Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu

9.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53691

⸱

31 Ocak 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Surgery, University of Texas Medical Branch, 2Internal Medicine, University of Texas Medical Branch, 3Molecular Genetics and Microbiology, University of New Mexico

Bu makalede

Özet

Burada, MF fenotipine sahip donmuş mide, ince bağırsak ve kolon dokusu oluşum hücrelerinden primer fibroblast/miyofibroblast (MF) kültürlerinin izole edilmesi ve oluşturulması için bir protokol sunulmaktadır. Bu hücreler CD90, α-SMA ve vimentin eksprese eder. MF'ler, enzimatik aktivite ve sitokin üretimi dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel testler için kullanılabilir.

Özet

Fibroblastlar / miyofibroblastlar (MFS) patogenezinde rolleri ve tümör mikro hem yara iyileşmesi ve promosyon katkıları için artan ilgi kazanmaktadır. Şu anda mide-bağırsak (GI) dokulardan MFS izolasyonu için bir çok teknik vardır, ancak bu protokol, dondurulmuş dokudan bu stromal hücrelerin izolasyonu için yeni bir elemanı getirmektedir. GI doku örneklerinin Donma sadece dünya işbirlikçileri, biyobankalar ve ticari satıcılardan örnekleri elde etmek için araştırmacı, aynı zamanda taze örneklerin gecikmeli işleme izin verir. Açıklanan protokol sürekli belirteçleri CD90, α-SMA ve vimentin ifade MF fenotip ile karakteristik iğ şekilli hücreler verecektir. Bu hücreler, hasta örneklerinden türetilmiş olarak, pil kullanımı aynı zamanda hastalık durumlarında-, yani kanser ve enflamatuar barsak hastalıkları arasından yakın taklit MFS'de yararı kazandırmaktadır. Bu teknik arı vardırn mide, ince bağırsak, kolon ve MF primer kültür nesil valide. Birincil MF kültürleri pasaj bir dizi üzerinden deney geniş bir dizi de kullanılabilir ve bunların saflığı hem immünositokimya değerlendirilmiş ve akış sitometri analizine.

Giriş

Miyofibroblastlar / fibroblastlar (MFS), gastrointestinal (Gİ) mukoza hücrelerinin bol nüfusu temsil etmektedir. Bu stromal hücreler sadece epiteli altında bulunan ve bağırsaktaki mukozal lamina propria içinde birbirine bir ağ oluştururlar. MFS olmayan hücre dışı matrisin birikmesine sadece sorumludur, ancak parakrin düzenleme içinden geçen bitişik epitel 1, 2 elektrolit taşıma, iadesini ve bariyer işlevini etkileyebilir. Dahası, MFS enflamasyon ve doku önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir 3, 4 biçimlenme. miyofibroblastlar onlar da kanserle ilişkili fibroblastlar olarak bilinir tümör mikro, kritik bir parçası olan ve tümör hücre büyümesine katkı ve kanser kök hücreleri 3 için niş olarak hizmet vermektedir. Ortaya çıkan veriler, MFS ayrıca yerel antijen sunan hücreler hizmet olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, MFS işlevi doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerinin önemli düzenleyiciler, süredensitokinler ve büyüme faktörleri 5 çeşitli dans ediyorum.

Sağlıklı bireylerde, MFS hücreleri Bu hücreler aynı zamanda vimentin için pozitif. Mezenkimal kök hücrelerinden ayırt ve hücre yüzeyinde, mezenkimal marker, CD90 3, 5 tarihinde ifade inanılmaktadır, ancak epitelyal ve hematopoetik hücre belirteci, EpCAM ve CD45 negatif sırasıyla. Miyofibroblastların fibroblastlar aktive edilmiş bir şekli olması önerilmektedir ve α-SMA 5 ifadesi ile aktif olmayan fibroblastlardan ayırt edilebilir.

Geçtiğimiz on yıl içinde, insan kolon mukozasının gelen miyofibroblastlar izolasyonu için birden yaklaşımlar yayınlanan-çoğunlukla başlangıçta Mahida ve ark., 5-8 açıklanan yönteme dayalı olarak oylandı. Bireysel çalışmalar, çeşitli bağırsak mukozasında, çoklu gastrointestinal alanlar (yani, mide, küçük ve l'den MFS izolasyonu için hiçbir evrensel protokolü izolasyon prosedürleri rapor ederkenARGE intestinal mukoza) yayınlanmıştır. Bu tarifnamede sunulan protokol test edilmiş ve başarılı bir şekilde, yukarıda belirtilen dokuların her üç tip kullanılmaktadır. . Ayrıca, dondurulmuş GI mukozasından MF oranı pratisyen izole edilmesi için prosedürlerin rapor edilmemiştir.

Burada, enzimatik sindirimi dayalı optimize edilmiş bir yöntem sunmak ve aynı zamanda kültür için insan bağırsak mukozal MFS izolasyonu sağlar ve taze sindirilmiş, tek hücre, mukozal hazırlıkları analiz akım sitometri. Bu teknik, güvenilir bir şekilde bir MF fenotipi olan primer kültürleri elde edilir. Bundan başka, aynı yöntemler yanı sıra, mide ve ince bağırsak dokularının dondurulmuş örneklerden MF oranı pratisyen izole etmek için kullanılabilir. Taze GI dokusundan rolü in izole edilmesi, daha önce tarif edilmiştir; Bununla birlikte, dondurulmuş örneklerin kullanımı birçok avantaj sunar. Yani, araştırmacılar capabi sahip dünya çapında işbirlikçileri herhangi bir sayıda toplamak ve depolamak dokuları mümkün olacaktırlity dondurulmuş doku örnekleri gemi. Ayrıca, araştırmacılar, mevcut deney programı ile çatışmaya izolasyon doku işleme ameliyathane ve / veya endoskopi paketi ve acil atılır doku toplama bulabilirsiniz. Ayrıca, cerrahi öngörülemeyen doğası nedeniyle, doku tedarik işleme doku için kalan süre sınırı, hangi çok geç gün oluşabilir. Daha sonra işlenmek için doku Donma bu zorlukları hafifleten.

Son olarak, bu yöntemler, başarılı şekilde kolorektal karsinom ve iltihaplı bağırsak hastalıkları gibi hastalık durumlarında, kolon, mide ve ince bağırsak rolü in izolasyon kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Atılan insan cerrahi hastaların doku ve primer kültürlerinde kurulmasını elde etmek için protokol Texas Medical Branch ve New Mexico Kurumsal İnceleme Kurulları Üniversitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. İnsan doku örneklerinin alımı için genel şartlar aşağıda açıklanmıştır. MFS donmuş dokunun, biyobankalar ve ticari satıcılardan izole edilebilir çünkü bu da uygun bir seçenek olduğuna dikkat edin.

1. İnsan Dokusu edinin

  1. Onay için kurumsal inceleme kuruluna insan kolon dokusu elde etmek için bir protokol gönderin.
  2. Araştırma için insan dokusu elde etmek amacıyla, genel cerrahlar ve / veya kolorektal cerrah ile işbirliği kurmak. Onlar tanı için gerekli değildir ve araştırma için belirlenmiş olabilir doku belirleyici olacak gibi patoloji bölümü ile işbirliği de zorunludur.
  3. Grossl sonra neoplazma doku sağlamak ve patolog önerintümörden y, normal mukoza en az 5 cm. Hemen buz soğukluğunda yıkama ortamı örnekleri yerleştirin ve buz üzerine yerleştirin. Patolog güvenli araştırma için verilebilir doku miktarını belirleyecektir. MF izolasyonu için gerekli olan minimum doku 1,5 mm 2 'dir.
  4. Gelecekteki izolasyonu için -80 ° C 'de primer kültürler ya da dondurma ve yeri oluşturmak için elde edilen doku ya hemen kullanın.
    1. -80 ° C'de dondurularak ortam (aşağıya bakınız), ve mağaza 1 ml kriyojenik bir tüp içine yerleştirin 2 mm 2 adet - daha sonra izole edilmesi için dondurma ise, yaklaşık 1 doku kesmek. Not: Bu protokol kullanarak, 4 yılı aşkın süredir donmuş dokudan MFS başarılı izolasyon gözlenmiştir.

2. Reaktifler hazırlayın

  1. Kollajenaz çözümü için: Ca2 + ile Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 100 U / ml kollajenaz I, II ve IV Hazırlama / Mg2 + (Malzeme bakınız Tablo ). DİKKAT: Kollajenaz aktif ünite konsantrasyon ve saflık olabilir mukozal hücre yüzeyinde epitop doku sindirim ve / veya korunması etkinliğini engelleyebilir satıcıdan satıcıya, değişir. Bu potansiyel tuzaklar önlemek için, saflık (≥95%) en yüksek derecesi ile kollajenaz kullanımı ve etkin birimler konsantrasyonuna dayalı stok solüsyon hazırlanır.
  2. 10 mg / ml (3.55 UA / mg) Su bazlı DNase stok çözelti hazırlayın.
  3. Yıkama ortamı hazırlayın: (MEM: 89 ml, antibiyotik antimikotik, 100x: 1 ml ısı ile inaktive edilmiş FCS: 10 mi)
  4. MEM: Fibroblast büyüme ortamı hazırlayın 500 ml şişe; L-glutamin (200 mM): 5 mi; MEM esansiyel olmayan amino asitler, 100x çözeltisi: 5 mi; siprofloksasin HCI (10 mg / ml): 570 ul; Antibiyotik antimikotik, 100x çözeltisi: 10 mi; sodyum piruvat (100 mM): 5 mi; ısı ile inaktive edilmiş FCS: 50 mi
  5. Dondurulmuş ortamı hazırlayın: Fibroblast büyüme ortamı,% 10 ilave Dimetil Sülfoksit (DMSO) ile (reaktif 2.4), daha sonra filtre edilir-ster0.22 um filtre ile ilize.

3. enzimatik Digest İnsan Doku

  1. Doku ılık (~ 37 ° C) suda donma medya, yer cryovial donmuş ise doku ve medya çözülmüş kadar.
  2. 4 için - doku 2 mm 2 adet 5, Ca2 + / Mg2 + olmaksızın iki kez HBSS 10 ml doku yıkayın.
  3. Doku yerçekimi tarafından yerleşmiş sonra, dikkatlice numuneyi sıkma yapmadan süpernatant atın.
  4. Örnek kolajenaz çözeltisi 10 ml ilave edilir ve steril bir DNase / RNase içermeyen bir tüp içine doku çözelti karışımı transferi yerleşik örnek ayrılması için rotorlar. Epitel hücrelerinin bazal yönünü çevreleyen ve mukozal lamina propria hücresel olmayan kısmını oluşturan hücre dışı matriks ayırmak için kollajenaz kullanın.
  5. Sıkıca kapatın tüp ve dissociator (örneğin, gentleMACS) koluna üzerine baş aşağı ekleyin. Laboratuar t erişimi yoksaO, ekipman yukarıda değindiğimiz karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için her sindirim aşamasının süresini artırın.
  6. Program h_tumor_01 çalıştırın önceden ayarlanmış profil makinesi (- vadede başına 268 mermi ile 4000 rpm, değişen aralıklı darbeleri ile 36 saniyelik toplam süresi, 1000 dan itibaren) ile birlikte.
  7. Programın sona ermesinden sonra, dissociator tüp ayırın.
  8. 140 rpm'de çalkalayıcı üzerinde sürekli dönme altında 37 ° C 'de 45 dakika boyunca örnek inkübe edin. Not: doku örnekleri değişen miktarlarda için, sindirim zaman orantılı olarak azaltılabilir veya arttırılabilir (yani, doku daha fazla miktarlar ise ek süre gerektirebilir).
  9. Dissociator koluna üzerine baş aşağı tüp takın.
  10. (- Vadede başına 235 mermi ile, 4000 rpm 1000 arasında değişen aralıklı darbeleri ile, 37 sn toplam süresini) seçin ve Program h_tumor_02 çalıştırın.
  11. Programın sona ermesinden sonra, dissociator tüp ayırın.
  12. DNaz stok solüsyonu 50 ul ekleyin. / Ayırmak ölü hücreleri ve topaklanma hücre açan hücresel enkaz DNA kısmını kaldırmak için DNAz kullanın.
  13. 60 rpm'de çalkalayıcı üzerinde sürekli dönme altında 37 ° C'de 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
  14. Yine dissociator koluna üzerine baş aşağı tüp takın.
  15. (- Vadede başına 168 mermi ile, 4000 rpm 1000 arasında değişen aralıklı darbeleri ile, 37 sn toplam süresini) seçin ve Program h_tumor_03 çalıştırın.
    Not: doku tamamen sindirilmiş değilse, 20 ° C 'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj hücre ayrışma çözeltisi 2 ml süpernatant, tekrar süspansiyon atmak ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  16. Steril 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin.
  17. 20 ° C 'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüje hücre süspansiyonu. Aspire tamamen süpernatanlarına.
  18. Yıkama hücresi Ca2 + / Mg2 + olmaksızın iki kez HBSS 25 ml pelet ve supernatant atın.
  19. Son öncesinde olduh laboratuvarda mevcut otomatik hücre sayım sistemi kullanılarak ya da elle hemasitometre kullanarak hücre sayısını. MF primer kültür nesil için analiz için adım 3.19.1 sürmesine veya adım 3.19.2 sürmesine akım sitometri kullanılarak MFS sıralama.
    1. Izolasyon ve saf MF kültürünün büyüme (Şekil 1) için, ortam 3 ml 4 x 10 6 hücre kadar tohum için gerekli fibroblast izolasyon ortamının uygun miktarda Son santrifüjleme, tekrar süspansiyon hücre topağından süpernatan atılır well başına 6 de, hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar. 3.20 adıma geçin.
    2. Analizi için veya flow sitometri 24 fibroblast izolasyon medyanın 2 ml 2 x 10 6 yerleştirebilirsiniz iyi, düşük bağlama plakası ve% 5 CO 2 ile 37 ° C O / N inkübe kullanarak MFS sıralama. Bu enzimatik prosedür ile etkilenebilir hücre yüzey epitoplarını sağlamaktır. Sonra hücre süspansiyonu toplamak ve kurtarılan hücrelerin sayısı ve devamve immün analiz 8 akım sitometri.
  20. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de hücreler büyütün. % 80 confluent MF tek tabaka ~ oluşumu (Şekil 1D-E) kadar 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek.
  21. Passage 6 plaka dan oranını 1 ile T25 matara hücreleri: 1 ve ~ 10 büyümeye -% 100 confluency - fibroblast büyüme medyada 14 gün 80 elde etmek.
  22. 2: 1 oranında at T75 hücreleri T25 hücreleri Pasajlanması kültür genişletin. Hücreler konfluense ulaştıktan sonra, daha önce tarif edildiği gibi 5 akış sitometresi ile kullanılarak izole edilmiş MF saflık analizi için bir şişesi kullanın. 3: 1 oranında MF kültürünün başka T75 balon dondurmak veya geçit.
    Not: EpCAM-, CD31, CD45-, vimentin +, α-SMA +, CD90 +: flow sitometri ile incelendiğinde, mezenkimal kökenli GI mukoza stromal MF kültüründe büyüyen aşağıdaki fenotip olacak o zaman bekleniyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu enzimatik sindirim protokolü kullanarak, sürekli izole ve GI cerrahi örneklerin ve biyopsi (Şekil 1) MF nüfus gut CD90 + mukozal stromal hücreler büyümeye mümkün olmuştur. 6 yuvalı plakalar (Şekil 1A-B) tek çekirdekli hücre süspansiyonları tohumlama sonra 5 - Görünür MF koloni proliferasyon günde 2 gözlenebilir. MF primer kültürlerinde ulaşmak ~ 50-11 (Şekil 1C-D) - 7. günde% 70 izdiham.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, potansiyel bir kanserli prognostik biyolojik ve terapötik bir hedef olarak stromal hücrelerin kritik önemi giderek artan ışığında, sadece araştırma uygulamaları için geliştirilen birlikte, daha sonra kullanılmak üzere "işlevsel" biospecimens dondurma kabiliyeti önemli bir avantaj sunmaktadır. Bu kişiselleştirilmiş tıp 10, 11 gelişimini ilerletmek için hizmet olarak ek araçlar hizmet edebilir, hangi klinik biorepository yaratılması için benzersiz bir avantaj oluşturmaktadır. Daha önce do...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) ve Texas Üniversitesi Tıp Şubesi Translasyonel Bilimler Enstitüsü ve Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülü (8UL1TR000071) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MEM, 1xCorningMT-10-010-CV
Hanks'in Dengeli Tuz ÇözeltisiSigma-AldrichH6648
Sodyum piruvatSigma-AldrichS8636
Antibiyotik-Antimikotik, 100xGibco15240-062
Siprofloksasin HClCorning61-277-RF
L-Glutamin, 100xCorning25-005-CI
MEM Esansiyel Olmayan Amino AsitlerCorning25-025-CI
Dimetil Sülfoksit (DMSO) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
DL-Dithiothreitol çözeltisi (DTT)Sigma-Aldrich646563
0.5 M EDTA, pH 8.0Cellgro46-034-CI
DNAseWorthingtonLS002139
Kollajenaz  Clostridium histolyticum, Tip ISigma-AldrichC1639
Kollajenaz  Clostridium histolyticum, Tip IISigma-AldrichC1764
Clostridium histolyticum'dan kollajenaz, Tip IVSigma-AldrichC5138
Accumax hücre ayrışma çözeltisiSigma-AldrichA7089
gentleMACS C TüpleriMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS AyrıştırıcıMiltenyi Biotec130-093-235
Kontes Otomatik Hücre SayacıInvitrogenC10227
Hücre Süzgeci (70 & mikro; m)Corning352350
PE Fare Anti-İnsan VimentinBD Biosciences562337Klon RV202
FITC Monoklonal Anti-Aktin, &alfa;-Düz KasSigma-AldrichF3777Klon 1A4
APC Fare Anti-İnsan CD90BD Biosciences559869Klon 5E10

Kaynaklar

  1. Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485(2014).
  2. Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
  3. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
  4. Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
  5. Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
  6. Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
  7. Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
  8. Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798(2013).
  9. Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
  10. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  11. Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
  12. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
  13. Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215(2015).
  14. Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611(2013).
  15. Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
  16. Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
  17. Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
  18. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
  19. Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fibroblast zolasyonuMiyofibroblast zolasyonuDondurulmu Doku lemeKollagenaz SindirimiAk Sitometrisi AnaliziCD90 Pozitif H crelerGastrointestinal DokuStromal H cre K lt rmm nositokimyasal De erlendirmeDoku Disosyasyonu
İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.