Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme Arabidopsis Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Summary

Kristalin selüloz, bitki hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, hücresel bir çözünürlükte nicelleştirilmesi teknik olarak zordur. Burada, uzay-zamansal bir çözünürlükte hücre duvarı bileşimi hakkında bilgi elde etmek için polarize ışık teknolojisinin ve kök kesitlerinin kullanımını rapor ediyoruz.

Abstract

Bitki hücreleri, bileşimi nihai boyutlarını ve şekillerini belirleyen bir hücre duvarı ile çevrilidir. Hücre duvarı, hem kristal yapıları hem de amorf organizasyonun selüloz zincirlerini oluşturan selüloz mikrofibrillerini içeren polisakkaritler içeren karmaşık bir matristen oluşur. Selüloz liflerinin oryantasyonu ve konsantrasyonları, hücrenin mekanik özelliklerini belirler. Kristalli selüloz seviyelerini belirlemek için her biri hem avantajlar hem de sınırlamalar getiren çeşitli yöntemler kullanılır. Bazıları, toplam selüloz içindeki kristal bölgelerin oranını ayırt edebilir. Bununla birlikte, uzay-zamansal bilgide eksik olan tüm organ analizleriyle sınırlıdırlar. Canlı görüntülemeye dayanan diğerleri, kesin olmayan boyaların kullanımıyla sınırlıdır. Burada, Arabidopsis thaliana köklerinin enine kesitlerinde kristalin selüloz birikimini temsil eden, bağıl ışık geciktiricinin spesifik miktar tayini için hassas bir polarize ışık tabanlı sistem rapor ediyoruz. Bu yöntemde, hücresel çözünürlük ve anatomik veriler korunur ve büyüyen kökü oluşturan farklı dokular arasında doğrudan karşılaştırmalar yapılır. Bu yaklaşım, hücre duvarı bileşimi, hücresel davranış ve tüm organ büyümesi arasındaki bağlantıya ışık tutan yeni bir analitik boyut açar.

Introduction

bitki hücre duvarı dinamik bir yapıdır. Büyüyen hücreleri hücreler genişletmek için izin veren kuruluş olan birincil hücre duvarı ile çevrilidir. depozito bitkinin mekanik destek geliştiren bir daha sert ikincil duvar büyümeye ateşkes Hücreler. Her iki hücre duvarları, farklı gelişim aşamasında arasında değişir ve ^1,2 dokular farklı yapılarda (örneğin, hemiselüloz ve pektini) polisakaridlerinin bir matris içine gömülü, selüloz mikro-iplikçiklerinin oluşmaktadır. Selüloz sıkı bir kristalin yapısının mikrofibril oluşturulması için hizalanır (1,4) -β-D-glukan zincirleri olarak sentezlenir. Amorf selüloz glukan zincirleri daha sıralanır bölgeleri belirtir. Kristalin ve amorf alan arasındaki oran, mekanik mukavemet ve viskoelastik özelliklerini sırasıyla ³ sağlayarak hücre duvarının mekanik özelliklerini etkilediği düşünülen bir parametredir. Çeşitli yöntemler olmuşturX-ışını kırınımı ve çapraz polarizasyon / solid-state NMR ⁴ iplik sihirli açı algılamak ve aralarında selüloz düzenlemesinin iki formlarını ölçmek için geliştirdi. X-ışını difraksiyon numunesi ⁵ amorf selüloz etki karşı kristalin oranını belirlemek için kullanılabilir. Alternatif bir yöntem, sırasıyla, kristalin ve amorf selüloz ya da başka polimerler arasında ayrım, asit çözünmeyen ve asit çözünür malzeme içine hücre duvarı içeriği fraksiyonasyon kullanır. Bu yaklaşımda, işaretlenmiş glukoz ^([14C] glukoz) eklenmesi, ^{selüloz, 6,7} ölçmek için kullanılır. Bu yöntemler, en iyi tüm organ analizi için, bitki malzemesi, büyük hacimli gerektirir ve bu nedenle, hücre duvarı yapısına, doku spesifik varyasyona yetersiz duyarlıdır. Hücresel bir çözünürlükte selüloz mikro-iplikçiklerinin Görselleştirme değişiklikleri tespit olabilir, floresan boyalar ile birlikte ^8,9 canlı görüntüleme çalışmaları elde edilebilirselüloz mikro-iplikçiklerinin yönelimi. Bununla birlikte, bu boyalar, miktar tayini için kullanılır, bu selüloz, kristal halindeki özgü değildir ve hücre duvarının ⁸ normal yapısına müdahale edebilir. Polscope ışık ışınlarını bölünmüş ve ışığı ¹⁰ bir kısmını geciktirmek için kristalli selüloz yeteneğine dayanan bir görüntüleme tekniğidir. Işık geriliği ışığı yayılma yönüne dik yalan mikrolitlerin en güçlü olduğu. Benzer bir yönlendirme ile mikro-iplikçikler, ışık geciktirici ¹¹ daha büyük bir kristallik derecesi artar. Bu nedenle, polscope bağıl seviyelerde ve selüloz mikro-iplikçiklerinin yönünü hem de incelemek için kullanılır.

Hızla ¹² genişletmek önce kökleri, hücre bölünmeleri bir dizi geçmesi, hücreler kök ucunda, kök hücre niş de kaynaklanan sırasında doğrusal bir büyüme sergilemektedir. kök içeren hücreler, bir tek yönlü (anizotropik) genişletmekşekilde, hücre duvarının ¹³ özelliklerini etkileyen küçük molekül sinyal hormonlar tarafından dikte edildiği gibi. Hormonlar Diferansiyel yanıtları, zaman ve mekan içinde, dengeli bir organ büyümesi ¹⁴ sağlamanın bir araç sağlar. Bu nedenle, hücre duvarı yapısının yüksek çözünürlüklü analizi daha iyi tüm organ büyümesine hücre tipine spesifik yanıtlar arasındaki bağlantıyı anlamak için gerekli önemli bilgiler sağlayabilir. Burada, yüksek kaliteli, anatomik bölümlerde görüldüğü gibi Arabidopsis kökleri kristalli selüloz dokuya özel birikmesini çalışma polscope uygulanmasını rapor etmektedir. Bu yöntem, en son hormon aktivitesi ¹⁵ uzaysal pertürbasyon yanıt olarak kristalli selüloz hücre tipine spesifik birikimi ortaya çıkardı.

Protocol

1. Bitki Büyüme

1. Yüzey tohumları sterilize edin.
   1. Islak ya da kuru bir yöntemle (30 mg kadar) tohum sterilize edin. Bir örnek olarak, kuru bir sterilizasyon yöntemi, en az 4 saat ve gece boyunca kadar kapalı bir kurutucuda bir cam beher içinde, 50 mi ağartıcı 1 ml buzlu HCI% 37 ekleyin. Bir kimyasal kaputu bu adımı gerçekleştirin.
2. 0.5x Murashige & Skoog (MS) ortamında% 0.8 bitki agar ile plakalar üzerinde steril tohumlarını yaymak. Parafilm veya gözenekli bantla plakaları sarın ve alüminyum folyo ile kapatın.
3. eşit bir şekilde çimlenmesine teşvik etmek için 4 gün 1 - 4 ° C'de plakaları saklayın.
4. Arabidopsis fide yetiştirmek için uygun bir büyüme odasına plakaları aktarın. agar ortamı üstündeki kök büyümesini sürdürmek için ve penetrasyonu önlemek için dikey tabak yerleştirin.
5. Aktarım fidanları çimlenme (DAG) 7 gün sonra sabitleştirici için.

2. Sabitleme

1. 50 mi Richardson Solutio hazırlanmasıiki kez damıtılmış su içinde% 1 boraks (tampon maddesi),% 1 metilen mavisi ve% 1 Azure (histolojik boyalar) eşit hacimlerde bir araya getirilmesiyle n. Kullanmadan önce 0.22 mikron PVDF Filtre Ünitesi Driven bir Şırınga süzülür.
2. 0.05 M Sodyum kakodilat (tamponlama ajanı)% 1.25 Glutaraldehyde: fiksatif 50 ml hazırlayın.
   Not: Bu malzemeler toksik olan ve kimyasal bir kaput ele alınması gerekir.
3. Nihai sabitleme bir çözüm elde etmek sabitleme çözeltisine Richardson çözeltisi 100 ul (2.1 bakınız) (2.2) ekleyin.
4. Marka, karşılık gelen Örnek adı, 6 gözlü bir plakanın her bir.
5. fide, bir kez transfer tamamen sıvı ele alınacaktır, böylece kuyulara (2.3 bakınız) 3 ml nihai tespit çözümü - 2 yerleştirin.
6. Dikkatle her kuyuya 10 fidan kadar, forseps kullanarak, aktarın. Parafilm kullanarak plakaları Seal. En az bir gece için, ve bir haftaya kadar karanlıkta 4 ° C'de saklayın,.

3. Dehidrasyon

1. fidan kurutmak. Burada yer alan gibi, etanol artan konsantrasyonlarda içeren, yeni 6-delikli plakalara arasında transfer:% 10 etanol, 15 dakika boyunca; 15 dakika boyunca% 30 etanol; 15 dakika boyunca% 50 etanol; 15 dakika boyunca% 70 etanol; 15 dakika boyunca% 85 etanol; 15 dakika boyunca% 95 etanol; gece boyunca, en azından 4 ° C,% 95 etanol. dikkatle plastik forseps ile tercih onların kotiledon, onları tutarak fidan tutun.

4. Sızma

1. infiltrasyon ortamı hazırlayın. Küçük bir cam şişeye 50 mi bazik reçine sıvı kiti ile historesin kiti aktivatör 1 torbanın içeriği karıştırın. 20 dakika için mıknatıslı karıştırın. Sızma ortamının bir kaç hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
2. Mark her gelen numune adıyla yeni bir 6-plaka kuyu ve 2 ile doldurun - infiltrasyon orta 3 ml.
3. forseps kullanarak sızma ortamına% 95 etanol çözeltisinden fidan aktarın. fidan fu olduğundan emin olunLly ortam ile kaplı.
4. Bitki dokularının içine maksimum nüfuz sağlamak için, en az 4 gün süreyle 4 ° C'de depolayın.

5. Blok Hazırlık

1. küçük etiketler, kalıp gömme her bir kuyu içinde, örnek adıyla kalem işaretli yerleştirin.
2. 15 ml sızma orta (4.1) 1 ml sertleştirici ekleyerek orta gömme hazırlayın. Polimerizasyon sorunları önlemek için, bir sesini daha küçük 15 ml hazırlamak için çalışmayın.
3. de 200 ul gömme ortamı ile kalıp içinde, her yarım doldurmak ve kalıp şekline kesilmiş bir üst filmi parçası ile kapak ama her iki tarafta, 1 mm daha büyük bir boyuta. polimerizasyonun izin vermek için, en az 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 5 saat aşmayın.
4. gömme orta ek bir toplu hazırlayın (5.2) ve kök uçları kalıp içinde düzenlenmiş edilirken polimerizasyonu önlemek için, buz üzerinde tutmak.
5. neşter kullanılarak bir diseksiyon kapsamında her kök ucu kesilmiş ve çok dikkatli bir i konumlandırmakT: dikey enine kesitler ya da yatay uzunlamasına kesit, yaklaşık 2 de - kalıp çeperine ile 3 mm. bir üst film ile çözelti ve kapağı bloke tamamen kalıp doldurun. o polimerize sonra engelleme çözümü biraz küçültmek unutmayın.
6. en azından 2 saat boyunca oda sıcaklığında saklayın.
7. blok kurutulması için, kuru silika jeli ile bir kutu içinde yer ve en azından, bir gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.

6. Kesit

1. Bir bıçak makinesi ile cam çubuklar cam bıçak hazırlayın. Doku kesit cam bıçak kullanın. Bir kare içine cam çubuk kesin ve sonra bir elmas puanlama aracını kullanarak, iki bıçak üretmek için çapraz kare kesti.
2. Bir kesit makine kullanarak 3 mikron genişlik dilimleri, - 2 içine Bölüm blokları. su buharlaşana kadar - (60 ° C 50), yer distile su damlacıklarının üstünde bir bardak slayt dilimleri ve düşük ısı için ayarlanmış bir ısı bloğu üzerine slayt yerleştirin.

7. Polarize Mikroskop Hazırlığı Slide

1. Orijinal çözeltisi% 0.2 Richardson çözeltisi (2.1) ile seyreltilir ve dilimleri kapsayacak şekilde 1 ml kullanın. 5 saniye için ısı bloğuna yerleştirilir ve daha sonra damıtılmış su ile yıkayın.
2. sıcak bir plaka üzerinde slayt kurutun. Ilgi dilimleri konumunu belirtmek için mikroskop altında daha sonraki kimlik kolaylaştırmak için, bir diseksiyon kapsamında gözlemleyin ve bir işaretleyici ile slayt arka işaretleyin.
3. örtücü bir kılıfla montaj orta ve kapak 100 ul ekle.

8. Görüntü Alma

1. Geciktirici bilgi ve polarize / girişim optik filtresi (Şekil 1 AD) elde etmek için uygun Polscope sistemi ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında kök bölümleri içeren kapalı slayt yerleştirin.
2. Numunenin tamamının açık görselleştirme sağlar seçin büyütme (örneğin, bu çalışmada 40X) ve mikroskop odakBlok bölümü ama hiçbir kök bölümü içeren boş bir alana e. Hiçbir lekeleri ile temiz bölge bulmaya çalışın. arka plan ayarlamak için bu bölgeyi kullanın.
3. görüntüleme sistemi ve yazılım parametreleri ayarlayın: Set aralığı 17 nm. (8.2) "Otomatik Pozlama" Uygula ve boş alandan arka plan görüntüsünü alın. Bir arka plan görüntüsü deney başına kullanılır.

Selüloz Mikrofibril Oryantasyon 9. Polscope Analizi

1. boyuna kesitlerin analizi.
   1. mikroskop altında boyuna kesitler içeren bir slayt yerleştirin ve bunun bir geciktirici görüntü elde. ilgi kök bölümünde mikroskop odaklanın. Yeni bir dosya adı sağlayın.
   2. "Canlı Abrio" pencereden bir Abrio görüntüsü (retardasyon bilgilerle görüntü) yakalayın. Şekil 2C'de gösterildiği gibi, hücre çevresi boyunca çalışan lekeli selüloz belirlenebilir hücre duvarı içeren bir bölümünü içine almak için edin.
2. Görüntü analizi.
   1. görüntü yığını ilgili resmin üzerine çift tıklayın. "Ekran Ayarları" sekmesinde "Oryantasyon Sözde rengi" i seçin.
   2. Selüloz mikrofibril açısını tahmin etmek için, renk çarkı bu hücre duvarının karşılık gelen gölge eşleşir.
      Not: Şekil 2C'de renk çarkı mikrofibrillerin uzun ekseni boyunca yönünü gösterir mikrofibril boyunca uzanan ışık yavaş ekseni yansıtır. selüloz mikro-iplikçiklerinin açısı renk ve hücrenin uzun ekseni ile gösterilen açıdır. Örneğin, içerlek uzayan hücre hücrelerinin uzun eksenine yaklaşık 90 ° eğimli cam göbeği renkli gösterir.
   3. Hücre duvarının ortalama mikrofibril açısını ölçmek için, yazılımın araç çubuğundan "geciktirici ve Azimut Damgası" aracını kullanın. aracı, noktayı seçerek ve süre elde edilen görüntüde ilgilenilen bölgeye tıklayın.
      NOT: Bu wilderece açı (azimut) (Şekil 2C) ekranında l sonucu.
   4. eklenti menüsünden alternatif erişime açık polarize ışık görüntü analiz yazılımı, öğle yemeği "Pol-Analyzer" eklentisi. Yeni açılan pencerede, "Birefringence" sekmesini ve açık seçin ve ardından arka plan dosya ve resim dosyası kaydedin.
   5. Görüntü penceresinde, "Özellikleri" i seçin. ve (bu çalışma için kullanılması 5 piksel) 'YG piksel boyutunu' ayarlayın. "Özelliklerin." Içinde pencere seçin "Sonuç tablosunda göstermek değerler".
   6. Görüntü penceresinde ilgi bölgeyi işaretlemek için Poligon aracını kullanın. selüloz mikrofibril yönünü elde etmek için "Oryantasyon Lines" seçeneğini seçin.
      Not: Bu derece açı (azimut) ekranında neden olur.
      NOT: Her iki yöntemden biri ile hesaplanan ortalama açısı daha sonra slayt üzerinde kök bölümünün konumlandırılması normalize edilmelidir. sapma düzeltmek içinslayt boyunca bütün kök bölümünün yatay konumlandırma, (o bölüme dik ve kök büyüme ekseni, Şekil 2C boyunca olduğu) uzun ekseni boyunca hücreyi kuşatan hücre duvarının ortalama mikrofibril açısını ölçmek. Kök bölümü doğru slayt boyunca yerleştirilmiş olduğunda bu açı 180 ° 'dir. mikrofibril açısını hesaplamak için, 180 ° 'den sınırdaş hücre duvarının ortalama ölçülen mikrofibril açısını çıkarın. slayt üzerine düz yatıyor hücre duvarının ortalama ölçülen mikrofibril açısına sonuçlandı farkı ekleyin.

Kristalin selüloz Birikimi 10. Polscope Analizi

1. enine (çapraz) bölümleri kullanın. bunların selüloz mikrolitler benzer açıyla sıralanması durumunda (9 belirlenen) bu kristal selüloz birikim hücreler arasında karşılaştırılabilir okuyabilir.
2. görüntü yığını ilgili resmin üzerine çift tıklayın. Seç "PEkran Ayarları "sekmesinden" in "renk seudo.
3. geciktirici ölçmek için. Zoom-in resmin üzerine. "Bölge" i seçin ve ilgi tüm bölgeleri işaretleyin. Tüm değerleri "Panoya kopyala" "ölçümleri" sekmesine ve taşıyın.
   1. Excel'e veri aktarımı ve gerekli bilgileri (geciktiricili bölgesini ortalama) ayıklayın. veri normalleştirmek.
      NOT: dilimler arasındaki kalınlık farklılıkları hesaba slayt belirli bir hücre duvarı kenarına göre değerlerini ifade etmek için. normalleştirmek için, aynı görüntüde farklı bir hücre duvarının ortalama geciktiricili tarafından ilgiyle hücre duvarına karşılık gelen ortalama geciktirici bölün. Örneğin dış epidermal hücre duvarı çalışmamızda iç kortikal hücre duvarı göre normalize edildi.
4. Örnek başına 3 köklerinin en az, kök başına en az 3 bölümler için ölçümler tekrar edin.

Results

Bir model, bir organ ^15-17 olarak Arabidopsis kök kullanılarak brassinosteroidlerin (BR) için hücre tipine spesifik yanıtların etkisini incelemek. BR reseptör BRI1 hedeflendiğinde, olmayan saç hücreleri olarak adlandırılan epidermal hücrelerin bir alt kümesi (Şekil 2A, B), bu tek yönlü bir komşu hücrelerin hücre genişlemesi ve bütün kök büyüme ¹⁵ inhibe etmek bri1 mutantının arka bölgesi. Polscope analizi bu inhibisyonu altında yat...

Discussion

Anatomik bilgi korurken Burada, Arabidopsis kökleri oluşturan farklı dokularda kristalin selüloz birikmesine tayini için bir yöntem sunulmaktadır. Bu nedenle, bir selüler çözünürlükte bitki büyüme süreçlerinin anlaşılması yönünde bir adım içerir. Bu yöntem, aynı zamanda, ek bitki türleri ve organların çalışma için uygulanabilir.

yöntemi uygulanırken noktalarının sayısı dikkate alınmalıdır. Belirli bir kök bölümü ilk, kristalin selüloz birikimi bunların selüloz mikro-iplikçiklerinin ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog (MS)	Duchefa	M0221
Boraks	LOBA CHEMIE	6038
Metilen mavisi	Sigma	M-9140
Azure	Sigma	861065
Şırınga Tahrikli 0.22 mm PVDF Filtre	MILLEX-GV
Glutaraldehit	EMS	16220
Sodyum Kakodilat	Sigma	C-0250
Leica kiti historein	Leica	7022 18 500
gömme kalıpları	Agar Scientific	AGG3530
filmi 100 & mikro; P.P.C.			tepegöz filmi
Knivemaker	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon immumount	Termo	9990402	montaj ortamı
ışık mikroskobu	Nikon	Eclipse 80i
Abrio görüntüleme sistemi	CRI	Abrio görüntüleme sistemi
Abrio V2.2 yazılımı	CRI	Abrio V2.2 yazılımı
Açık erişim polarize ışık görüntü analiz yazılımı	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/