Kimerik Yapılar HSV-aracılı Transgen İfade Farelerde GPCR Heteromers Davranışsal Fonksiyon Eğitim için

LSD, psilosibin ve meskalin olarak halüsinojenler, insan bilinci, biliş ve duygu ^7-9 önemli değişikliklere neden olmaktadır. Genetik ya da farmakolojik ya yaklaşımlarla serotonin _5-HT2A reseptörü sinyallemesinin inaktivasyonu belirgin iki kemirgen modellerinde ^3,10 bölgesindeki halüsinojenler davranışsal tepkileri zayıflatılmış ve ¹¹ insanlarda neden olur. Halüsinojenler, diğer reseptör alt-tipleri ⁸ bağlanan, ancak _5-HT2A reseptörü, bu kimyasal maddelerin benzersiz davranış aktivite için gerekli olarak kabul edilir.

Grup II metabotropik glutamat reseptörleri (yani., MGlu2 ve mGlu3) halusinojenler moleküler mekanizması ve psikoz ¹² altında yatan onların ayrılmaz rolüne ilişkin önemli ilgi hedef olmuştur. Daha önce, mGlu2 protein (mGlu2-KO fareleri) herhangi bir ifade ile farenin hal hücresel ve davranışsal etkilere karşı duyarsız olduğu gösterilmiştirlucinogens ^5. Ayrıca, _5-HT2A ve mGlu2 reseptörleri serotonin ve glutamat ligandlan, canlı hücreler ^1,2 G protein bağlama modelini modüle geçtiği belirli bir heteromerik kompleks oluşturduğunu ileri sürülmüştür.

Yapısal olarak, zar-ötesi (TM) etki 4 ve mGlu2 5 _5-HT2A reseptörü ^5, heteromerik oluşumunda önemli bir rol oynamaktadır. Buna ek olarak, daha fazla araştırma mGlu2 bölgesinin TM4 hücre içi ucunda yer alan, üç kalıntıları hücreler ⁶ canlı _5-HT2A reseptörü -mGlu2 heterokompleks oluşturmak için gerekli olduğunu göstermiştir.

Heterolog ifade sistemlerinde görülen Bu bulgulara dayanarak, burada test etmek için, vahşi tip mGlu2 ve mGlu2-KO farelerde frontal kortekste mGlu2 / mGlu3 Şimerik yapıların HSV-aracılı ifade kullanımını tarif _5-HT2A ile heteromerik oluşumu ve mGlu2 için gerekli olanhalüsinojenik _5-HT2A reseptörü agonistleri tarafından neden kafa seğirme davranışı.

NOT: Hayvan ıslahı ve bakımları için tüm prosedürler Sina Dağı'nda Tıp Icahn Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönetmeliğine göre yapılmıştır. prosedür boyunca steril eldiven kullandığınızdan emin olun.

1. İlaç ve Virüs Hazırlık

1. İlaç Hazırlama
   1. 12.9 ml% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde 100 mg / ml Ketamin 1.35 ml ve 20 mg / ml ksilazin 0.75 ml eritilmesi ile 15.0 mi, ketamin / ksilazin anestezik hazırlayın. Iyice çözüm karıştırmak.
2. Virüs hazırlanması
   1. MGlu2 Clone ve mGlu2ΔTM4N standart protokoller ^daha önce ⁶ açıklanan aşağıdaki bir bicistronic herpes simpleks virüsü (HSV) vektörü içine oluşturur. Daha önce tarif edildiği gibi ^6,13,14 viral partikülleri paketleyin. Kalıntıların Değişiklik Ala-677 ^4.40, mGlu2 Ala-681 ^4.44 ve Ala685 ^4.48 Ser686 ^4.40, Ph içinE690 ^4.44 ve Gly-694 ^4.48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) 'de ^daha önce ⁶ tarif edilmiştir.
      Not: Bu, daha önce kimerik yapısı, HA-mGlu2ΔTM4N sağlam G-protein-bağlı ⁶ Sinyal plazma membranında eksprese edildiği gösterilmiştir.
   2. viral vektörlerin saklayın -80 ° C kullanılmadığı zaman. Daha sonra çözülme viral buz üzerinde vektör ve 10 ul kısma bölmeyin. cerrahi işlem için, buz üzerinde tutmak.

2. Cerrahi

1. cerrahi Hazırlık
   1. (1.1.1 ayrıntılar için bkz) fare tartılır ve ketamin / ksilizin kokteyl uygun dozda ile fare enjekte.
   2. Düzgün anestezi olmadığını görmek bir tepki ortaya çıkarmak için yapamaz fare düzgün anestezi ise, ağrı yanıt ayak ve kuyruk sıkmak için fareyi kontrol edin.
   3. makası kullanarak burun ucu kafatası tabanından fare kafasını tıraş. Fare af oftalmik jel uygulayınfare körlüğü önlemek için terward.
   4. stereotaksik çerçeve üzerine her şırınga yükleyin. onlar 10 derece uzakta normal böylece daha sonra stereotaksik çerçeve her kolun dik kısmını yatırın. iğneler birbirine bakacak şekilde, kollar eğik olduğundan emin olun.
   5. % 70 etanol ile iğne doldurarak her bir şırınga temizleyin. Şırınga temiz olduğundan emin olmak için iğne en az üç kez doldurun.
   6. İğne temizlendikten sonra, çift distile _H2O ile iğne doldurarak iğne floş Bir kez kızardı, çift distile _H2O 1.3 ul her iğne doldurun Çift distile _H2O 0.3 ul serbest bırakmak için şırınga pistonu Büküm İğnenin ucunda su boncuklar, dikkatlice su uzakta silin. hiçbir şey şırınga çıkarsa, aşağı tamamen pistonu itin ve şırınga temizlik tekrarlayın.
   7. Su ile doldurduktan sonra, daha sonra şırınga ile dolum şırınga yukarı çekinHavanın 0.5 ul.
   8. Hava ve su şırınga kez, dikkatle virüs çözümü 1.3 ul şırınga doldurun. Bu noktada şırınga toplam hacim 2.8 ul olduğundan emin olun. Yine virüsün 0.3 ul serbest bırakmak için şırınga ucu bükün. İğnenin ucundaki sıvı boncuklar, dikkatle sıvıyı uzak silin. hiçbir şey şırınga çıkarsa, aşağı tamamen pistonu itin ve şırınga temizlik tekrarlayın.
2. cerrahlık
   1. Kafatası seviyesi ve düz olacak şekilde stereotaksik çerçeve ayarlamak için emin olun, stereotaksik çerçeve için fareyi takın. maruz kafa derisi povodine-iyot uygulayın. Bir neşter kullanılarak, maruz traş alanı içinde kafatası orta hat boyunca sagittal bir kesi yapmak. Sonra kafatası maruz kalır emin olmak için kesi yerinde cilde büret kelepçeleri takın.
   2. Ve dikişler maruz periost uzak çözmek için H ₂ O ₂ kullanınkafatası. Şimdi Bregma ve dikişler görünür olduğundan, kafatası seviyesi olduğundan emin olmak için stereotaksik çerçeve ayarlamak için emin olun.
   3. bregma ile şırınga iğne uçları hizalayın ve bregma koordinatlarını kaydetmek. iğneler takılı olacak koordinatlarını hesaplamak.
      1. Rostral-Cauldal (RC) düzlem için, kaydedilen RC Bregma koordinatları (bregmadan 1,6) 1.6 mm ekleyin. Dorsal-ventral (DV) düzlem için, kaydedilen DV Bregma koordinatları (bregmadan -2.4) 2.4 mm çıkarın.
      2. Son olarak, Medial Lateral (ML) düzlem için, kaydedilen ML Bregma koordinatları (bregmadan 2,6) 2.6 mm ekleyin. Bu ikili bir enjeksiyon olduğu gibi tüm koordinatlar için, hem sol ve sağ koordinatlarını kaydetmek için emin olun.
   4. İstenilen koordinatlarına iğne getir. iğneler sokulur ve bir matkap ile işaretlenmiş alanların matkap olacak nereye yerleri işaretleyin.
   5. Bir pamuk uçlu aplikatör wi ileherhangi bir aşırı kan ya da kemik parçasını uzağa pe.
   6. iğne uçları beynin yüzeyine dokunmadan kafatasına iğneler getirin. Sonra yavaş yavaş onları düşürücü istenilen koordinatlara iğneler indirin.
   7. iğne istenen koordinatlara olduğunda, yavaş (toplam 0.5 ul) 5 dakika boyunca dakikada iğne 0.1 ul pistonu bükerek enjekte edilir.
   8. Enjeksiyon yapıldıktan sonra başka bir 5 dakika kortekste şırınga bırakın.
3. Up / kapama Bakımı
   1. sürekli ve yavaş yavaş fare korteks iğne çıkarın. Sonra stereotaksik çerçeve fare kaldırmak.
   2. forseps cilt flep kapmak ve birlikte koyun ile daha sonra kesi deri taban kanatlarına siyanoakrilat (dermal yapıştırıcı) uygulayın ve.
   3. siyanoakrilat kurumasını bekleyin. ısıtma yastığı Surg eğer isteğe bağlıdır (bir ısıtma yastığı üzerinde kafes içinde fare yerleştirinnik paketi 37 ° C oda sıcaklığında altında tutulur - Aksi gerekli değildir). yatak cerrahi bölgeye bağlı olmadığından emin olmak için bir kağıt havlu üzerine fare koyun emin olun.
   4. İşlemden sonra 60 dakika - cerrahi işlemin süresine bağlı olarak, fareler 30 içinde anestezi dışında olduğundan emin olun. Ameliyatı takiben, hayvan kendi kafes yerleştirilir ve kurtarmak için kendi odasına dönmeden önce bilinçli hale gelene kadar izlenir. Onlar beyin biyokimyasal yollar bazı değiştirerek bizim deneylerin sonuçlarını değiştirebilir çünkü hiçbir analjezikler, postoperatif kullanılmaktadır. Ancak ameliyat günü anestezi kurtarmak kadar, hayvanlar izlenir, ve enfeksiyon ve ağrı / sıkıntı değerlendirilmesi belirtileri günlük operasyon sonrası.

3. Kafa Seğirme Tepki Deneyi

1. Kurmak
   1. 3 gün stereota sonra - 2 10:00 ve 02:00 PM arasındaki tüm davranış testleri yürütmekViral parçacıklar CTIC enjeksiyonu.
   2. Çözündürün (±) -1- (2,5-dimetoksi-4-iyodofenil) 2.0 mg / kg bir% 0.9 salin çözeltisi -2-aminopropan hidroklorür (DOI). Ayrıca% 0.9 tuzlu su çözeltisi hazırlayın.
   3. Herhangi bir yatak olmadan bir ev kafes (28 x 18 x 15 cm) hazırlayın ve video kamera görüntüle doğrudan ana kafes üstünde olacak şekilde bir tri-bölmesini kullanarak, bir kamera ayarlayın.
   4. Deneyin başlamasından önce en azından 4 saat oda fareler alıştırarak.
   5. Baş seğirme kaydetmek için kamera ayarlayın.
2. deneme
   1. Bir evde kafes üzerinden doğrudan böylece kamerayı yerleştirin. Tüm ana kafes görüş alanında olacak şekilde kamera kalibre edin.
   2. fare tartılır ve% 0.9 tuzlu su ya da DOI ya uygun dozu (0.01 ml / g) ile periton içine fare enjekte edilir. Not: Fare 25 gram ağırlığında durumunda, 0.25 ml lik bir toplam hacime dozunun uygulanması.
   3. fo evlerine kafes geri her fare yerleştirinR 10 dk. Boş ev kafesin merkezine 10 dakika, yer fare sonra kameranın görüş alanında kör noktalar vardır olduğunu doğrulamak. Kamerada basın kaydı. odayı terk.
      NOT: Fare hareketleri ve orada çeşitli davranışsal tepkileri (... Kafa seğirme, kulak çizik vb DOI tarafından uyarılan davranışsal tepkilerin tam listesi için Gonzalez-Maeso ark 2007 ek veri tablosunun 1'e bakınız) ^3, kaydedilmiş olacak 30 dk. Nedenle, kaydedilen görüş alanında kör noktalar vardır önemlidir.
   4. 30 dakika orijinal ev kafesine geri kamera ve yer fare kayıt durdurduktan sonra. Her fare için bu işlemi tekrarlayın.
3. gözden geçirmek
   1. Bantlar fare deneysel koşullara kör her hakem inceleme var) (yani., Baş sırasında kullanılan ilaçlar deney veya intrakranial enjeksiyon sırasında kullanılan virüs seğirme). El ile her kafa Throug seğirme kayıthout videosu.
      NOT: Baş-seğirme bir fare (ek videosu) tarafından yapılan hızlı sarsıntı baş hareketi olarak tanımlanır.
   2. Her fare için, kör hakemlerin üç toplamları nihai HTR yanıtını ortalama. Daha sonra grup, bu deneysel koşulu ile değerler ve istatistiksel analiz (yani., T-testi veya ANOVA) yürütmek.

Önceki bulgular halusinojenler tarafından güvenilir ve sağlam ortaya bir fare davranış cevabı baş-seğirme olduğunu göstermektedir ve bu 5-HT 2A -KO fareler 3 yoktur. Ayrıca, DOI ve LSD halüsinojenik 5-HT2A agonistlerin kafa seğirme yanıtı anlamlı mGlu2-KO farelerde 5 azaldığını göstermiştir. Bununla birlikte, her ne kadar önceki bulgular ikna edici çözülemediğini canlı farelerde gibi bu yapısal düzenleme hareket ile 5-HT2A ve mGlu2 transfekte edilmiş hücrelerin 1,2,15 in vitro bir heteromerik kompleks olarak monte edilir olduğunu göstermektedir. Tam olarak bu Manip incelenmesini mGlu2-KO farelerde frontal kortekste mGlu2 ya mGlu2ΔTM4N ya halüsinojenik 5-HT2A reseptör agonistleri, ekspresyonu ile sebep olunan psikoaktif benzeri etkiler 5-HT2A reseptör -mGlu2 heterokompleks rolünü anlamak içinulation davranışı düzenler.

Fareler sadece yeşil floresan proteini (GFP) ve mGlu2 ya mGlu2ΔTM4N ya veya GFP ifade eden bisistronik HSV içi frontal kortikal enjekte edildi. İlk olarak, bir virüs, fare frontal korteksinde mGlu2 ya mGlu2ΔTM4N (Şekil 1A ve 1B) aşırı eksprese olduğu doğrulandı. Önce 5 gösterildiği gibi, DOI ile indüklenen baş seğirme davranışı boş vektör HSV-GFP ile enjekte mGlu2-KO farelerde mevcut değildi. Özellikle, halüsinojenik 5-HT2A agonisti DOI ile indüklenen baş seğirme yanıtı aşırı eksprese mGlu2 mGlu2-KO farelerde kurtarıldı ama mGlu2ΔTM4N, frontal kortekste GFP (Şekil 1C) ifade eden hayvanlarda görülene kıyasla değil. Birlikte, bu bulgular, frontal kortekste 5-HT2A -mGlu2 reseptör kompleksi psikoz benzeri durumları düzenlenmesi için önemli olduğunu düşündürmektedir.

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1">
5-HT2A ile bir reseptör gibi mGlu2 alıcısına heterokompleks. İfade olarak mGlu2 1. Ekspresyon Şekil halüsinojenik ilaçların neden olduğu psikoz benzeri davranış için gereklidir. (A), frontal kortekste HSV-aracılı transgen ekspresyonunun Örnek görüntüsü. GFP ifade eden, HSV-mGlu2, frontal korteks içine enjekte edildi ve GFP tanımı immunositokimya, ölçek çubuğu, 200 um ile ortaya çıkarılmıştır. (B) mGlu2-KO farelerde Fare frontal korteksinde transgen ekspresyonunu HSV-aracılı ve anti-mGlu2 tepkime Western Blot ile ölçülmüştür. MGlu2 alıcısına karşı birincil antikor özelliği, daha önce nakavt fareler 6 doğrulanmıştır. Metabotropik glutamat reseptörleri, kovalent bağlanmış homodimerleri oluşturan GPCR'ler bulunmaktadır. Biz bir monomer (100 kDa) 6 olarak mGlu2 immunoreaktivitesini ölçülür. (Cı </strong>), viral aracılı mGlu2 ekspresyonu ancak mGlu2ΔTM4N, mGlu2- KO farelerde frontal korteksinde önemli ölçüde halüsinojenik 5-HT2A agonist DOI (n = 4, grup başına) ile indüklenen baş seğirme yanıtı kurtarır. *** P <0.001; ns, önemli değil; Tek yönlü ANOVA Bonferroni post hoc testi. Hata çubukları SEM Şekil Moreno ve arkadaşları (2012) modifiye edilmiş temsil 6. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Video 1. Kafa Twitch Tepki. (Sağ indirmek için tıklayın). CD-1 WT fareler 2.0 mg / kg DOI enjekte ve bir kafese yerleştirildi baş seğirme yanıtı ortaya çıkarmak için (duvar, iki kafesleri arasında karartılmıştır) (davranış sonrasında ortaya çıkan *).

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.