Yöntem makalesi

Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

DOI:

10.3791/53692

⸱

2 Ocak 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitör (iMOP) hücreleri ve otik farklılaşmayı sürdürmek için mevcut protokoller açıklanmıştır. Duyusal epitel ve spiral ganglion nöronlarına (SGN) farklılaşmayı gösteren kültür koşulları ve moleküler belirteçler vurgulanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre replasman tedavileri için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC) veya embriyonik kök hücrelerin (ESC) kullanımı büyük umut vaat ediyor. Düşük verim ve farklılaşmış hücrelerin heterojen popülasyonları dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar, kök hücre tedavilerinin ilerlemesini engellemektedir. İç kulak hücresi replasman tedavileri için çok sayıda fonksiyonel saç hücresinin ve spiral ganglion nöronlarının (SGN) verimli bir şekilde farklılaşmasını kolaylaştırmak için kader kısıtlı ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitör (iMOP) hücre hattı oluşturuldu. Tek iMOP hücrelerinin ayrışmış kültürlerinden başlayarak, bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) çekilmesi ile hücre döngüsü çıkışını ve farklılaşmasını destekleyen protokoller tanımlanmıştır. bFGF çekilmesinden sonra çoğalan hücrelerde önemli bir azalma, bir EdU hücre proliferasyon testi kullanılarak doğrulandı. Proliferasyondaki azalma ile birlikte, başarılı farklılaşma, moleküler belirteçlerin ekspresyonu ve morfolojik değişiklikler ile sonuçlandı. iMOP'tan türetilmiş otosferlerde Cdkn1b (p27KIP) ve Cdh1'in (E-kaderin) immün boyaması, iç kulak duyusal epiteline farklılaşma için bir gösterge olarak kullanılırken, Cdkn1b ve Tubb3'ün (nöronal β-tubulin) immün boyaması iMOP'tan türetilmiş nöronları tanımlamak için kullanıldı. iMOP hücrelerinin kullanımı, iç kulak nörosensoriyel progenitörleri tarafından verilen hücre kaderi kararlarını anlamak için önemli bir araç sağlar ve çok sayıda iPSC veya ESC'den türetilmiş tüy hücresi ve SGN oluşturmak için protokoller geliştirmeye yardımcı olur. Bu yöntemler, replasman tedavileri için otik hücreler üretme çabalarını hızlandıracaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İç kulağın organları olan koklea, utrikül, sakkül ve üç yarım daire kanalı, işitme ve denge yeteneğine aracılık eder. Koklea içinde, tüy hücreleri sesleri spiral ganglion nöronlarına (SGN) iletilen elektrik sinyallerine dönüştürür. SGN'ler, nöral sinyalleri işitsel devre boyunca yaymak için aksiyon potansiyellerini ateşler. Genetik mutasyonlar, ototoksik ilaçlar ve yüksek seslere maruz kalma, işitme kaybına neden olan tüy hücresi ve SGN ölümüne katkıda bulunur1-4. Bir kez kaybolduktan sonra, bu hücreler değiştirilmez. Yeni ortaya çıkan saç hücreleri veya SGN'ler oluşturmak için iPSC ve ESC'nin kullanılması, iç kulak hücresi replasman tedavileri için büyük umut vaat etmektedir5-8. Bir ilerleme telaşı, pluripotent kök hücrelerin ve iç kulak kaynaklı progenitörlerin, olgunluğun çeşitli aşamalarında saç hücrelerine ve SGN'lere farklılaşabildiğini göstermiştir. Memeli embriyonik kök hücreleri (ESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC), fonksiyonel saç hücreleri ve SGN'ler9-11 oluşturmak için kullanılabilir. Memeli iç kulağından türetilen kök hücrelerin ve progenitör hücrelerin, in vivo hücresel muadilleri12-16'nın özelliklerine sahip tüy hücreleri ve nöronlar oluşturduğu da gösterilmiştir.

Kaybedilen saç hücrelerinin ve SGN'lerin yerine iPSC veya ESC'den türetilmiş otik progenitörlerin kullanılması, verimli bir farklılaşma gerektirir. İç kulakta aşılanmış kök kaynaklı progenitörlerin yanlış farklılaşması veya sürekli çoğalması, iç kulak fonksiyonunu şiddetlendirebilir ve iç kulakta teratom oluşumu gibi tümörjenik bir risk oluşturabilir17. Kültür koşullarının geliştirilmesine ve otik öncüllerin farklılaşmasının anlaşılmasına açık bir ihtiyaç vardır. Bu yöntemlerin geliştirilmesindeki bir strateji, iç kulak gelişimi sırasında nörosensoriyel progenitörler tarafından verilen hücre kaderi kararlarını özetlemektir. Proliferasyonu önleyen ve otik progenitörleri saç hücrelerine veya SGN'lere yönlendiren protokoller, replasman tedavilerinin güvenliğini ve etkinliğini artırmaya yardımcı olacaktır.

Gelişim sırasında, iç kulak, eşkenar dörtgen 5 ve 6 arasındaki sınırlı bir bölgede yüzey ektoderminin kalınlaşmasıyla başlar ve otik plakod haline gelir. Otik plakod, bir otik kap oluşturmak üzere istila ederken, otik kabın ön bölgesindeki bir hücre topluluğu, tüy hücrelerinin öncüllerini ve iç kulağın nöronlarını içeren nöral-duyusal-yetkin alana (NSD) yol açar18. İç kulak gelişmekte olan fare, tavuk ve zebra balıklarından yapılan kader haritalama çalışmaları, duyusal tüy hücrelerine, çevredeki destek hücrelerine ve otik nöronlara yol açan çoklu nörosensoriyel progenitör popülasyonlarını göstermektedir19-22. Yüksek hareketlilik grubu transkripsiyon faktörü, Sox2, duyusal hücre spesifikasyonunda rol oynamış ve iç kulak progenitörleri için bir belirteç olarak kullanılmıştır23,24. İç kulakta Sox2 ekspresyon seviyelerini azaltan hipomorfik mutasyonlar, kokleadaki tüy hücrelerinin, destek hücrelerinin ve SGN'lerin kaybına neden olur25,26.

Hücre kaderi kararlarına tabi tutulan otik progenitör hücreleri incelemek için, Sox2'den koklear progenitörleri eksprese eden kader kısıtlı bir ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitör (iMOP) hücre hattı daha önce kurulmuştu. iMOP hücreleri orijinal olarak embriyonik E12.5-13.5 kokleadan türetilmiş ve bir c-Myc retrovirüsü ile enfekte edilmiştir27. iMOP hücreleri, otosfer olarak bilinen koloni oluşturan hücreler olarak sürekli olarak çoğalabilir ve tüy hücrelerine, destekleyici hücrelere ve SGN'lere farklılaşma kapasitesine sahiptir27. iMOP hücrelerinin farklı otik soylara farklılaşma kapasitesinin anlaşılması, bu bulguların iPSC veya ESC'den türetilmiş saç hücreleri ve SGN'leri verimli bir şekilde üretmek için uygulanmasına olanak tanır. Etkili farklılaşma protokolleri, geleneksel tedavilere karşı inatçı olan iç kulak hastalıklarının hücre replasman tedavileri için yeni yollar açacaktır. İn vitro hücre kültürü ile otik hücrelerin üretilmesinde çok önemli bir konu, hücrelerin farklılaşma geçirip geçirmediğini belirlemeye yardımcı olan farklılaşma belirteçlerine sahip olmaktır. Cdkn1b (p27KIP), gelişmekte olan iç kulakta farklılaşma için erken bir belirteç olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır, ancak iMOP hücrelerinde Cdkn1b'nin ekspresyonu ve farklılaşma ile nasıl ilişkili olduğu ele alınmamıştır. Bu çalışmada, mevcut kültür koşulları ve Cdkn1b ekspresyonunun iMOP farklılaşmasının diğer belirteçleri ile nasıl ilişkili olduğu açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. IMOP Hücrelerde Öz yenileme bakımı

  1. Kültür ortamı iMOP hazırlayın: DMEM / F12, 1X B27 ek, 25 ug / ml ve 20 carbenecillin ng / ml bFGF. Steril reaktifler kullanılarak iMOP kültür ortamı 50 ml sağlayın. 37 ° C bir su banyosu içinde 50 ml konik DMEM / F12 49 ml kadar ısıtın.
    1. Çözülme 50X B27 takviyesi ve 37 ° C su banyosu içinde 5 dakika süre ile filtre ile sterilize edilmiş 100 mg / ml carbenecillin alikotları. RT'de 100 ug / ml bFGF kısım çözülme. Ekle 1 mi 50X B27, 100 ug / ml bFGF 10 ul DMEM / F12 içinde 100 mg / ml carbenecillin 12.5 ul.
  2. Kültürleme iMOP hücreleri için 60 mm doku kültürü çanağı içinde ortam 3 ml kullanın. Medya hacmini iki katına çıkararak her gün kültürlere taze medya ekleyin. BFGF o konsantrasyonu 5 ng / ml altına düşmeyecek emin olun.
    1. Aşağıdaki adımları listelenen kültürdeki 7 günden - 5 sonra% 5 CO 2. Geçiş hücreleri ile 37 ° C 'de kültür iMOP hücreleri. Bir 15 Aktarım kültürü10 ml'lik bir pipet kullanarak ml konik.
  3. HBSS 50 ml 0,5 M EDTA, pH 8.0, 0.1 ml seyreltilmesi ile HBSS 1 mM EDTA sağlayın. Ön Sıcak 1 mM EDTA, 37 ° C su banyosu içinde HBSS içinde yapılır.
  4. Yerçekimi çökelme veya 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. oda sıcaklığında karıştırıldı. 10 dakika - yerçekimi çökelme için, 5 37 ° C kuluçka makinesi içinde kültürleri içeren 15 ml'lik konik yerleştirin. Bu süreden sonra, otospheres 15 ml konik altında toplanır gözlemleyin.
    NOT: Aşırı merkezkaç kuvveti hücre hasarına neden olabilir.
  5. Dikkatlice aspire hücre pelet bozmadan pipet aspirasyon bir 2 ml kullanarak ortam geçirdi. Pelet hücre önceden ısıtılmış 1 mM EDTA HBSS çözeltisi 0,5 ml ilave edilir. P1000 pipet kullanarak, yavaşça yukarı pipetlemeyin ve aşağı 2-3 kez. 37 ° C 'de konik yerleştirin ve tek hücre ayrışmasını kolaylaştırmak için <5 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Yavaşça otospheres ayrışmış olup olmadığını belirlemek için hücre çözümü girdap. No Oto Eğerküreler konik altına tortu, hücreler ayrışmış edilir. Inkübasyon süresi değişebilir.
    Not: EDTA ile uzun süreyle kuluçkalanması aşırı hücre ölümüne neden olur.
  7. , 37 ° C ila hücreleri çıkarın EDTA nötralize etmek ve sulandırmak için ortam 2 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır. Aspire dışarı 2 ml aspirasyon pipet kullanarak ve hücreleri yıkamak için 1X PBS 5 ml ekleyin EDTA seyreltilmiş.
  8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı Spin ve 2 ml aspire pipet kullanarak 1X PBS dışarı aspire. 3 kez - hafifçe aşağı 2 yukarı pipetleme tarafından iMOP kültür ortamı, 0.5 ml P1000 pipet kullanarak hücreleri tekrar.
  9. Uygun kasetler 28 ile mikroakışkan parçacık sayacı kullanarak hücreleri saymak. IMOP hücrelerin birleşik plaka ~ 6 x10 6 hücre içerecektir. Medyada 100 ve sayım için kaset içine hücre çözeltisi 75 ul ekleyin: hücrelerini 1 seyreltilir. IMOP kültürlerdeki 6 cm tabak Plaka 1 x 10 6 hücreMedya yeniden (~ 1: 10 seyreltme). Passage iMOPs her 5-7 gün.
    NOT: Büyük otospheres oluşturacak veya ayırt edecek doku kültürü çanak alt eklemek Hücreler. Kültürler konfluent yaşın üzerinde iseniz hücreler de ölecektir.

2. Donma ve Çözülme IMOP Hücreleri

  1. Eritilmiş ve dondurmadan önce hücrelere 4 ° C'ye kadar çözüm dengeye sentetik dondurma ortamı hazırlayın.
  2. IMOP hücrelerinin konfluent 6 cm çanak hücreleri toplamak. 15 ml konik içine - (8 x 10 6 hücre ~ 6) 10 ml pipet ve transfer hücreleri kullanın.
  3. Yerçekimi çökelme veya oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. Otospheres küçükse, hücreler yerçekimi sedimantasyon razı olmaz. İsteğe bağlı: toplam hücre numaralarını belirlemek için adım 1.9 kullanarak hücreleri saymak.
  4. Aspire arkasında gevşek hücre pelet bırakarak pipet aspirasyon bir 2ml kullanarak medya geçirdi.
  5. Ce tekrar süspansiyon sentetik donma medya 0.25 ml ekleyin~ 5 x 10 5 6 10 x 3 hücre / ml bir yoğunlukta lls. Yavaşça P1000 pipet ile hücreleri pipetle. Ucu süzülmüş 1 ml P1000 pipet kullanarak kriyojenik flakon hücre süspansiyonu aktarın.
  6. Bir alkol serbest dondurma kapta şişeleri yerleştirin ve sıcaklık ulaşıncaya kadar -80 ° C, dakikada 1 ° C düşürmek için -80 ° C'de dondurma kap yerleştirin.
  7. Hücrelerin uzun süreli depolama için bir sıvı azot depolama tankının gaz fazına şişeleri aktarın. Kültür hücreleri çözülme, -80 ° C donmuş hücreleri içeren kriyojenik flakon dengeye.
  8. 37 ° C su banyosunda Öncesi sıcak iMOP kültür ortamı.
  9. 37 ° C su banyosu içinde şişenin alt dönen tarafından hızlı bir şekilde dondurulmuş şişe çözülme. Son buz kristali ortadan kalktığı anda çözülmüş hücrelere önceden ısıtılmış iMOP kültür ortamı 1 ml ilave edilir. Transferi 15 ml konik içine hücreleri ve iMOP kültür ortamı ilave 4 ml ekleyin
  10. 15 ml co Spin5 dakika boyunca nical. 200 xg harcanan medya aspire ve. 6 cm tabak iMOP kültür ortamı ve plaka hücreleri 2 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Genişlemesi için% 5, 37 ° C'de CO2 kültürleri inkübe edin.

3. Duyu Epiteli içine IMOP Hücreleri Farklılaşan

  1. DMEM / F12, 1X B27 takviyesi, 25 ug / ml carbenecillin: iMOP duyu epitelyum farklılaşma medya 50 ml hazırlayın. IMOP duyusal epitel farklılaşma medya 50 ml olun. 37 ° C bir su banyosu içinde 50 ml konik DMEM / F12 49 ml kadar ısıtın. Çözülme 50X B27 takviyesi ve 5 dakika süreyle 100 mg / ml carbenecillin alikotları. 37 ° C su banyosu içinde. 1 mi 50X B27 ve DMEM / F12 içinde 100 mg / ml carbenecillin 12.5 ul ekle.
  2. Hasat, tekrar süspansiyon ayırmak ve saymak için hücreler 1.4-1.9 adımları tekrarlayın
  3. Gün -3 kültür ortamı iMOP kullanarak bir 6 cm çanak Plaka 1 x 10 6 hücre. Gün 0 günü, transfer kültürleri 15 ml konik içine 10 ml pipet kullanarak. Otoimmun toplayınyerçekimi sedimantasyon küreler olarak adım 1.6 belirtti. Aspire dışarı pipet aspirasyon bir 2 ml kullanan medya geçirdi ve konik altındaki otospheres bırakın.
  4. Yavaşça duyu epitelyum farklılaşma medya 2 ml ekleyin. Transferi büyük delik 10 ml pipet kullanarak 6 cm çanak otospheres.
    NOT: Sert pipetleme Makine kesme otospheres hücreleri ayırmak olabilir.
  5. Her gün kültürlere taze duyusal epitel farklılaşma medya 2 ml ekleyin. Gerekirse, hücreler yerine yerçekimi sedimantasyon ve medya tarafından tahsil edilebilir.
  6. 15 ml konik aktarma ve otospheres adımda belirtildiği gibi harcanan medya pipet aspirasyon bir 2 ml kullanılarak 1.6.Aspirate tortu ve rahatsız otospheres bırakmak için izin vererek Gün 10'da otospheres toplayın.
  7. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1X PBS% 4 formaldehit içinde inkübe edilerek otospheres sabitleyin. , Formaldehit solüsyonu çıkarın yıkama tamponu (PBS 1X% 0.1 TritonX-10 içeren otospheres yıkayın0) blokaj tamponunda inkübe edildi (1X PBS,% 10 normal keçi serumu ve 1 saat süre ile,% 0.1 Triton X-100) ihtiva etmektedir.
    1. Tampon değiştirin ve sulandırılmış antikor ile tampon engelleme örnekleri kuluçkaya yatmaktadır. 4 ° C'de inkübe edin. 1X PBS 27 immün% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden konuyu otosphere ile yıkayın örnekleri. P1000 pipet kullanarak bir bardak slayt medyayı montaj içine 1X PBS içine aktarın otospheres ve yer otospheres. Numune üzerinde lamel koyun ve montaj medya 4 ° C'de kurumaya bırakın.
  8. 16 bit CCD kamera ve 20X 0.75 havaya ya da bir 40X 1.3 NA immersiyon yağı amacı ile donatılmış bir inverted mikroskop kurulumu kullanarak Epifloresans görüntüleri elde edin. Mavi (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), yeşil (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), kırmızı (562 ± 20nm / ve 625: Listelenen (uyarma ve emisyon) dalga boyları kullanarak farklı renk kanallarından floresan toplayın ± 20nm) ve kızılötesi (628 20nm ± / ve 692 ± 20nm).

4. Assaying Edu Ortaklığın

  1. Gün -3 günü, 6 cm tabağına 1 x 10 6 iMOP hücreleri plaka. Üç gün sonra 0. günde, hasat, ayrışır, tekrar süspansiyon ve adımları 1,4-1,9 tekrarlayarak hücreleri saymak.
  2. Plaka iMOP kültür ortamı 2.5 x 10 5 hücre ve 6 kuyu yemeğin farklı kuyularda duyusal epitelyum farklılaşma medyada 5 x10 5 hücre.
  3. Bir edu birleştirme yöntemi kullanılarak 3. günde edu katılmasıyla S fazında hücrelerin yüzdesi belirlemek
    1. Kültür ortamında 1 uM edu bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere iMOP kültürlere edu stokları ekleyin.
    2. 2 saat boyunca iMOP kültürlerinde edu inkübe ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe edilir. Hasat, ayırmak ve toplamak hücreler adımları 1,4-1,9 tekrarlayın. 15 dakika boyunca 1X PBS içinde% 4 formaldehit içinde ekleyin. RT'de hücreleri gidermek için. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. Formaldehit çözeltisi ve properl kaldıry atmayın.
    3. Etiket Hoechst hücrelerin çekirdekleri ve üreticinin protokolüne uygun olarak yeşil floresan boya azid ile edu dahil.
      Not: tüm yıkamalar 1X PBS, iki kez 1X PBS ile% 3 BSA ve% 0.1 Tween 20 ile yıkayın hücreleri ile yapılır.
    4. Ve antifade reaktif kullanılan bir slayt Mount hücreleri numune üzerinde 1.5 cam kapak yerleştirin. Bir Epifloresans mikroskopi kullanılarak işaretli hücrelerin floresan görüntüler elde.

5. IMOP Türevli Nöronlar Farklılaşan

  1. Neurobasal ortam, 1X B27 takviyesi, 2 mM L-Glutamin: nöronal farklılaşma medya 50 ml sağlayın. 5 dakika için 37 ° C su banyosu içinde 50 kat B27 ve 200 mM L-Glutamin çözülme şişe. Neurobasal ortam 48.5 mi 1 ml 50X B27 ve 0.5 ml 200 mM L-Glutamin ekleyin.
  2. Steril 10 cm plaka yuvarlak 12 mm 1.5 cam lamelleri yerleştirilmesi ve sterilize lamelleri temizlemek için plakaya% 70 EtOH eklemek tarafından Coat coverglass.
  3. Yavaşça koya ajiterslips onlar etanol kaplıdır sağlamak. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plaka bırakın. Kalan etanol yıkamak için steril 1X PBS ile lamelleri 3 kere yıkayın. 1X PBS kalan yıkamak için steril H 2 0 kez lamel durulayın.
  4. Pipet aspirasyon bir 2 ml kullanılarak H 2 0 aspire ve lamelleri kurumaya bırakın. 15 dakika boyunca doku kültürü kaputu UV ışığına lamelleri Açığa. Hemen kullanılmadığı takdirde mağazası steril bir ortamda lamelleri.
  5. 24 iyi bir çanak her bir kuyunun bir 12 mm yuvarlak lamel yerleştirin. Lamelleri kuyunun dibinde düz yalan emin olmak için hafifçe sallayın plaka.
  6. Çözülme 2 mg / 1X PBS içinde 10 ug / ml poli-D-lisin konsantrasyonuna oda sıcaklığında poli-D-lizin stok çözeltisi ml seyreltin. 10 ug / ml poli-D-lisin 0.25 ml çukurlara ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C inkübatör plaka bırakın.
  7. Steril 1X PBS ile 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 mg / ml stok çözeltisi, laminin ve Çözme 10 ug / m seyreltin1X PBS l. Ekle 10 ug 24 çoklu kuyu çanak tek kuyuya çözüm çalışma / ml laminin 0.25 ml. 37 ° C inkübatör de plaka inkübe edin. 2 ml aspire pipet kullanarak laminin çözüm aspire.
  8. P1000 pipet ile 1X PBS 1 ml ilave edilmesi ve pipet aspire 2 ml aspire 1X PBS kaldırarak lamel 1X PBS ile 3 kez yıkayın. Hücreler kaplama için hazır olana kadar kuyuda son yıkama 1X PBS bırakın. Dissociating ve Gün -3 de 6 cm tabak adımlarla 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 hücre hücre sayımı, hasat nöronal farklılaşma başlatın.
  9. Gün 0, hasat günü, ayırmak ve 1.4-1.9 tekrar ederek hücreleri saymak. Tohum 1 x 10 5 - kuyuda 24-kuyu tabak çoklu başına önceden ısıtılmış nöronal farklılaşma medya 0.5 ml x 10 5 iMOP hücreleri 1.5. Aspire ve her gün kültürlere önceden ısıtılmış nöronal farklılaşma medya ekleyebilirsiniz.
  10. 15 dakika boyunca% 4 formaldehit içinde iMOP türetilmiş nöronlar sabitleyin. birt RT Gün 7'de çıkarın formaldehit çözeltisi, yıkama tamponu ile iMOP türetilmiş nöronlar yıkama blokaj tamponunda inkübe edildi (1X PBS,% 0.1 Triton X-100 ihtiva eder) (1X PBS,% 10 normal keçi serumu ve% 0.1 Triton X-ihtiva eden 100) 1 saat karıştırıldı.
    1. Tampon değiştirin ve sulandırılmış antikor ile tampon engelleme örnekleri kuluçkaya yatmaktadır. 4 ° C'de inkübe edin. 1X PBS% 0.1 Triton X-100 denek hücreleri içeren ile yıkayın örnekleri 27 immün için. Montaj medya üzerine yerleştirmeden önce 1X PBS ile coverglass yıkayın. Montaj medya adım 3.8 listelenen Epifloresans görüntüleri almadan önce 4 ° C'de kurumaya bırakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IMOP Hücreleri bFGF Çekilme Azaltmaktadır Çoğalma

IMOP hücrelerin proliferatif kapasitesinin azaltılması ve iMOP hücrelerinin farklılaşmasını başlatmak için, bFGF kültürlerinden geri çekildi. Büyüme faktörü çekilmesi çoğalmasını azaltır olduğunu doğrulamak için, edu dahil bir çoğalma tahlilinde olarak kullanılmıştır. (BFGF) olmadan iMOP kültür ortamı (bFGF ihtiva eden) ve duyusal epitelyum ortamında kültürlenm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IMOP Kültürleri İzleme

Yeni bir iMOP hücre çizgisinin farklılaşmasını kendini yenileme korunması ve geliştirilmesi için bir protokol açıklanan ve ek kaplama biçimleri (Tablo 1) yer almaktadır. Rutin genişleme ve iMOP hücrelerin farklılaşması yardımcı Birkaç kritik adımlar belirtilmiştir. Pluripotent kök hücre kültürleri benzer, iMOP hücreleri teorik belirsiz ömrünü var. Hücre hatları düzgün korunur emin olmak için, iMOP kültürleri rutin hücre canlılığı, kend...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma kısmen Duncan ve Nancy MacMillan Fakülte Geliştirme Kürsüsü Bağış Fonu (K.Y.K.), Busch Biyomedikal Araştırma Bursu (K.Y.K.) ve Rutgers Fakülte Geliştirme Hibesi (K.Y.K.) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CoolCell LX Alkolsüz Hücre Dondurma KaplarıBioCisionBCS-405
Kriyojenik Şişeler (2 ml) Corning430654
1.5 Kalınlıkta Cam Layer (Yuvarlak 12 mm)ElektronMikroskobu Bilimleri72230-01
DMEM/F12Yaşam Teknolojileri11320-082
Nörobazal Orta YaşamTeknolojileri21103
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) pH 7.4Yaşam Teknolojileri10010-023
Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Yaşam Teknolojileri14025-092
B27 Takviyesi (50X) SerumsuzYaşam Teknolojileri17504-0441 ml alikot olarak saklanır
L-Glutamin (200 mM) Yaşam Teknolojileri25030-0815 ml alikot olarak saklanır
Doğal Fare LamininYaşam Teknolojileri23017-0151 mg/ml alikot olarak saklanır
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Yaşam TeknolojileriC10337
Synth-A-Freeze Kriyoprezervasyon OrtamıYaşam TeknolojileriA12542-01
Uzatılmış Altın Antifade MountantLife Technologies47743-73610 mg / ml 100 ve mikro olarak saklanır; l aliquots
Moxi Z Mini Otomatik Hücre SayacıOrflo MXZ001
Moxi Z Kaset Tipi SOrflo MXC002
Rekombinant Murin Fibroblast Büyüme Faktörü, bazik (bFGF)Peprotech450-33H20'de% 0.1 BSA'da yeniden süspanse edilir ve 20 mg / ml alikotlar olarak saklanır
Poly-D-LizinSigmaP78861X PBS'de yeniden askıya alınır ve 10 mg / ml 100 & mikro olarak saklanır; l alikotlar
Karbenisilin, Disodyum TuzuThermo Fisher ScientificBP2648-110 mM Hepes pH 7.4'te yeniden süspanse edilmiş ve 100 mg / ml alikot olarak saklanmış 5
ml pipet ayrı ayrı sarılmış karton kapaklı (200/kutu)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 ml pipet ayrı ayrı sarılmış karton kapaklı (200/kutu)Thermo Fisher Scientific1367811E
Doku Kültürü Tedavi Edilmiş Biolite 24 Kuyulu PlakaThermo Fisher Bilimsel130188
Doku Kültürü Tedavi Edilmiş Biolite 6 Kuyulu PlakaThermo Fisher Scientific130184 
Doku Kültürü İşlem Görmüş 6 cm ÇanakThermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex Steril Şırınga PVDF Filtre Gözenek boyutu: 0.22 μ mThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne filtreli pipet uçları 0,1 - 10 μ l uzun filtre ucuUSA Scientific1120-3810
TipOne filtre pipet uçları 1 - 20 μ l filtre ucuUSA Scientific1120-1810
TipOne filtre pipet uçları 1 - 200 μ l  filtre ucuUSA Scientific1120-8810
TipOne filtre pipet uçları 101 - 1000 μ l filtre ucuUSA Scientific1126-7810
15 ml konik tüpler steril 20 torba 25 tüp (500 tüp)USA Scientific1475-0511
50 ml konik tüpler steril 20 torba 25 tüp (500 tüp)USA Scientific1500-1211

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314(2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289(2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33(2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

iMOP H cre DiferansiyasyonubFGF Geri ekme ProtokolEdU H cre Proliferasyonu AnaliziCdkn1b Cdh1 mmunboyamaCdkn1b Tubb3 mmunboyamaGravite Sedimentasyonu ile Otosfer Olu umuN ronal Diferansiyasyon MedyumuSens r Epitel DiferansiyasyonuKulak H cre Replasman

İlgili makaleler