Ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitör (iMOP) hücreleri ve otik farklılaşmayı sürdürmek için mevcut protokoller açıklanmıştır. Duyusal epitel ve spiral ganglion nöronlarına (SGN) farklılaşmayı gösteren kültür koşulları ve moleküler belirteçler vurgulanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor
* These authors contributed equally
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Hücre replasman tedavileri için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC) veya embriyonik kök hücrelerin (ESC) kullanımı büyük umut vaat ediyor. Düşük verim ve farklılaşmış hücrelerin heterojen popülasyonları dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar, kök hücre tedavilerinin ilerlemesini engellemektedir. İç kulak hücresi replasman tedavileri için çok sayıda fonksiyonel saç hücresinin ve spiral ganglion nöronlarının (SGN) verimli bir şekilde farklılaşmasını kolaylaştırmak için kader kısıtlı ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitör (iMOP) hücre hattı oluşturuldu. Tek iMOP hücrelerinin ayrışmış kültürlerinden başlayarak, bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) çekilmesi ile hücre döngüsü çıkışını ve farklılaşmasını destekleyen protokoller tanımlanmıştır. bFGF çekilmesinden sonra çoğalan hücrelerde önemli bir azalma, bir EdU hücre proliferasyon testi kullanılarak doğrulandı. Proliferasyondaki azalma ile birlikte, başarılı farklılaşma, moleküler belirteçlerin ekspresyonu ve morfolojik değişiklikler ile sonuçlandı. iMOP'tan türetilmiş otosferlerde Cdkn1b (p27KIP) ve Cdh1'in (E-kaderin) immün boyaması, iç kulak duyusal epiteline farklılaşma için bir gösterge olarak kullanılırken, Cdkn1b ve Tubb3'ün (nöronal β-tubulin) immün boyaması iMOP'tan türetilmiş nöronları tanımlamak için kullanıldı. iMOP hücrelerinin kullanımı, iç kulak nörosensoriyel progenitörleri tarafından verilen hücre kaderi kararlarını anlamak için önemli bir araç sağlar ve çok sayıda iPSC veya ESC'den türetilmiş tüy hücresi ve SGN oluşturmak için protokoller geliştirmeye yardımcı olur. Bu yöntemler, replasman tedavileri için otik hücreler üretme çabalarını hızlandıracaktır.
Giriş
İç kulağın organları olan koklea, utrikül, sakkül ve üç yarım daire kanalı, işitme ve denge yeteneğine aracılık eder. Koklea içinde, tüy hücreleri sesleri spiral ganglion nöronlarına (SGN) iletilen elektrik sinyallerine dönüştürür. SGN'ler, nöral sinyalleri işitsel devre boyunca yaymak için aksiyon potansiyellerini ateşler. Genetik mutasyonlar, ototoksik ilaçlar ve yüksek seslere maruz kalma, işitme kaybına neden olan tüy hücresi ve SGN ölümüne katkıda bulunur1-4. Bir kez kaybolduktan sonra, bu hücreler değiştirilmez. Yeni ortaya çıkan saç hücreleri veya SGN'ler oluşturmak için iPSC ve ESC'nin kullanılması, iç kulak hücresi replasman tedavileri için büyük....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. IMOP Hücrelerde Öz yenileme bakımı
- Kültür ortamı iMOP hazırlayın: DMEM / F12, 1X B27 ek, 25 ug / ml ve 20 carbenecillin ng / ml bFGF. Steril reaktifler kullanılarak iMOP kültür ortamı 50 ml sağlayın. 37 ° C bir su banyosu içinde 50 ml konik DMEM / F12 49 ml kadar ısıtın.
- Çözülme 50X B27 takviyesi ve 37 ° C su banyosu içinde 5 dakika süre ile filtre ile sterilize edilmiş 100 mg / ml carbenecillin alikotları. RT'de 100 ug / ml bFGF kısım çözülme. Ekle 1 mi 50X B27, 100 ug / ml bFGF 10 ul DMEM / F12 içinde 100 mg / ml carbenecillin 12.5 ul.
- Kültürleme iMOP hücreleri için 60 mm doku kültürü çanağı içinde ortam 3 ml kullanın.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
IMOP Hücreleri bFGF Çekilme Azaltmaktadır Çoğalma
IMOP hücrelerin proliferatif kapasitesinin azaltılması ve iMOP hücrelerinin farklılaşmasını başlatmak için, bFGF kültürlerinden geri çekildi. Büyüme faktörü çekilmesi çoğalmasını azaltır olduğunu doğrulamak için, edu dahil bir çoğalma tahlilinde olarak kullanılmıştır. (BFGF) olmadan iMOP kültür ortamı (bFGF ihtiva eden) ve duyusal epitelyum ortamında kültürlenm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
IMOP Kültürleri İzleme
Yeni bir iMOP hücre çizgisinin farklılaşmasını kendini yenileme korunması ve geliştirilmesi için bir protokol açıklanan ve ek kaplama biçimleri (Tablo 1) yer almaktadır. Rutin genişleme ve iMOP hücrelerin farklılaşması yardımcı Birkaç kritik adımlar belirtilmiştir. Pluripotent kök hücre kültürleri benzer, iMOP hücreleri teorik belirsiz ömrünü var. Hücre hatları düzgün korunur emin olmak için, iMOP kültürleri rutin hücre canlılığı, kend.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Çalışma kısmen Duncan ve Nancy MacMillan Fakülte Geliştirme Kürsüsü Bağış Fonu (K.Y.K.), Busch Biyomedikal Araştırma Bursu (K.Y.K.) ve Rutgers Fakülte Geliştirme Hibesi (K.Y.K.) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CoolCell LX Alkolsüz Hücre Dondurma Kapları | BioCision | BCS-405 | |
| Kriyojenik Şişeler (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Kalınlıkta Cam Layer (Yuvarlak 12 mm)Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Yaşam Teknolojileri | 11320-082 | |
| Nörobazal Orta Yaşam | Teknolojileri | 21103 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) pH 7.4 | Yaşam Teknolojileri | 10010-023 | |
| Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Yaşam Teknolojileri | 14025-092 | |
| B27 Takviyesi (50X) Serumsuz | Yaşam Teknolojileri | 17504-044 | 1 ml alikot olarak saklanır |
| L-Glutamin (200 mM) | Yaşam Teknolojileri | 25030-081 | 5 ml alikot olarak saklanır |
| Doğal Fare Laminin | Yaşam Teknolojileri | 23017-015 | 1 mg/ml alikot olarak saklanır |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Yaşam Teknolojileri | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Kriyoprezervasyon Ortamı | Yaşam Teknolojileri | A12542-01 | |
| Uzatılmış Altın Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | 10 mg / ml 100 ve mikro olarak saklanır; l aliquots |
| Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Kaset Tipi S | Orflo | MXC002 | |
| Rekombinant Murin Fibroblast Büyüme Faktörü, bazik (bFGF) | Peprotech | 450-33 | H20'de% 0.1 BSA'da yeniden süspanse edilir ve 20 mg / ml alikotlar olarak saklanır |
| Poly-D-Lizin | Sigma | P7886 | 1X PBS'de yeniden askıya alınır ve 10 mg / ml 100 & mikro olarak saklanır; l alikotlar |
| Karbenisilin, Disodyum Tuzu | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | 10 mM Hepes pH 7.4'te yeniden süspanse edilmiş ve 100 mg / ml alikot olarak saklanmış 5 |
| ml pipet ayrı ayrı sarılmış karton kapaklı (200/kutu) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet ayrı ayrı sarılmış karton kapaklı (200/kutu) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Doku Kültürü Tedavi Edilmiş Biolite 24 Kuyulu Plaka | Thermo Fisher Bilimsel | 130188 | |
| Doku Kültürü Tedavi Edilmiş Biolite 6 Kuyulu Plaka | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Doku Kültürü İşlem Görmüş 6 cm Çanak | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Steril Şırınga PVDF Filtre Gözenek boyutu: 0.22 μ m | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filtreli pipet uçları 0,1 - 10 μ l uzun filtre ucu | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filtre pipet uçları 1 - 20 μ l filtre ucu | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filtre pipet uçları 1 - 200 μ l filtre ucu | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filtre pipet uçları 101 - 1000 μ l filtre ucu | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml konik tüpler steril 20 torba 25 tüp (500 tüp) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml konik tüpler steril 20 torba 25 tüp (500 tüp) | USA Scientific | 1500-1211 |
Kaynaklar
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary'....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to the Authors section in: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.
One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali
