Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için

7.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53716

⸱

24 Mart 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Pharmacology, Duke University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Drosophila melanogaster'in yumurtlama tercihlerini tek hayvan çözünürlüğünde test etmek için yüksek verimli bir testi tanımlar. Bu tahlil, basit bir karar verme sürecini kontrol eden genleri ve devre bileşenlerini tanımlamak için basit, verimli ve ölçeklenebilir bir platform sağlar.

Özet

Son zamanlarda, Drosophila yumurtlama tercihi basit karar verme süreçlerine nöral temelini incelemek için bir genetik uysal bir model olarak ortaya çıkmıştır. yumurtalarını yatırmak siteleri seçerken, erkek sineklerin kendi seçenekleri göreceli çekiciliği sıralama ve seçme yeteneğine sahiptir "daha büyük iki mal." bir de toplum tabanlı ve kurmak için zahmetli olduğu gibi, bu basit karar verme sürecini altında yatan devre bazında aramak için sistematik bir genetik tarama yaklaşım almak istiyorsa Ancak, çoğu yumurtlama tercih deneyleri pratik değildir. Tek kadın yumurtlama tercihlerini okuyan verimini arttırmak için, biz en fazla otuz bireyin her can aynı anda tahlil yumurtlama tercihleri ​​her kadın yüksek yumurtlama oranına sahip sağlayan bir protokol yanı sıra uçar özel odalarını geliştirdi (yani onların tercihi kolayca ayırt edilebilir ve daha inandırıcı olduğunu). Yaklaşımımız yürütmek kolaydırve çok tutarlı sonuçlar üretir. Ayrıca, bu odalar, video yumurtlama hayvanların kayıt ve optogenetics çalışmaları için ışık sunmak için izin farklı ekleri ile donatılmış olabilir. Bu makalede, bu odalar içinde denenecek olan sinekler hazırlanması için, bu odalar ve prosedür imal edilmesi için planları içerir.

Giriş

Drosophila melanogaster, davranışların sinirsel temelini incelemek için güçlü bir genetik model organizmadır. Nöronları hedefli bir şekilde manipüle etmek için genetik araçların hızlı gelişimi ve karmaşık davranışsal analiz araçlarının ortaya çıkması, çeşitli doğuştan gelen ve öğrenilmiş davranışların duyusal-motor dönüşüm süreçlerinin altında yatan devre mekanizmalarını inceleme yeteneğimizi önemli ölçüde geliştirmiştir1-3.

Drosophila yumurtlama, basit karar verme süreçlerinin sinirsel temelini incelemek için uygun bir modeldir. Özellikle, Drosophila dişilerinin, bir yumurtayı belirli birseçenek 4-8'e bırakmayı "taahhüt etmeden" önce seçeneklerini karşılaştırma ve sıralama yeteneğine sahip oldukları gösterilmiştir. Örneğin, yalnızca düz (sükroz içermeyen) bir substrat veya sadece sükroz içeren bir substrat verildiğinde, dişiler yumurtlama için her iki seçeneği de kolayca kabul eder. Bununla birlikte, her iki seçenek de sunulduğunda, dişiler bazı bağlamlarda sükroz substratını sağlam bir şekilde reddeder7,9,10. Bununla birlikte, dişilerin "iki maldan daha büyüğünü seçmesine" izin veren sinirsel mekanizmalar hakkında nispeten az şey bilinmektedir. En büyük engel, yumurtlama tercihlerini test etmek için etkili bir yöntemin bulunmamasıdır, böylece bu sorunu incelemek için sistematik bir genetik tarama yaklaşımı kullanılabilir.

Bu raporda, dişilerin yumurtlama tercihlerinin tek hayvan çözünürlüğünde ve önceki yöntemlere göre önemli ölçüde iyileştirilmiş verim ve tutarlılıkla test edilmesine izin veren geliştirdiğimiz protokolü açıklıyoruz. Özellikle, tasarladığımız odaların inşası için planları, dişileri her birinin birçok yumurta bırakmaya hazır hale getirilmesi için hazırlanan protokolü ve odaları kullanma protokolünü sağlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Sinekler hazırlanması 1. tahlil edilecek

  1. Kültür standart pekmez uçar / 25 ° C ve% 65 nemde belirlenen inkübatör de Mısır unu medya. Şişeleri doldurmadık özen gösterin. Örneğin, dar bir gıda şişenin içine 8 kadın ve 6 erkek koydu.
    Not: Burada kullanılan "ince gıda şişenin" 2.3 cm'lik bir iç çapa sahiptir. Biz genellikle her şişenin içine sinek gıda yaklaşık 10 ml dağıtılmıştır. Kullandığımız sinek yemek tarifi burada açıklanmıştır: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html.
  2. 2 - Şekil 1E gösterildiği gibi 3 gün kadın eclosion sonra, taze maya hamurlu şişeleri hazırlamak. % 0.5 propionik asit 10 ml aktif maya 6 g karıştırılarak yaş maya hamur yapın. Gıda şişeleri yanağında üzerine maya macun uygulamak için bir spatula kullanın. şişeleri içine 25 erkek - 20 35 eclosed kadın birlikte - 30 toplayın.
    1. Genel olarak, dişiler toplanır aynı flakonlarından erkekleri toplamak(Böylece zaman ve çaba kaydetmek için). Erkeklerin doğurganlık konusunda endişe var, ancak bunun yerine WT erkek kullanın. Ayrıca, maya macunu her gün taze hazırlayın nedenle yumurta üretimini stimüle etmek için önemlidir.
  3. Sinekler ısıya duyarlı olmadıkça, 25 ° C'de,% 65 nemde toplanan kadın / erkek koruyun.
  4. ~ 4 Sonra - 5 gün, kadın yumurtlama deneyler için hazır olup olmadığını görmek için şişeleri kontrol edin. Gıda ortamının yüzeyi aktif gıda burrowing larva ıslak olduğunda hazır olduklarında (- F Şekil 1E bakınız).
    Not: Gıda yüzeyi ıslak ve larvaları ile tarama hale geldiğinde Dişiler genellikle döşeme yumurta kesinti. Bu adım dişiler istenilen doku ile alt tabakaları karşılaştıklarında çok yumurtalarını bırakmak için hazır olacağını garanti (örn., ~% 1 agaroz).

2. Odası İnşaat, Montaj, Tahlil Kur

  1. (Bir atölye akrilik yumurtlama odaları inşa Fi varşekil 1A - D). Farklı parçaların mühendislik çizimi Ek Şekil 1'de gösterilmiştir -. 3 Yüksek çözünürlüklü resimler de burada bulunabilir (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
  2. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, bölmenin yükleme (üst) parça halinde plastik levhalar yerleştirin. Yükleme bireysel yumurtlama arenalarda içine uçarken Bu alt yüzeyi olarak hizmet vermektedir.
  3. CO 2 pad üzerinde kadın uyutmak ve her yumurtlama arenaya bunları tek tek yükleyin. Sinekler CO 2 kurtarmak ve yeni ortama acclimated hale için ~ 30 dakika bekleyin.
  4. agaroz substratlar hazırlayın.
    1. kolaylık sağlamak için, 55 ° C su banyosunda eritilir% 1 agaroz bir premade şişe tutmak.
    2. 50 ml konik bir tüp içine hazır sükroz solüsyonu (2 M) istenilen miktarda ilave edin ve agaroz uygun miktarda ile karıştırılması. Örneğin, 150 mM sükroz alt-tabaka, pla hazırlamakce 750 tüp içine 2 M sukroz çözeltisi ul ve ardından 10 mi işaretine kadar agaroz ile tüp doldurun.
    3. aynı şekilde, düz alt-tabakanın hazırlanması yerine sükroz solüsyonu damıtılmış su ilave edilir.
      Not: Bu protokol agaroz nihai konsantrasyon az% 1 'den daha azdır. % 1,1 ve iki yüzeylerde aynı agaroz konsantrasyonu olduğu - o ~ 0.9 içinde olacak şekilde kontrol edilir olarak bizim deneyim, agaroz tam konsantrasyonu çok uzun fark etmez.
  5. Şekil 1D görüldüğü gibi her bir çukur içine odası ve pipet agaroz substrat 1000 ul substrat (alt) parça al.
  6. agaroz ~ 30 dakika boyunca katılaşmaya izin verin.
  7. agaroz yüzeyler ve sinekler hazır olduğunda, yumurtlama odasının her üç parçalarını birleştirmek ve ardından plastik levhalar çıkar.
  8. sinek kuluçka odaları yerleştirin.
    Not: yumurtlama deney uzunluğu deneyimlerini bağlı olarak değişebilirzca ihtiyacı var. (- 16 saat 14), tipik olarak deney O / N çalıştırın. Ayrıca, yumurtlama tercihleri ​​sirkadiyen zamanlama önemli etkisi gözlenmemiştir.
  9. Odasına CO2 enjekte kadın anestezisi. , Odasına sökün sinek morguna içine anestezi sinekler atın (yani., Boş kahve, bazı mısır yağı ile dolu olabilir). Kayıt tutulması sonuçların fotoğraflarını çekmek (bakınız Şekil 2).
  10. elle yumurta sayısını ve analiz için tercih endekslerini hesaplamak. Olarak tercih indeksi hesaplamak (N - N b) / (N + N b) N ve N b sırasıyla sitede vs. sitesi b yumurta sayısını temsil eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yumurtlama odaları birçok parçadan oluşur: bir alt tabaka (alt) parçası, bir bölücü (orta) parçası, bir yükleme (üst) parça ve 2 sürgülü kapı (Şekil 1A - D). Bu parçalar yumurtlama deneyler daha önce bağımsız kurulum sinekler ve yüzeyler için kullanılır. Şekil 1F dişi sineklerin yumurtlama için hazır olduğunda şişeler nasıl görünmelidir gösterir. Sinekler düz alt-tabaka ve bir sükroz içeren alt-tabaka arasında bir seçim verildiğinde, dişi sağlam ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

odaları ve burada açıklanan protokoller önceki yumurtlama deneyleri üzerinde çeşitli geliştirmeler var. Birincisi, önemli ölçüde tek hayvan tercihlerini analiz etmek ve verimi arttırmak. Her oda 30 tek kadın tahlil edebilir ve bir saat kurmak için daha az sürer. İkincisi, önceki yöntemlere göre yumurtlama tercihleri ​​tutarlılığını artırmak. arena boyutlarının standardizasyon, yüzeyler arasındaki yumurtlama substratların boyutu ve mesafe daha kolay farklı deneysel gün arasında ve farklı araştırma gruplarının sonuçları k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Duke Physics Shop'a, özellikle de Phil Lewis'e, davranışsal aygıtları ve ekleri inşa etmemize ve çizimi oluşturmamıza yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından R01GM100027 numaralı ödülle finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ultra Saf Agaroz Invitrogen16500-500
SükrozSigmaS0389
Su banyosu ve nbsp;Fisher15-462-6Q
LifeCam Sinema web kamerasıMicrosoftH5D-00013
Kırmızı LED'lerCreeC503B-RAN-CA0B0AA1
Yumurtlama odalarıÖzel Yapı
Kamera tutucularÖzel Yapı LED
tutucularÖzel Yapı
Fly şişeleri (dar)CenevreMÖ 32-116

Kaynaklar

  1. Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
  2. Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  3. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
  4. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  5. Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
  6. Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
  7. Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
  8. Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
  9. Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
  10. Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
  11. Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
  12. Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
  13. Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
  14. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
  15. Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Drosophila YumurtlamaYumurtlama KamaralarBireysel Sinek DeneyiSukroz Substrat TercihiKarbondioksit AnestezisiAgaroz Substrat Haz rlamaOptogenetik EkipmanlarVideo Kay t D zenekleriTercih ndeksi Hesaplamas
Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.