Method Article

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

DOI:

10.3791/53732

⸱

March 3rd, 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, insan hücrelerindeki endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerini tespit etmek ve bu protein seviyelerini fiksasyon (paraformaldehit, aseton veya metanol fiksasyonu) kullanarak dolaylı immünofloresan boyama yoluyla sentromer-kinetokorlarda ölçmek için protokolleri rapor ediyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Sentromerler" ve "kinetokorlar", hücre bölünmesi sırasında kromozomların iğ ile birleştiği bölgeyi ifade eder. Hücre döngüsü sırasında sentromer-kinetokor proteinlerinin doğrudan görselleştirilmesi, bu proteinlerin mekanizma(lar)ının araştırılmasında temel bir araç olmaya devam etmektedir. Floresan mikroskobundaki gelişmiş görüntüleme yöntemleri, sentromer-kinetokor bileşenlerinin dikkate değer bir çözünürlüğünü sağlar ve sentromerlerin ve kinetokorların spesifik moleküler bileşenlerinin doğrudan gözlemlenmesine izin verir. Ek olarak, spesifik antikorlar kullanılarak dolaylı immünofloresan (IIF) boyama yöntemleri bu gözlemler için çok önemlidir. Bununla birlikte, IIF protokolleri hakkında çok sayıda rapora rağmen, çok azı spesifik sentromer-kinetokor proteinlerinin problemlerini ayrıntılı olarak tartışmıştır. 1-4 Burada, paraformaldehit fiksasyonu ve IIF boyama kullanarak insan hücrelerindeki endojen sentromer-kinetokor proteinlerini boyamak için optimize edilmiş protokolleri rapor ediyoruz. Ayrıca, aseton veya metanol fiksasyonuna maruz kalan insan hücrelerinde Bayrak etiketli eksojen CENP-A proteinlerini tespit etmek için protokoller rapor ediyoruz. Bu yöntemler, insan hücrelerindekiler de dahil olmak üzere endojen sentromer-kinetokor proteinlerinin ve Bayrak etiketli CENP-A proteinlerinin tespit edilmesinde ve miktarının belirlenmesinde faydalıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Sentromerler" Klasik genetikte bastırılmış mayoz rekombinasyon bölgeleri olarak tanımlanan ve daha sonra mitoz sırasında doğru kromozom ayrımı önemli bir rol oynar mitotik kromozom birincil daralma olarak kabul edildi. "Kinetokorlar" elektron mikroskobu ile ortaya koyduğu gibi, sentromerlerinin yüzeyinde mikrotübül bağlanan katmanlı yapılar olarak tarif edildi; "Kinetokorlar" sonra mitotik kromozom sentromer de lokalize makromoleküler kompleksi olarak tanımlandı. omurgalılar arasında sentromerik DNA dizilerinin dramatik farklılığa rağmen, kinetochore yapısı ve bileşimi yüksek oranda korumalıdır. iğ mikrotübüller ve kinetokor oluşumunu uyarır arasındaki dinamik etkileşim mitoz sırasında kromozomların sadık ayrımı için gerekli olan ve sentromer-kinetochore fonksiyonu kurşun kusurları anöploidi ve böylece kanser olduğunu.

En ökaryotlarda sentromerResim tanımlanan DNA sekansına sahiptir, ancak 171-bp α-uydu DNA'dan oluşan tekrarlanan alphoid DNA'nın büyük diziler (0,3-5 Mb) oluşmaktadır. Maya tomurcuklanma dışında, sentromer kimliği olmayan DNA dizisi tarafından değil histon H3 varyantı CenH3 içeren özel bir nükleozom varlığı ile elde edilir (sentromer protein A [CENP-A] insanlarda). 5 CENP-A nükleozom lokalize 171-bp α-uydu DNA memeli kinetokorlar 7 ve bağlama iç plakası. Aktif sentromerler gerektiren CENP-A içeren bir araya mili kontrol noktasından mitotik iğ ve sonraki devir ilerlemesine kromozomların eki düzenleyen, bir kurucu sentromer ilişkili ağ (KİAN) ve kinetochore proteinlerin işe yönlendirmek için nükleozom.

Yukarıdaki deliller ışığında, CENP-A sentromer 8 epigenetik işareti olduğu ileri sürülmüştür; Bununla beraber, işlem hangi CENP-A i zikredilennBu sentromerik DNA, ve dahil edilmek için sorumlu olan faktörler henüz iyi karakterize edilmemiştir. Kısa bir sentromer hedefleme alanı (CATD) CENP-A bölgesini kat histon bulunur ve CATD ile H3 karşılık gelen bölgenin yerine sentromer doğrudan H3 için yeterlidir. 9 Çeşitli çalışmalarda post-translasyonel fonksiyonel rolleri önerilen modifikasyonu CENP-A 12-16 (PTM); Ancak, sentromer için istihdamında CENP-A bu PTMS moleküler mekanizmalar henüz ortaya konamamıştır. Daha önce CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligaz aktivitesi sentromer için CENP-A CENP-A K124 ubiquitylation ve lokalizasyonu için gerekli olduğu bildirilmektedir. 17

Kinetochore proteinlerin keşfi ve karakterize kromozom segregasyonu ile ilgili yeni bir bakış açısı yol açmıştır. 18 en fazla 100 kinetochore bileşenleri çeşitli yaklaşımlarla omurgalı hücreler tespit edilmiştir. 19,20 Altındafloresan mikroskopi kinetokorlar montaj ve işlevi de hücrelerin içinde her sentromer kinetochore proteinler ve protein-protein ağının hücresel fonksiyonları karakterizasyonu geliyor nasıl ayakta. 19 Doğrudan görselleştirme ve gelişmiş görüntüleme yöntemleri sentromer kinetochore bileşenlerin olağanüstü çözünürlük sağlar ve izin sentromerler ve kinetokorlar spesifik moleküler bileşenleri doğrudan gözlem. Buna ek olarak, özel antikorlar kullanılarak dolaylı immünofluoresan Yöntemi (IIF) boyama Bu gözlemler için çok önemlidir. Bununla birlikte, belirli bir sentromer kinetochore proteinlerin ayrıntılı problemlerinde tartışıldığı IIF protokolleri, birkaç ilgili olarak çok çeşitli raporlara rağmen. 1-4 Böylece geliştirilmesi ve spesifik olarak her bir sentromer kinetochore protein analiz IIF boyama ve kantitatif IIF tahlili yöntemleri rapor son derece önemlidir. IIF boyama, tek ilgilenilen proteinin kaybını önlemek için boyama protokolü ile devam etmelidir veyaHücrenin geri kalanı. Bununla birlikte, sabitleme zaman antigenik mahalleri yok eder ve farklı bir antikor-antijen kombinasyonları, bir fiksatif, yeterli çalışır, ancak çok iyi başka, 21 ve sabitleyici seçimi büyük ölçüde ilgi protein (ler) bağlıdır. Bu nedenle, farklı sabitleyici yöntemleri sentromer kinetochore proteinlerin IIF boyama önem taşımaktadır.

Dolaylı immunofloresans (IIF) boyama ve CENP-A ve Flag-künyeli eksojen CENP-A proteinleri ve insan hücrelerinde bu proteinlerin kantitatif dahil endojen sentromer kinetochore proteinlerin lokalizasyonunu gidermek için bir tahlilin Burada optimize yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, diğer türlerde sentromer kinetochore proteinlerin analizi uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu

  1. 6 oyuklu polistiren plaka bir cam kapak (22 mm x 22 mm) koyun. İsteğe bağlı olarak kat Aşağıdaki adımları uygulayarak kapak camına mitotik hücrelerin tutmak için (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız) suda Poli-L-Lizin ile cam kapak, w / v% 0.1,:
    Not: Optimal koşullar her bir hücre hattı ve bir uygulama için belirlenmelidir.
    1. su içinde Poli-L-lisin, ağ / hac% 0.1 ile aseptik kat kultur yüzeyi (0.4 mi / oyuk, 6 oyuklu polistiren plaka) eritin. Kültür yüzey da kaplama sağlamak için hafifçe sallayın.
    2. 5 dakika sonra, aspirasyon ile çözüm kaldırmak ve iyice steril doku kültürü dereceli su ile yüzeyin durulanması.
    3. hücreleri ve orta tanıtan önce kuru en az 2 saat.
  2. Tohum HeLa hücreleri 17 veya 6 oyuklu polistiren plaka konan bir kapak camı (22 mm x 22 mm) üzerinde 17,22 HeLa Tet-hücrelerini. Bu hücre yoğunluğu oyuk başına 5.4 x 10 5 olup olmadığını kontrol edin. Kültür hücreleri% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile yüksek glukoz DMEM.
    Not: En iyi sonuçlar için, ampirik tohumlama kullanmak için hücre yoğunluğu belirlemek.
  3. 18 saat% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
    Not: HeLa Tet-hücrelerini söz konusu olduğunda, dışsal genin transkripsiyon indükleyici (örneğin, tetrasiklin / doksisiklin) tetrasiklin / doksisiklin olmayan bu nedenle kültür hücreleri yokluğunda aktif ve pTRM4 aşın vektörü (Tablo 2 ile geçici olarak transfekte ) olan transkripsiyon TRE promotör tarafından regüle edilir (aşağıya bakın).
  4. tohumlama, transfect hücre sonra onsekiz saat şöyle:
    1. (20 uM tavlı stok, Tablo 1) 1.5 ul siRNA oligo karıştırarak çözüm A yapın ve / veya 2.0 ug plazmid (Tablo 2) 50 ul azaltılmış serum ortamında (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız), ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe .
      Not: Bu analizde,CA-UTR siRNA'lar (a 5 kanşımı 've 3' UTR, siRNA, Tablo 1) ko-transfekte Protocols 3 ve 4 (tartışma) kullanılmak üzere idi.
    2. Ben serum orta azaltılmış 50 ul (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız), ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe 0.75 ul transfeksiyon reaktifi karıştırarak çözüm B olun.
      Not: İsteğe bağlı bir adım transfeksiyon reaktif II ul 1.0 eklenmesidir (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız).
    3. birlikte çözüm A ve B karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
    4. Bir kez PBS ile kültürlenmiş hücreler yıkanır, ve daha sonra 6-çukurlu polistiren plakanın her bir serum ortamı, indirgenmiş 500 ul ekle. Şirketinden de bireyin her çözeltiler A ve B (örneğin, RNA ve / veya DNA-lipit kompleksi) karışımı ekleyin.
      Not: Nihai konsantrasyon 3.3 ug / ml (plazma) olduğu; 50 nM (siRNA).
    5. 4.5 saat boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe hücreleri. yüksek glikoz DMEM zekâ orta değiştirmekH,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin.
    6. Transfeksiyondan sonra 48-72 saat boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
      Not: En iyi sonuçlar için, tespitten önce, hücre büyümesi için kuluçka süresi deneysel olarak tespit edilmelidir, ve protein azalması ve / veya ekspresyon Western blot analizi ile teyit edilmesi gereklidir (Protokol 6).
    7. mitotik hücre analizi ilgi konusu ise, tespitten önce kültürlenmiş hücreler 24 saat paklitaksel (10 nM) ilave, ya tespitten önce kültürlenmiş hücreler 2.5 saat için TN16 (0.5 uM) ekleyin.

2. Hücre Sabitleme ve Immunofluorescent Boyama Endojen Sentromer-kinetochore Proteinler Algılama için (Paraformaldehyde Fixation)

  1. sabitleyici, tampon, ve reaktiflerin hazırlanması.
    1. Taze PBS, pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi 50 ml hazırlar.
      1. Havalandırılan kaputu bir karıştırma plakası üzerinde cam bir behere 1 x PBS, 40 ml ilave edilir. Isıtma sırasında stirrinyaklaşık olarak 60 ° C'ye kadar örn. ısıtılmış PBS paraformaldehid toz 2 g ekleyin.
      2. Toz hemen çözülür çünkü, toplam 1 N NaOH, 1 ml ilave edilerek yavaş yavaş pH değerini yükseltmek.
        Not: Çözelti NaOH ilave edildikten sonra temizler.
      3. paraformaldehit, serin çözülür ve çözüm filtre edildikten sonra.
      4. pH 7,4-1 N HCI ile pH ve 50 ml 1 x PBS ile çözeltinin hacmini ayarlar.
        Not: çözelti Alikolar dondurulmuş veya en fazla 1 ile bir hafta 2-8 ° C'de muhafaza edilebilir. Bu kullanılacak kadar çözelti, buzla soğutulmuş ve 4 ° C de muhafaza edilmelidir.
    2. 10 mM Tris-HCI, pH 7.5 içerir tampon KB1, 50 ml hazırlamak; 150 mM NaCI; % 0.5 BSA; ve% 0.5 Triton X-100.
      Not: BSA, taze ilave edilmelidir.
      Not: tampon KB serisi daha önceki raporlarda açıklanan tampon KB dayanmaktadır 1,2,4.
    3. 10 mM Tris-HCl tampon maddesi oluşur KB2, 50 ml hazırlamakpH 7.5; 150 mM NaCI; ve% 0.5 BSA.
      Not: BSA, taze ilave edilmelidir.
    4. DAPI (50 ng / ml) ihtiva eden tampon maddesi KB3 1 ml hazırlayın.
    5. 1 mg / ml p-fenilendiamin oluşan montaj orta, 100 ml hazırlamak; % 10 PBS ve% 90 gliserol.
      1. 1 N NaOH ile 9.8 1 x PBS, pH ayarlama çözeltisi içinde p-fenilendiamin çözülür, sonra gliserol ekleyin.
      2. Mağaza -80 ° C'de 1 ml'lik eş payları,. Işıktan koruyunuz.
  2. Hücre fiksasyonu için 48-72 saat sonrası transfeksiyon (Protokol 1 bakınız) aspirasyonu ile kültür ortamı çıkarın. bir kez PBS ile durulayın hücreleri. hücre yüzeyi rahatsız etmemek için kültür kuyularının tarafına PBS uygulanır.
    Not: Hücre tespit için en uygun zaman noktası deneysel olarak tespit edilmelidir.
  3. 4 ° C'de 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde hücreleri saptamak. yeterince kalan% 4 paraformaldehid kaldırmak için tampon KB2 ile iki kez hücreleri durulayın.
  4. permeabiOda sıcaklığında 30 dakika süre ile tampon KB1 örnekleri lize. Tampon KB2 bir kez hücreler durulanır, ve belirli olmayan bağlanma ek blok sitelerine oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir tampon KB2 ekleyin.
    Not: Tampon KB1 da engelleme önemli katkılarda bulunur.
  5. forseps kullanılarak 6 oyuklu polistiren plaka bir cam kapak (22 mm x 22 mm) çıkarın. hidrofobik bir bariyer kalem kullanarak her cam kapak numune etrafında hidrofobik bir bariyer oluşturmak üzere bir soluk yeşil kare ya da daire çizin, (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız). dokunmayın ya da etmeyin hidrofobik bariyer kalem ile hücrelere çok yakın olsun. Yeni 6-iyi polistiren plaka kapak cam koyun.
  6. (; Ayrıca Malzemeleri / Ekipman Listesi bkz 200: 100 1 1 seyreltme oranı) ve bir anti-CENP-B antikoru (1 seyreltme oranını: 400) ya da bir anti- birincil sentromer için antikor veya kinetochore proteini seyreltin sentromer antikor (AKA) (1 seyreltme oranı: 2.000) tamponu KB2 bir sentromer konum işaretleyici olarak.
    Not: En iyi sonuçlar için, nihai konsantrasyonBu çözelti içinde birincil antikor tion deneysel olarak tespit edilmelidir.
  7. Hücre örneği sokmak için seyreltilmiş primer antikor yeterli hacmi (yaklaşık 30 ul) uygulayın. 37 ° C 'de 1 saat süre ile hücre örneği inkübe edin. hücreleri tampon KB2 ile 3 kez durulayın.
  8. Her primer antikor karşı tamponu KB2 kullanarak, bir flüorofor-konjuge sekonder antikor (200: 100: 1 ile 1 seyreltme oranı) seyreltin.
    Not: En iyi sonuçlar için, bu çözelti içinde sekonder antikor nihai konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmelidir.
  9. Yeterli bir hacim hücre örneği sokmak için seyreltilmiş ikincil antikor (kapak camına yaklaşık 30 ul bir damla) uygulayın. 37 ° C 'de 1 saat süre ile hücre örneği inkübe edin. 30 dakika (beş 6 dakika yıkama) bir süre boyunca hücreleri ara KB2 ile 5 kez yıkayın.
    Not: (hücrelerin minimum kayıp için yani) En iyi sonuçlar için, optimum yıkama koşulu Empirica tespit edilmelidirLly.
  10. hücre örneği sokmak için DAPI (50 ng / ml) ihtiva eden tampon maddesi KB3 yeterli bir hacmi uygulanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca hücre örneği inkübe edin. hücreleri tampon KB2 ile 1-2 kez durulayın.
  11. Mikro slayt üzerine hücre örneği içeren cam kapak monte edin.
    1. Mikro slayt merkezinde montaj orta bir damla yerleştirin.
    2. hücre örneği sıvıyı çıkarın ve ellerini veya forseps kullanarak, mikro slayt merkezinde örnek yerleştirin. hava kabarcıkları kaçının.
    3. Bir kağıt havlu ile fazla montaj orta çıkarın.

3. Hücre C-terminali Fiksasyon ve Immunofluorescent Boyama Bayrak-etiketli CENP-A Proteinler (Aseton Fixation)

  1. Hazırlık
    1. buz soğukluğunda% 75 aseton hazırlayın.
    2. Taze% 0.5 kaymağı alınmış süt ve% 0.5 BSA içeren PBS (pH 7.4), 50 ml hazırlar.
    3. Taze% 0.1 kaymağı alınmış süt ve% 0.1 BSA içeren PBS (pH 7.4), 50 ml hazırlar.
    4. (PBS 1 ml hazırlayınpH 7,4) DAPI (50-100 ng / ml) ihtiva etmektedir.
    5. 2.1.5 tarif edildiği gibi montaj orta 100 ml hazırlayın.
  2. Hücre fiksasyonu için 48-72 saat sonrası transfeksiyon (Protokol 1 bakınız) aspirasyonu ile kültür ortamı çıkarın. bir kez PBS ile durulayın hücreleri. hücre yüzeyi rahatsız etmemek için kültür oyuğundaki tarafına PBS uygulanır.
    Not: Hücre tespit için en uygun zaman noktası deneysel olarak tespit edilmelidir.
  3. buz soğukluğunda% 75 aseton hücreleri saptamak, ve -20 ° C'de 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Oda sıcaklığında, 30-60 dakika boyunca, bir çeker ocak içinde cam kapak üzerinde kurutuldu hücreleri.
    Not: En iyi sonuçlar için, sabitleme ve hücre kurutma için gereken süre deneysel olarak tespit edilmelidir.
  4. hidrofobik bariyer kalem kullanarak her cam kapak numune etrafında hidrofobik bir bariyer oluşturmak üzere bir soluk yeşil kare ya da daire çizin, (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız). dokunmayın ya da etmeyin hidrofobik bariyer kalem ile hücrelere çok yakın olsun.
  5. blok nonspecIFIC PBS oda sıcaklığında 5 dakika için% 0.5 kaymağı alınmış süt ve% 0.5 BSA ihtiva eden eklenerek hücreler üzerindeki bağlanma sahaları.
  6. (: 1000 seyreltme oranı 1) ve bir anti-CENP-B antikoru (1 seyreltme oranı: 200) ya da ACA (1: 2000 seyreltme oranı PBS% 0.1 kaymağı alınmış süt ve% 0.1 BSA ihtiva eden kullanılarak, bir anti-Bayrak antikor seyreltik ) bir sentromer konum işaretleyici olarak.
    Not: En iyi sonuçlar için, bu çözelti içinde birincil antikor nihai konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmelidir.
  7. Hücre örneği sokmak için seyreltilmiş primer antikor yeterli hacmi (yaklaşık 30 ul) uygulayın. 37 ° C 'de 1 saat süre ile hücre örneği inkübe edin. 30 dakikalık bir süre içinde hücreler bloke edici tampon ile 5 kez yıkayın.
    Not: Hücreler PBS ile durulanır. En iyi sonuçlar (yani, hücre kaybını önlemek için) için, en iyi yıkama koşulları deneysel olarak tespit edilmelidir.
  8. yönelik bir florofor-konjuge sekonder antikor (200: 100: 1 ile 1 seyreltme oranı) seyreltinPBS,% 0.1 kaymağı alınmış süt ve% 0.1 BSA ihtiva eden ki her birincil antikor.
    Not: En iyi sonuçlar için, bu çözelti içinde sekonder antikor nihai konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmelidir.
  9. Hücre örneği sokmak için seyreltilmiş ikincil antikor yeterli hacmi (yaklaşık 30 ul) uygulayın. 37 ° C 'de 1 saat süre ile hücre örneği inkübe edin. PBS,% 0.1 kaymağı alınmış süt ve% 0.1 BSA içeren hücreler 2 defa yıkayın.
    Tek başına PBS ayrıca hücreleri yıkamak için kullanılabilir: edin.
  10. hücre örneği sokmak için DAPI (50-100 ng / ml) içeren PBS yeterli bir hacmi uygulanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca hücre örneği inkübe edin. PBS ile hücreleri 1-2 kez durulayın.
  11. 2.11 açıklandığı gibi mikro slayt üzerine hücre örneği içeren cam kapak monte edin.

4. Hücre N-terminal Fiksasyon ve immünofloresan boyama Flag-işaretli CENP-protein (Methanol eşdeğer)

  1. Hazırlık
    1. buz soğukluğunda metanol hazırlayın.
    2. TBS% 4 keçi serumu ihtiva eden (pH 7.4) hazırlayın.
    3. TBS DAPI (50-100 ng / ml) ihtiva eden (pH 7.4) 1 ml hazırlayın.
    4. 2.1.5 tarif edildiği gibi montaj orta 100 ml hazırlayın.
  2. Hücre fiksasyonu için 48-72 saat sonrası transfeksiyon (Protokol 1 bakınız) aspirasyonu ile kültür ortamı çıkarın. bir zamanlar TBS ile durulayın hücreleri. hücrelerin yüzeyine rahatsız etmemek için kültür kuyu tarafına TBS uygulayın.
    Not: Hücre tespit için en uygun zaman noktası deneysel olarak tespit edilmelidir.
  3. buz soğukluğunda metanol hücreleri saptamak, ve -20 ° C'de 6 dakika inkübe hücreleri. yeterli artık metanolün çıkması için TBS ile iki kez hücreleri durulayın.
  4. hidrofobik bir bariyer kalem kullanarak her cam kapak numune etrafında hidrofobik bir bariyer oluşturmak için bir soluk yeşil kare ya da daire çizin, (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız). dokunmayın ya da etmeyin hidrofobik bariyer kalem ile hücrelere çok yakın olsun.
  5. cel üzerinde spesifik olmayan bağlanma siteleri engellemek% 4 keçi serumu içeren ekleyerek TBS tarafından ls. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  6. (: 1000 sulandırma 1) ve bir anti-CENP-B antikoru (seyreltme oranı 1: 200) ya da:% 4 keçi serumu ihtiva eden TBS içinde bir sentromer Yer belirleyici olarak (2.000 seyreltme oranı 1) veya ACA, bir anti-Bayrak antikor seyreltilir .
    Not: En iyi sonuçlar için, bu çözelti içinde birincil antikor nihai konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmelidir.
  7. Hücre örneği sokmak için seyreltilmiş primer antikor yeterli hacmi (yaklaşık 30 ul) uygulayın. 37 ° C 'de 1 saat süre ile hücre örneği inkübe edin. 30 dakikalık bir süre içinde hücreler bloke edici tampon ile 5 kez yıkayın. En iyi sonuçlar (hücrelerin, yani çok az zarar), en iyi yıkama durumu deneysel olarak tespit edilmelidir.
  8. % 4 keçi serumu ihtiva eden TBS içinde her bir birincil antikor karşı bir flüorofor-konjuge sekonder antikor (200: 100: 1 ile 1 seyreltme oranı) seyreltin.
    Not: En iyi sonuçlar için, finaBu çözelti içinde, ikincil antikorun L konsantrasyon ampirik olarak belirlenmelidir.
  9. Hücre örneği sokmak için seyreltilmiş ikincil antikor yeterli hacmi (yaklaşık 30 ul) uygulayın. 37 ° C 'de 1 saat süre ile hücre örneği inkübe edin. engelleme tampon ile hücreleri 3 kez durulayın.
  10. hücre örneği batırmak için DAPI (50-100 ng / ml) içeren TBS yeterli hacim uygulayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca hücre örneği inkübe edin. TBS ile hücreleri 1-2 kez durulayın.
  11. 2.11 açıklandığı gibi mikro slayt üzerine hücre örneği içeren cam kapak monte edin.

5. İmmünofloresan Görüntü Gözlem, Acquisition, miktar tayini ve Analiz

  1. Bir 63X ve 100X yağ daldırma objektif, harici kompakt ışık kaynağı ve bir dijital CCD kamera ile donatılmış bir motorlu floresan mikroskop aracılığıyla hücre örneği gözlemleyin.
  2. Yazılımı kullanarak, deconvolution dahil görüntü elde etme ve işleme, gerçekleştirmeA veya Yazılımları B1 ve B2 (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız). Program B1 ve B2 kullanılan tüm komutlar için Yazılım A'da kullanılan tüm komutlar için ek kod dosyaları (5.2.1) bakın, Yan Kodu Files (5.2.2) bakın.
  3. Sentromer kinetochore proteinlerin sinyal ölçmek için daha önce tarif edilen yöntem, 23-25 ​​kullanarak (örneğin, sentromer de CENP-A sinyallerini geri kalan) Aşağıdaki küçük değişikliklerle:
    1. Seç sentromer-kinetochore proteinlerin alanı ve arka plan olduğunu şöyle:
      1. Mitotik hücre: (sentromer kinetochore bölge) DAPI ile boyanmış kromozom ile örtüşen seç alanı; (yani, sitozolik bölge) kromozom dışında ancak aynı tek hücrenin içinde (arka plan bölge) ve alan.
      2. Interfaz hücre: (sentromer kinetochore bölge) DAPI ile boyanmış kromatinli örtüşen seç alanı; (Kromatin dışında ancak aynı tek hücrenin içinde (arka plan bölge) ve alan yani sitozolik bölge).
        Not: Sırasıyla, Yazılım A veya Yazılım B2 alan seçimi için de yazmak Kod Files (5.2.1.4.3) ya da (5.2.2.6.4) Bkz.
    2. aşağıdaki formülü kullanın, bu görev için Yazılım A veya B kullanarak sentromer kalan sinyallerin yüzdesini ölçmek:
      sentromer kinetokor oluşumunu uyarır de sentromer-kinetochore protein sinyalleri Kalan
      figure-protocol-1
      b Arka sinyal parlaklık olduğu; s ACA veya CENP-B boyama ile teyit edilir seçilen alanın, sinyal parlaklığı nerede r örnek siRNA (ler) enjekte hücreler için referans ACA veya CENP-B sinyalleri; ve r ctrl Luc siRNA transfekte hücreler için referans ACA veya CENP-B sinyalleri.
      Not: daha önceki raporlarda açıklandığı gibi, bu analizde, CENP-B sinyalleri CUL4A referans sinyalleri kullanılır ve RBX1 edildi.
    3. kopyaladıktan sonra bu hesaplama için bir Excel dosyası kullanın ve yukarıda açıklanan sinyal kantitatif yazılımı ham veri yapıştırarak. Ayrıca Yan Kod Dosyaları görün: Ayrıntılar için (5.2.1.4) ve (5.2.2.6). Hesaplama bir örneği, Tablo 3 'de gösterilmiştir.
  4. Her bir ölçüm düzeyi için boyama ve görüntü alımı varyasyonu ortadan kaldırmak için en az 20 hücreleri analiz edin. Her hücre analiz için isteğe bağlı olarak farklı sentromer-kinetochore proteinler arasında bu değerleri karşılaştırmak için sentromer kinetochore sinyalleri kalan "ortalama değeri" kullanın.

Toplam proteinin 6 Western Blot Analizi

  1. Tampon A denatüre hücrelerin tekrar (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50 mM NaCI,% 0.5 Nonidet P-40,% 0.5 deoksikolat,% 0.5 SDS, 1 mM EDTA, ve tam EDTA'sız proteaz inhibitör kokteyli), 26 denek bir sonikasyon ve donma-çözülme süreci ve tedbire süspansiyonProtein konsantrasyonları şunlardır:
    1. sonikasyon işlemi için, 48-72 saat sonra, transfeksiyon ucunda bir 6-yuvalı polistiren plakanın iki kuyu toplanan hücreler tampon A 50 ul (Protokol 1 e bakınız). Topu boynuzu ve mikro uç ile donatılmış bir sonikatör İşlet bir örnek başına toplam 15 saniye aralıklı darbe süresi (görev döngüsü% 50) için (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız).
    2. dondurma-çözme işlemi için sıvı nitrojen ile dondurularak hücreleri ve oda sıcaklığında hücreleri eritin.
    3. ticari bir protein tahlil belirteci I veya II kullanarak protein konsantrasyonları ölçün (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız).
      Not: Lizatlar reaktif I ya da II ya da protein konsantrasyonları ölçümünde 1:10 oranında seyreltilir. Bu seyreltmede, tampon A içinde SDS bulunan bu ölçüm çok az veya hiç etkileşim gösterir.
  2. 2 x ya da 4 x SDS-PAGE yükleme tamponu ile toplam proteinin 20-30 ug ihtiva lizat karıştırın. 27 kaynatın numuneleri5 dakika ve daha sonra elektroforez için SDS-poliakrilamid jel denatüre edici bir% 12.0 -15.0% üzerine yerleştirin.
  3. Daha önce tarif edilen bir Western lekeleme yöntemi kullanılarak bir PVDF zarı üzerine, SDS-PAGE ile ayrılmış proteinler aktarın. 17,24,27-31
    1. 1 x PBS içinde% 5 yağsız süt ile zar üzerinde spesifik olmayan bağlanma yerlerini bloke ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat süre ile seyreltilmiş birincil antikor çözeltileri ile membran inkübe edin. Her birincil antikor ayrıntılı bilgiler (örneğin, seyreltme oranı) malzemeler / Ekipman Listesi bölümüne bakınız.
    2. PBS-T tampon maddesi ile (çalkalama, her 3 ila 5 dakika inkübasyon) membran 3-4 kez yıkandıktan sonra (1 x PBS ve% 0.1 Tween-20), yakın kızıl ötesi (IR) bir karışımı içinde membran inkübe fluoresan boya-konjüge edilmiş ikincil antikor (1 seyreltme oranı: 20,000), DyLight-konjuge sekonder antikor (1 seyreltme oranı: 20,000), ve / veya yaban turpu peroksidaz (HRP) PBS-T içinde seyreltilmiş sekonder antikor (konjüge edilmiş; dilutiOda sıcaklığında 1 saat için 10,000): 1 oranı. Her ikincil antikor ayrıntılı bilgiler (örneğin, seyreltme oranı) malzemeler / Ekipman Listesi bölümüne bakınız.
  4. membranı 3 kez yıkayın ve sonra kızılötesi görüntüleme sistemi ve / veya immunoblot tespiti için kemilüminesans görüntüleme cihazı ile proteinlerin analiz etmek membran tarama (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız).
    1. kızılötesi görüntüleme sistemi kullanmak için, Ek Kod Files (6.4.1) bkz.
    2. Kemiluminesan görüntüleyici kullanmak için, Ek Kod Files (6.4.2) bkz. ultra-hassas geliştirilmiş kemiluminesans (ECL) substratı kullanın bu sistem için (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endojen CENP-A immünofloresans analizi CUL4A-E3 ligaz sentromer için CENP-A lokalizasyonu için gerekli olduğu hipotezini desteklemektedir
Son çalışmalar, CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligaz aktivitesi CENP-A ve sentromer için CENP-A lokalizasyonuna lisin 124 (K124) arasında ubiquitylation için gerekli olduğunu gösterdi. 17 Başlangıçta, interfaz-sentromer kompleksi (içen) ile izole edilmiştir Anti-CENP-a: kromatin immünopresipitasyon, 32-34 ve içen protei...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda pek çok çalışma, sabit hücreler için farklı nicel mikroskopi deneyleri geliştirdik. 42 Progress sentromer kinetochore biyoloji genellikle hücre içi mekânsal-zamansal düzenleme değişen işlevlerini yansıtan hangi proteinlerin sentromer özgü veya kinetochore özel fonksiyon anlaşılmasını gerektirir hücre döngüsü sırasında bu proteinler. Bu nedenle, burada IIF boyama ve özellikle farklı tedavi örneklerde geçerli olabilir endojen ve eksojen CENP-A proteinlerinin nispi seviyeleri, analiz için niceliksel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH hibe GM68418 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofektamin 2000Yaşam Teknolojileri / Invitrogen11668transfeksiyon reaktifi I
Lipofektamin RNAiMAXLife Technologies / Invitrogen13778transfeksiyon reaktifi II
Opti-MEM ILife Technologies / Invitrogen31985Azaltılmış serum ortamı, 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Yüksek glikozlu DMEM (Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta)Life Technologies/BioWhittaker12-604yüksek glikozlu DMEM, 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ısı ile inaktive edilmiş, ABD menşeiliLife Technologies/Gibco10082FBS (fetal sığır serumu)
Poli-L-Lizin ÇÖZELTİSİSIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-Lizin, %0,1 w/v, suda
UltraPure Damıtılmış SuLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Steril doku kültürü dereceli su 
Mikro Kapak camı (22 mm x 22 mm) Surgipath105Kapak camı (22 mm x 22 mm) 
6 Kuyulu Hücre Kültürü KümesiFisher/Corning Incorporated07-200-836 kuyulu polistiren plaka 
Penisilin, Streptomisin; SıvıFisher/Gibco15-140Penisilin-streptomisin
PAP KALEM Bağlanma YeriAD100.1Hidrofobik bariyer kalemi (immünofloresan boyamada su itici bariyer için)
Paklitaksel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Mitotik hücre analizi için taksol
, TN-16, mikrotübül inhibitörü (TN16)Enzo Yaşam BilimleriBML-T120Mitotik hücre analizi için TN16
BSA (sığır serum albümini)SIGMA-SLDRICHA7906Bloke edici reaktif
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Geçirgenlik için deterjan
ParaformaldehitSIGMA-SLDRICHP6148Fiksasyon reagant
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Nükleer boyama için
p-fenilendiaminSIGMA-SLDRICHP6001
VWR Mikro Kızakları monte etmek için, BuzluVWR Uluslararası48312-013Mikro slaytlar 
Anti-CENP-A antikoruStressgen/Enzo Yaşam BilimleriKAM-CC006Fare monoklonal antikoru; 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) seyreltme oranı
Anti-CENP-B antikoruNovus BiologicalsH00001059-B01PFare monoklonal antikoru; seyreltme oranı 1:200 (IIF, metanol/aseton fiksasyonu)-1:400 (IIF, paraformaldehit fiksasyonu)
Anti-CENP-B antikoru abcamab25734Tavşan poliklonal antikoru; seyreltme oranı 1:200 (IIF, metanol/aseton fiksasyonu)-1:400 (IIF, paraformaldehit fiksasyonu)
Anti-sentromer antikoru (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058İnsan sentromer antiserumu; 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H antikorununBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Tavşan poliklonal antikoru; 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H antikoruBD612142seyreltme oranı Fare monoklonal antikoru; 1:200 (IIF) seyreltme oranı
Anti-CENP-I antikoruN/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi KitagawaTavşan poliklonal antikoru; 1:1000 seyreltme oranı (IIF); Niikura ve ark., Onkogen, 4133-4146 (2006)
Anti-KNL1 antikoruNovus BiologicalsNBP1-89223Tavşan poliklonal antikoru; 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antikoruNovus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Fare monoklonal antikoru; seyreltme oranı 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antikoruGeneTexGTX110735Tavşan poliklonal antikoru; seyreltme oranı 1:100 (IIF)
Anti-Ska1 antikoruabcamab46826Tavşan poliklonal antikoru; 1:100 (IIF)
Anti-Flag antikoruseyreltme oranı SIGMA-ALDRICHF3165Fare monoklonal antikoru; 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) seyreltme oranı
Anti-Flag antikoruSIGMA-ALDRICHF7425Tavşan poliklonal antikoru; 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) seyreltme oranı
Anti-CUL4A antikorN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriTavşan poliklonal antikoru; 1:3000 (WB) seyreltme oranı; Shiyanov ve diğerleri, Biyolojik kimya Dergisi, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1 antikoruHücre Sinyali4397Tavşan poliklonal antikoru; 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH antikoruseyreltme oranı ChemiconMAB374Fare monoklonal antikoru; 1:5000 (WB) seyreltme oranı
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Fare IgGYaşam Teknolojileri/InvitrogenA11001florofor konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor)
Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Fare IgGYaşam Teknolojileri/InvitrogenA11005florofor konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor)
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG YaşamTeknolojileri/InvitrogenA11008florofor konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor)
Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Tavşan IgGLife Technologies/InvitrogenA11012florofor konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor)Yağsız
süt tozu (karanfil tozu sütü için onaylanmış ikame)Fisher ScientificNC9255871 (Yeniden Sipariş No. 190915; Lot # 90629)Yağsız süt
Leica DM IRE2 motorlu floresan mikroskobu Leicamotorlu floresan mikroskobu 
HCX PL APO 63x yağa daldırma lensiLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 YAĞ PH 3 CS63X yağa daldırma lensi
HCX PL APO 100x yağa daldırma lensiLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 YAĞ PHE100X yağa daldırma lensi
Leica EL6000 kompakt ışık kaynağıLeicaFloresan uyarma için harici kompakt ışık kaynağı
ORCA-R2 Dijital CCD kamera HamamatsuC10600-10Bdijital CCD kamera 
Openlab sürüm 5.5.2 Bilimsel Görüntüleme Yazılımı Perkin Elmer/ImprovisionGörüntü gözlemi, elde etme, niceleme ve analiz için
Velocity sürüm 6.1.1 3D Görüntü Analiz Yazılımı Perkin Elmer/ImprovisionGörüntü gözlemi, elde etme, miktar tayini ve analizi için
Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyliRoche11873580001/11836170001Proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Protein konsantrasyonunun ölçümü için ticari protein tahlil reaktifi I (%2 SDS ile uyumlu)
Bio-Rad Protein TestiBio-Rad500-0006Protein konsantrasyonunun ölçümü için ticari protein tahlili reaktifi II (%0.1 SDS ile uyumlu)
Immobilon-FLEMD MiliporeIPFL00010transferi için PVDF membranı
IRDye 800CW Keçi Anti-Fare IgGLI-COR Biosciences926-32210IR floresan boya konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor); seyreltme oranı 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Keçi Anti-Tavşan IgGLI-COR Biosciences926-32221IR floresan boya konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor); 1:20000 (IIF)
Keçi anti-Fare IgG seyreltme oranı DyLight 549Fisher ScientificPI35507DyLight konjuge ikincil antikorIR floresan boya konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor); 1:20000 seyreltme oranı (İTF)
Keçi anti-Tavşan DyLight 649Fisher ScientificPI35565DyLight konjuge ikincil antikorIR floresan boya konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor); 1: 20000 (IIF) seyreltme oranı
Keçi anti-fare IgG-HRPSanta CruzSC-2005HRP konjuge sekonje sekonder antikorDyLight konjuge sekonje antikorIR floresan boya konjuge sekonder antikor (Afinite saflaştırılmış sekonder antikor) antikor); 1:10000 seyreltme oranı (IIF)
Keçi anti-tavşan IgG-HRPSanta CruzSC-2004HRP konjuge sekonje sekonder antikorDyLight konjuge sekonje antikorIR floresan boya konjuge sekonder antikor (Afinite saflaştırılmış sekonder antikor); 1:10000 seyreltme oranı (IIF)
Openlab sürüm 5.5.2. Bilimsel Görüntüleme Yazılımı Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity sürüm 6.3 3D Görüntü Analiz Yazılımı (Volocity Acquisition)PerkinElmerSoftware B1
Volocity sürüm 6.3 3D Görüntü Analiz Yazılımı (Volocity Quantification)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450Sonicator
Branson Ultrasonik sonicator Microtip Adım, Katı, Dişli 9,5 mmVWR Bilimsel Ürünler A.Ş.  33995-325Sonikasyon için bozucu korna
Branson Ultrasonik sonikatör Microtip Konik 6.5 mmVWR Scientific Products Inc.  33996-185Sonikasyon için Microtip
Odyssey CLx Kızılötesi görüntüleme Sistemi LI-COR Biosciencesİmmünoblot tespiti için kızılötesi görüntüleme sistemi
Image Studio Analiz Yazılımı Ver 4.0 LI-COR BiosciencesYazılımı C
Moleküler Görüntüleyici Versadoc MP4000 Sistemi Bio-RadKemilüminesans görüntüleyici
Quantity One 1-D analiz yazılımı Bio-RadYazılımı D
SuperSignal West Femto Maksimum Hassasiyetli YüzeyThermo34095Ultra hassas gelişmiş kemilüminesan (ECL) alt tabaka
Orta seyreltme oranı seyreltme oranı . : İmmünoblot tespiti için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N. The Proteintech Blog.Proteintech. Grainger, D. , Proteintech Group. (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , Available from: http://www.clontech.com/CR/Products/Inducible_Systems/Tetracycline-Inducible_Expression/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=26908&fileId=6712191&sitex=10020:22372:US (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere--kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H. 3rd, Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137(2014).
  57. Oliver, C. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. Rapely, R., Walker, J. M. , Humana Press. 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. Vo-Dinh, T. uan , CRC Press LLC. 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. Fluorescence bleed-though. , Available from: http://www.gum2012.fionastoreydesign.co.uk/Downloads/Bleed through text.pdf (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immunofluorescence AnalysisCentromere Kinetochore ProteinsEndogenous Exogenous ProteinsParaformaldehyde FixationFlag tagged CENP AHuman Cell CultureIndirect Immunofluorescence StainingFluorescence MicroscopyProtein Localization QuantificationCell Fixation Protocol

Related Articles