 26.25 ml 125 mg VA-044 başlatıcı eritin ve 4 çözümü serinC buzdolabı °.
    3. Serin 5 mi akrilamid çözeltisi (% 40), 1.25 ml bis çözeltisi (% 2) (DİKKAT: Bis ve akrilamid çözeltiler genetik bozukluklar veya kanser neden olabilir, toksik), 5 mi 10x PBS, 12.5 mi% 16 PFA çözeltisi ve buz üzerinde VA-044 başlatıcı çözeltisi.
    4. buz üzerinde yukarıdaki çözümler karıştırın.
      Not: toplam hacim 50 ml.
  2. Fare Omurilik Perfüzyon ve Koleksiyon
    1. % 0.9 normal serum fizyolojik içinde seyreltildi ketamin (80 mg / kg) ve xyzaline (5 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezi uygulayın. Fare dozaj fareler için daha düşük olabilir.
    2. Fare ayak derisine bir tutam yanıt vermiyor bir kez davlumbaz uygun bir plastik yüzeyde, (yapışkan bant etkilidir) vücuttan uzak fare uzuvlarını düzeltmek.
    3. göğüs üzerine fare deri kesme ve daha sonra kemik göğüs makas ile kalp maruz.
    4. 25 G iğne th bağlanmış olan, bir peristaltik pompa kullanılarakboru e ucu, kalbin sol ventrikül içine iğneyi yaklaşık olarak 10 ml / dk bir oranda kan için bir çıkış noktası ve daha sonra 40 ml% 0.9 normal serum fizyolojik ile yıkanarak başlatmak için sağ atrium makasla kesme.
    5. Tamamlandığında, 35 ml buzlu soğuk hidrojel solüsyonu ile fare serpmek.
      Not: 10 ml'lik bir hızda serpmek / dakika sinir dokusunun şişmesini önlemek için.
    6. Bir bıçak ile arka üzerindeki deriyi insizyon ve daha sonra omurgalı yanındaki kasları kaldırın. Bir tarafta vertebra kemerler kesme ve diğer tarafa, onları saygısız sonra, ince bir makas ile vertebral kolonun dışına omurilik alır.
  3. Fare Omurilik Takas
    1. gece boyunca 4 ° C 'de hidrojel çözeltisi 15 ml omurilik yerleştirin.
    2. Hidrojel çözeltisi 10 ml çıkarın ve 5 ml tüp omurilik segmentleri ile çözeltinin geri kalanı dökün. tamamen dolana kadar hidrojel çözeltisi ile 5 ml tüp doldurun.
    3. 5 ml tüp üstünden parafilm küçük bir parça gerin ve sonra tüpün boynuna parafilm sarın. Not: parafilm kontaklar hidrojel çözümü sağlayın ve hidrojel çözüm ve parafilm arasında hiçbir kabarcıkları vardır.
    4. 37 5 ml tüp koymak   ° C fırın gece boyunca karıştırılmıştır. Bir jel olana dek hidrojel çözümü gözlemleyin.
    5. fırın dışına 5 ml tüpü alın ve (örneğin bir shoveled 1 ml'lik pipet gibi) bir anahtarla tüpten jel çıkarın. jele kaba doku yapışmasını tarafından omurilik dokusu jel çıkarın ve sonra (jel dokusuna sadık olacaktır ve bu nedenle doku tarafından silinecektir) uzakta kaba doku alır.
    6. omurilik dokusu jelin çıkarılmasından sonra, bir çalkalayıcı üzerinde 24 saat boyunca 1 x PBS (pH 7.4) ile Omurilik 4 kez yıkayın.
    7. 3.85 gr üre ve 3.85 g N, N, N ', N'-tetrakis- (2-hidroksipropil), etilendiamintetraasetat eritilmesi kübik temizleme çözeltisi hazırlayın5.38 ml ine damıtılmış su.
      Not: Bir sıcak karıştırıcı kullanılır. açık ve oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra solüsyona 2.31 g polietilen glikol mono-p-isooctylphenyl eter / Triton X-100 ilave edin.
      Not: Bu, üç kimyasal 10 g bir fare için geçerlidir.
    8. bir jilet ile 2-3 mm uzunluğunda bölümler halinde koronal fare omurilik kesin ve yukarıda KÜP temizleme çözeltisi, 5 ml içine koydu. 37 ° C'de bir fırında, bir karıştırıcı üzerine yerleştirin   3 gün boyunca ° C.
    9. Üç gün sonra, yeni bir birine takas çözümü değiştirin. Not: Yukarıdaki çözelti, kullanımdan önce hazırlanmıştır.
    10. İki üç gün sonra KÜBİK takas çözümü ferahlatıcı sonra, yazı 8 harflerle bir kağıda karşı doku şeffaflık kontrol edin. şeffaf ise, harfler temizlenir doku yoluyla görülebilir. (% 0.1 Triton-X100) Doku günde 4 kez (her 6 saatte bir) yıkamak için temizleme çözeltisini çıkarın ve PBST 4 ml.

2. immünofloresan Boyama

  1. 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde 3 gün: Primer antikor solüsyonu omurilik segmentleri inkübe (PBST içinde 100, anti-serotonin, tavşan içinde yetiştirilmiş, 1 seyreltilmiş).
  2. Antikor çözeltisi çıkarın ve PBST 4 ml (% 0.1 Triton-X100) 37 ° C bir fırında spinal kord günde 4 kez (her 6 saat) yıkayın.
  3. 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde, 3 gün boyunca doku inkübe etmek: PBST solüsyonu çıkarın ve ikincil antikor solüsyonu (PBST içinde 100 594 konjuge keçi anti-tavşan IgG, 1 seyreltilmiş).
  4. ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde günde spinal kord 4 kez yıkama (her 6 saatte bir) PBST 4 ml. Ertesi gün doku görüntüleme için hazırdır.

3. Görüntüleme

  1. PBST solüsyonu çıkartın ve doku kırılma indeksi yapmak için% 85 gliserol 4 ml.
  2. doku netlik kontrol edin. yaklaşık 1 saat açık olduğunda, çoklu fotoğraf floresan mikroskop tutma çerçevesini uyan bir büyük, ince cam slayt üzerine doku koydu.
  3. Omurilik dokusu yanında% 85 gliserol birkaç damla koyun ve bir 22 x 50 mm, 2 lamel camının ile lamel.
    Not: omurilik oryantasyon görüntü benziyor nasıl karar verir.
  4. çoklu foton floresan mikroskop tutma çerçevesi üzerine cam slayt koyun ve hafif yolun içine doku taşıyın.
  5. Helyum Neon lazer hattı 594 nm seçin ve canlı görüntüde olumlu bir sinyal parlaklığını kontrol ederek optimum seviyeye lazer yoğunluğunu ayarlayın.
  6. (Suda, NA 0.7) 20X objektif kullanılarak omurilik dokusu tarama alanı seçin ve z-yığını oluşturmak için hazırlamak, ve 3 mikron ayarlanmış her adımda derinliği.
  7. 20X objec altında z yığının alt üst doku tarayıntif ve (yağda, NA 1.4) sonra 63X objektif sırasıyla (adım büyüklüğü 1 mikron idi). 3D yazılımını 28 kullanarak 3D videoları yeniden yapılandırma.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu bölüm, açıklık ve KÜP protokollerin bir kombinasyonu kullanılarak şeffaf bir fare omurilik serotonin antikor boyama sonuçlarını gösterir. Biz (aynı zamanda Video 1 bakınız Şekil 1) serotonerjik lifler ventral boynuz ventral kısmında üstünlüğü ile omuriliğin tüm lamina mevcut olduğunu göstermektedir. kontrol doku pozitif lifler (sonuç gösterilen değil) yoktu. Ventral boynuz olarak, yoğun dolu serotonerjik lifler ventral boynuz ventromedial kısmında bul...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

protokol kombine CLARITY ve KÜP teknikleri ile fare omurilik görüntü serotonerjik lifleri nasıl gösterir nitelendirdi. Bu Cheung vd. 14 ve TÖMER'ler ve ark., 15 tarafından geliştirilen pasif temizleme protokolüne göre daha hızlı bir temizleme işlemi sunar ve omurilik dokusu de temizleme esnasında hidrojel tarafından desteklenmesi sağlar.

Cheung ve ark., 14 ve Tomer ark. 15 tarafından bildirilen fare omurilik ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, bir NHMRC proje hibesi (#1086643) olan Avustralya Araştırma Konseyi Bütünleştirici Beyin Fonksiyonu Mükemmeliyet Merkezi (ARC Center Grant CE140100007) tarafından desteklenmiştir. Prof. George Paxinos, Kıdemli Baş Araştırma Görevlisi NHMRC hibesi (#1043626) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Foto başlatıcı VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
%40 akrilamid çözeltisiBio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
%2 Bis çözeltisiBio Rad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehitSigma158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
üreMerck Millipore66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiaminMerck Millipore821940http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N, N, N', N'-tetra-2-propanol, MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sakarozSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
serotonin antikoruMerck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
keçi anti tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor & reg; 594 konjugeLife Technologies  A-11012https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
çoklu foton mikroskobuLeicaLeica TCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

Kaynaklar

  1. Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
  2. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  3. Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).
  4. Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).
  5. Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).
  6. Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).
  7. Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).
  8. Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).
  9. Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).
  10. Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).
  11. Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).
  12. Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).
  13. Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  15. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  16. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  17. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  18. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  19. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  21. Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  22. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).
  23. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
  24. Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).
  25. Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  26. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781(2015).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  28. Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CLARITY Tekni iDoku effafla t rmamm nofloresan Boyamaok Fotonlu Mikroskopi3B G r nt Rekonstr ksiyonuHidrojel Perf zyonuAntikor Boyama
Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.