Proteinler genellikle dağılım araştırmaları için eklembacaklıları işaretlemek için kullanılır. Eklembacaklılarda iç ve dış protein işaretlerinin uygulanması için yöntemler gösterilmiştir. Dolaylı veya sandviç enzime bağlı immünosorbent testleri (ELISA'lar) yoluyla protein işareti tespit teknikleri de gösterilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yönetme ve Dağılma Araştırma Arthropodlara Protein Marks algılama
Bu makalede
Özet
Özet
İzleme eklembacaklı hareketi genellikle daha iyi ilişkili popülasyon dinamikleri, dağılma şekilleri, konukçu bitki tercihleri ve diğer ekolojik etkileşimleri anlamak için gereklidir. Eklembacaklılar genellikle benzersiz bir işareti ile etiketleyerek doğada izlenir ve daha sonra yeniden toplayarak onların dağılma yeteneklerini belirlemek için zaman ve mekan onları edilir. Bu tür renkli toz veya boya gibi gerçek fiziksel etiketler, ilave olarak, proteinler çeşitli ekolojik araştırmaları için eklembacaklıları işaretlenmesi için oldukça etkili olduğu kanıtlanmıştır. Proteinler dahili ve / veya harici olarak tatbik edilebilir. Bu proteinler daha sonra bir proteine özgü enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile yeniden ele artropodları tespit edilebilir. Burada harici ve dahili protein ile eklembacaklılar etiketleme için protokolleri açıklar. İki basit deney örnekleri gösterilmiştir: haricen bir protein açısından zengin bir diyet ve (2) bir dış proteini işareti sağlayarak bir böcek kişiye (1), bir iç bir protein işaretiTıbbi nebulizer kullanarak bir böceğe pplied. Daha sonra sandviç ve böcekler üzerinde protein işaretleri algılamak için kullanılan dolaylı ELISA yöntemlerinin bir adım-adım rehber ilgilidir. Bu gösteri, mark-release-alınışında, mark-yakalama ve araştırma öz-mark-yakalama türleri için eklembacaklılar üzerinde edinimi ve protein belirteçlerinin tespiti çeşitli yönleri immunomarking yöntem olmuştur çeşitli yollarla birlikte, tartışılır Araştırma hedeflerinin geniş bir yelpazede uyacak şekilde adapte.
Giriş
Doğada Eklembacaklı zararlıların doğal düşmanları (parazitoit ve predatör) ve tozlayıcı hareketini izleme ekosistem hizmetlerini geliştirmek için nasıl daha iyi anlaşılması için gereklidir. Dispersal araştırma türlerinin çoğu için temel bileşeni ilgi eklembacaklıların (ler) etiketlemek için güvenilir bir yöntem yaşıyor. Malzemelerin çeşitli (örneğin, boyalar, boya, renkli tozlar, etiketler, nadir elementler, proteinler) davranışları ve diğer ekolojik etkileşimleri 1,2 beslenme, nüfus dinamikleri, dağılma yeteneklerini değerlendirmek için eklembacaklılar işaretlemek için kullanılmıştır.
Herhangi bir dağıtma araştırma iç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. İç Mark, Tutma ve Algılama Prosedürü
- İç işaretleme prosedürü
- Yapay diyet veya alanından yetiştirilen bir laboratuvar kolonisinden (n 100 bireyleri ≈) ilgi böcekleri toplamak ve iki temiz yetiştirme kapları bölün.
- Kapların birine düzenli bir 20 ml'lik diyet paketi (işaretsiz negatif kontrol tedavisi) yerleştirin. , 1.0 mg / ml tavuk IgG / IgY çözeltisi 1.0 ml ile ikinci 20 mi yapay bir diyet paket Supplement iyice karıştırın ve başka bir kap içine koyun.
Not: ilgi böcek yapay diyet yoksa işaretleyiniz veya normalde (örn, yeşil fasulye, güve yumurtaları, su, şeker, bal) üzerine sürekli ne olursa olsun diyet ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İç işaretleme:
İç işareti tutma testi sonuçları Şekil 2A'da gösterilmektedir. Hesaplanan ELISA kritik eşik değeri 0,054 idi. Genel (dört örnek tarihleri kombine), protein olmadan tedavi böcekler sürekli düşük ELISA değerleri (X = 0.038 ± 0.002, n = 80) vermiştir. Tersine, böceklerin tüm protein zenginleştirilmiş diyet sürekli güçlü ELISA değerleri (X = 0,475 ± 0,221, n .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Eklembacaklı protein immunomarking prosedürü ilk yüzyıl önce 9 neredeyse dörtte tanımlanmıştır. O zamandan beri, prosedür hem dahili ve harici uygulanan IgG / IgYs kullanarak eklembacaklıların geniş bir yelpazede dağılma modellerini incelemek için adapte edilmiştir. Bu proteinler şu ana kadar test edilen böcek türlerinin çok çeşitli kararlı işaretleri kanıtlamıştır. Ancak yukarıda belirtildiği gibi, IgG / IgYs kullanmak için önemli bir sınırlama çok pahalı olmasıdır. Sonuç olarak, IgG / IgYs İİH ve böceklerin.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu yayındaki ticari adları veya ticari ürünlerin Mansiyon belirli bilgi vermek amacıyla sadece ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından öneri veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.
Teşekkürler
Harçlar Tarım ve Gıda Araştırmaları Girişimi Rekabetçi Grant hayır, kısmen, USDA CRIS 5347-22620-021-00D tarafından sağlandı ve. Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü 2011-67009-30141. Biz Johanna Nassif teknik destek için müteşekkiriz. Biz de Şekil 3'te kullanılan resimlerin bazılarını sağlamak için Paul Baker, David Horton, Diego Nieto ve Frances Sivakoff teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Gıda saklama kabı (böcek yetiştirme için) | Rubbermaid/Tupperware | Çeşitli boyutlar | Çeşitli üreticiler ve satıcılar. Örgü kumaş bir pencereye yapıştırılır |
| Küçük hacimli nebulizatör (Mikro Sis) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Çevrimiçi olarak ve tıbbi malzeme mağazalarında mevcuttur. Diğer markalar da işe yarayacak. |
| Mikrosantrifüj tüpleri, kapaklı 1,6 ml | Continental Lab Products | 4445.X | Benzer herhangi bir tür işe yarayacaktır. Kapakları kolay açılabilen markaları tercih ediyoruz. |
| Mikrosantrifüj tüpleri için strafor saklama kutusu (5x20 ızgara) | RPI Corp. | 145746 | Bu tasarım güzel çünkü tüpleri kalabalıklaştırmıyor. |
| Dağıtıcı, tekrarlayıcı | Eppendorf | 4982000322 | Benzer herhangi bir şey, dağıtımı hızlandırmaya yardımcı olacaktır. |
| Havaneli, plastik tek kullanımlık kağıt mendil öğütücüler, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Çeşitli satıcılarda mevcuttur. Havaneli temizlenebilir ve yeniden kullanım için otoklavlanabilir. |
| BD Falcon ELISA plakaları, 96 kuyulu (düz tabanlı) | BD | 351172 | |
| Ovation pipeti, manuel (20-200 ve mikro; l) | VistaLab | 1057-0200 veya 1070-0200 | Benzer herhangi bir tip çalışacaktır. Bu model ergonomiktir. |
| Rezervuarlar, steril reaktif | VistaLab | 4054-1000 | Benzer bir şey işe yarayacaktır. |
| Elektronik pipet, 8 kanallı (50-1.200 & mikro; l) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | Eğer bir elektronik model seçmek zorunda kalsaydınız, bu boyut en kullanışlı olanıdır. |
| Elektronik pipet, 8 kanallı (10-300 & mikro; l) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Benzer herhangi bir şey işe yarayacaktır. |
| Manifold, çok kuyulu plaka yıkayıcı (8 konumlu, düz) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Benzer herhangi bir şey manuel plaka yıkama için işe yarayacaktır. |
| Absorbans algılamalı mikroplaka okuyucu | Moleküler Cihazlar | SpectraMax 250 | Benzer her şey işe yarayacaktır. |
| Tavuk IgG/IgY | Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik | I1903-15R | Diğer kaynaklardan da temin edilebilir |
| : Yumurta akı, | Bakkal | " Tüm Beyazlar", " Yumurta Çırpıcılar", etc. | % 5 çözelti için 95 ml dH2< / sub>O ile karıştırın |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g / L |
| Sodyum klorür (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g / L TBS yapmak için ve 8.0 g/ PBS için L |
| Sodyum fosfat dibazik (Na2< / sub>HPO4< / sub>) | Sigma-Aldrich | S0876 | PBS |
| Potasyum fosfat monobazik (KH2< / sub>PO 4< / sub>) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0,2 g / L PBS |
| Potasyum klorür (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0,2 g / L PBS |
| Tween 20 için, ÇED sınıfı | Sigma-Aldrich | P1379 | Tuzlar çözüldükten sonra PBS'ye L başına 0,5 ml ekleyin. |
| %1 BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Karışımı 1 L içinde 1 paket dH2O |
| Anti-Tavuk IgY (IgG) (tam molekül) antikoru tavşanda üretilen antikor (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 & l 50 ml TBS |
| Kuru Süt, Toz veya Taze Süt (%1) | Bakkal | %1 çözelti için 10 g 1 L dH2O ile | |
| Anti-Tavuk IgY (IgG) (tam molekül)-Tavşanda üretilen Peroksidaz antikoru (1:10.000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 &mikro; l% 1 sütte l% 1 |
| tavşanda üretilen Anti-Tavuk Yumurtası Albümin antikoru (1: 8.000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Seyreltik 125 & mikro; l in 1 L PBS-BSA |
| Keçi Anti-Tavşan IgG Peroksidaz Konjugatı (1: 2.000) | Sigma-Aldrich | A6154 | 1 L PBS-BSA'da 0.5 ml seyreltin, ardından 1.3 & nbsp ekleyin; ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silikon-polieter kopolimer | Lehle Tohumları | VIS-01 | Son bileşen olarak ekle |
| TMB Microwell Tek Bileşenli Peroksidaz Substrat | SurModics | TMBW-1000-01 |
Kaynaklar
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
