$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Araştırma etiği Beyanı: Burada detaylı hayvanları da içeren tüm deneylerde kural ve Hayvan Bakım UNC Komitesi tarafından yapılan düzenlemelere ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH standartlarına tabidir.
1. Hazırlık ve Dissosiye Kortikal nöronlar Kaplama
- CO servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon zamanlı hamile kadın öldürülür. Her yarımkürede embriyonik gün 15.5 (E15.5) fareler ve microdissect korteks kafatası gelen bütün beyinleri çıkarın. Viesselmann ve ark 8 bakınız embriyonik fare korteksin mikrodiseksiyon ilgili detaylı talimatlar için.
- steril 1.6 ml'lik mikrotüp içinde diseksiyon medya 1 ml fazla 4 korteks yerleştirin. 10x tripsin 120 ul ekleyin ve tüpü 3 ters - karıştırmak için 5 kez.
- hemasitometre kullanarak, hücreler, hücre kültür kaplarına tohum saymak. Not: 1 kortikal yarımkürede sağlar yakloximately üç milyon hücre.
- SDS-dirençli Snare karmaşık biyokimya testi için, 35 mm çanak başına altı milyon hücre plaka ve durum başına iki yemekler kullanmaktadır. Not: Bu birden fazla koşul karşılaştırırken 6 kuyucuğu kullanılarak basitleştirilmiştir.
- Dallanma tahlilleri için, nitrik asit levha nöronlar 150,000 yoğunluğunda akson dallanma plakasının DIC görüntüleme için, 35 mm tabak başına 250,000 hücrelik bir yoğunlukta dairesel lamelleri yıkanmıştır. Bu yoğunluklar aşırı kalabalık önlemek ve analizi basitleştirmek.
- canlı hücre TIRF mikroskopi için, oda sıcaklığında nucleofection çözeltide transfeksiyon başına iki milyondan nöron tekrar süspansiyon.
- İmalatçı protokolüne 9'a göre bir Nucleofector sahip VAMP2-pHlourin sentezleme plasmidi ve elektroporasyona 10 ug içeren bir mikrotüp hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
- transfections hemen tripsin söndürme medya 500 ul ekledikten sonra, bir den de küvet ve plaka hücreleri süspansiyon kaldırmak35 mm PDL kaplı cam alt çanak başına 400.000 hücre sity.
- Plaka serum serbest medya 2 ml tüm kortikal nöronlar.
2. Snare Kompleks Oluşumu Testi
Not: SDS-dirençli tuzak kompleksleri işlenir ve ilk aşağıda detaylı değişikliklerle 10 tarif edildiği gibi analiz edilmiştir. Burada kullanılan olanlar valide alternatif antikorları için, malzeme bölümüne bakın.
- Önceden lizise 1 saat boyunca 250 ng / ml Netrin-1 ya da sham kontrol ile in vitro (DIV) 'de E15.5 kortikal nöronlar 2 gün teşvik.
- işlem örnekleri, 37 ° C, 4 ° C'ye soğutun santrifüj ve set su banyosu sıcaklığında ve 100 ° C sıcaklıkta bir blok önce.
- inkübatör hücre yemekleri çıkarın ve buz üzerine yerleştirin.
- yıkama başına 2 dakika - hücrelerden aspire ortam, 2 ~ sahip ml buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 1 yavaşça 2 kez değiştirin.
- Bu tahlil için, koşul başına 2 kuyu kullanımıition.
- bir durumun ilk kuyudan aspire PBS ve 250 ul homojenizasyon tamponu ile değiştirin. buz üzerinde hücreleri homojenize 5 dakika boyunca buz üzerinde bırakın ve daha sonra bir hücre kaldırıcı kullanılmıştır.
- Aynı durum bir sonraki oyuk PBS aspire ve de son zamanlarda homojenize karışımı ekleyin. Bu protein konsantrasyonlarını artacaktır. Tüm koşullar için tekrarlayın.
- tamamlanmasından sonra, bir pipet, buz üzerinde önceden soğutulmuş 1.6 mL mikrotüp çözüm homojenize edilir ve% 1 Triton X-100, bir nihai konsantrasyon elde etmek% 20 Triton X-100 ilave edin. kabarcıklar en aza indirirken 1000 ul pipet ile 10 kez karıştırın triturate.
- 2 dakika proteinlerin çözündürülmesi için buz üzerinde inkübe edin. 4 ° C'de 6.010 RCF 10 dakika boyunca inkübasyon, santrifüj olmayan aşağıdaki çözündürülmüş malzeme peletlendi. buz üzerinde yeni soğutulmuş 1.6 ml tüp içine lizat süpernatant taşıyın.
- Bradford tahlili 11 kullanılarak protein konsantrasyonu analizi yapın ve bir fina örnekleri sulandırmakB-Mercaptethanol (BME) ile desteklenmiş,% 1 Triton X-100 ve 5x örnek tampon maddesi ile takviye edilmiş homojenizasyon tamponu kalan 5 mg / ml - 3 L protein konsantrasyonu.
- 2 tüp içine eşit her deneysel örnek bölün. 30 dakika (tuzak kompleksleri) ve 30 dakika (tuzak monomer), 100 ° C de başka bir 37 ° C 'de bir örnek inkübe edin. çözeltide örnekleri tutmak için aralıklı olarak tüpler ters.
- SDS-PAGE ile ayrılması için hazır olana kadar -20 ° C'de örnekleri dondurun. 100 ° C'de 5 dakika boyunca, daha önce kaynatıldı örnekleri reboil, standart teknikler kullanılarak elektroforez ile örnekleri çalışan ancak oda sıcaklığında 37 ° C'de numune çözülme önce.
- Örneklerin Run çiftleri (30 - numune başına protein 40 ug) bir% 8 ve% 15 jel hem; % 15 SNARE protein monomerleri (SNAP-25 ° 25kDa, VAMP2 ~ 18 kDa, sintaksin-1 ~ 35kDa) ölçmek için kullanılır ise,% 8, kompleks doğru ayrılmasını sağlar. boya hattı STAC aracılığıyla kadar 70 V güç kaynağı koruyun90V için kral jel ve artış gerilimi. Boya kapalı bitene kadar jeller çalıştırın.
- monomerler korumak için, 45 dakika boyunca 70 V,% 20 metanol (MeOH) ilave soğuk aktarım tamponu kullanılarak buz üzerinde 0.2 mikron nitroselüloz zar proteinleri aktarın.
- O, 2 saat boyunca kapalı bir tabak içinde kuru membran / oda sıcaklığında N (O / N en iyi sonuçları verir).
- Blok oda sıcaklığında 1 saat için,% 10 Sığır Serum Albumin (BSA) kompleks membranlar SNARE.
- bir döner çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de 1000 ve prob olarak O / N: 1 bir seyreltme (spesifik SNARE kompleks bileşenlerini belirleyen) primer antikorların hazırlanması.
- Tris Tamponlu tuzlu su artı% 0.1 Tween-20 (TBS-T) her biri 5 dakika için 3 kez lekelerini durulayın.
- 1 bir seyreltme floresan ikincil antikor solüsyonları hazırlayın: 20,000,% 1 TBS-T içinde BSA ve prob, oda sıcaklığında kapalı 1 saat için. 1 saat sonra tekrarlayın Adım 2.12.1.
- Bir floresan tarama makinesinde görüntü lekeler yazılım paketi ile donatılmış ve Snare protein co hem ölçmekdikdörtgen İB'leri çizim için üreticinin talimatlarına kullanarak (sırasıyla 25 kDa, 18 kDa, SNAP-25, VAMP2 35 kDa immunoreaktif bantları ve sintaksin-1) mplex (40kDa yukarıda immunoreaktif bantları) ve monomer bantları.
TIRF Mikroskopi 3. Görüntüleme ekzositik Etkinlikleri
Bu protokol, sıcaklık, nem ve CO2 bir epifluorescent aydınlatma, yüksek bir büyütme / yüksek sayısal açıklık (NA) TIRF amacı, otomatik bir XYZ aşaması ile donatılan bir ters TIRF mikroskop korumak için bir çevre odasının dahil olmak üzere özel mikroskopi ekipman gerektirir ve Not: hassas Charge Coupled Device (CCD) dedektörü. Bu protokol, 100X 1.49NA TIRF amacı yarıiletken 491 nm lazer ve bir elektron Çarpma CCD (EM CCD) ile donatılmış bir tam otomatik ters mikroskop kullanılır. Tüm ekipman görüntüleme ve lazer kontrol yazılımı tarafından kontrol edilir. Envir üzerine daha önce başından görüntüleme protokolü gücüonmental odası, sahne, lamba, bilgisayar ve kamera.
- görüntüleme yazılımı içinde seçin hedefi. Amaç yerleştirildikten sonra, yaka etrafında objektif ısıtıcı sabitleyin.
- Bu amaç sahne yuvasına sahne inkübatör güvence önce tamamen aşağı iner onaylayın. dökülme önlemek için eşit sahne inkübatör girişlerine içine distile su dökün.
- Kuluçka sistemi açın. CO 2 tanka vanasını açın ve basıncı, üreticinin talimatlarına göre sistemine uygun onaylayın. Bölmesini% 5 CO 2 ve 37 ° C ulaşmak için biraz zaman tanıyın. görüntüleme çanak eklemeden önce, objektif su yoğunlaşmasını önlemek için inkübatör boş çanak yerleştirin.
- lazer kaynağı açın.
- Açık sahne kuvöz ve lens daldırma yağı ekleyin. inkübatör örnek yerleştirin ve kararlılık kol ya da bir tabak ağırlığı stabilize. Yağ örneğinin alt ile temas edinceye kadar objektif kaldırın. switciletilen ışık aydınlatma h ve Okülerin yoluyla nöronal odak düzlemi bulmak.
- Lazer yazılımını başlatın ve lazer kontrol yazılımı bağlanın. Widefield ve objektif kullanılan seçmek için aydınlatma ayarlayın (100X 1.49 NA TIRF tavsiye edilir). Numunenin Set refraktif indeks (hücreler ~ 1.38). 491 nm lazer için "TTL" işaretini kaldırarak lazer yoğunluğunu ayarlayın. % 40 - daha sonra 20 arasında bir değere geri aşağı getirmek 100 sürgüsünü ayarlayın. "TTL" yeniden kontrol edin.
- iletilen ışık aydınlatma tekrar numune odaklanın. görüntüleme yazılımı gidin ve 491 nm lazer aydınlatma ve açık deklanşörü seçin. Güzel tavana lazer odak noktasını ayarlamak ve çıkarılmış kondansatör ile kapalı alan diyafram merkezine gelin merkezi. böylece değil çizik lens, baş aşağı optik bankta Yoğuşturucuyu yerleştirin.
- kondenser değiştirin ve 110 nm TIRF yazılım ve set penetrasyon derinliğine (PD) gidin. TIRF illum için widefield aydınlatma geçingörüntüleme biçimde uygulanması modu.
- epifluorescent ışık kaynağı ile geniş açılı Epifloresans kullanarak oküler üzerinden eksprime eden hücrelerin VAMP2-pHluorin Bul.
- görüntüleme parametrelerini (pozlama süresi, kazanç ve lazer güç) (örneğin photobleaching ve fototoksisite azaltmak için en az pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu kullanarak gürültü oranı ve dinamik aralık sinyali maksimize etmek için ayarlayın: 50 arasında poz - 100 ms, 15 ile - 30 % 30 maksimum lazer gücü) kazandıracağı.
- Hücre başına ayarlayın sürekli otofokus. edinim 5 dakika boyunca her 0,5 saniyede oluşan seti bir timelapse görüntü kazanır. Netrin-1 uyarılmış durum için, bir laminar akış başlığı içinde hücrelerin çanak-1 netrin, 500 ng / ml ilave edilir ve önce görüntüleme 1 saat için inkübatöre geri çanak.
- , ImageJ açık görüntü yığınlar> Aç> Dosya adı (Şekil penceresinin içine dosyayı sürükleyip bırakmak veya dosya giderek hücre alanı ve zaman başına normalize ekzositik olayların sıklığını ölçmek için0; 2A Ankastre 1).
- Ortalama Yoğunluk: vezikül füzyon olayları temsil etmemektedir kararlı floresan sinyalleri kaldırmak için, Görüntü> Yığın> Z-Project> Projeksiyon tipi kullanarak tüm yığının ortalama z projeksiyonu oluşturmak. > Süreci kullanılarak timelapse> Görüntü Hesaplama her görüntüden Image1 demek görüntüsünü çıkarma: yığını Operasyonu: image2 yeni oluşturulan ortalama z projeksiyon çıkarın. Bu ekzositik olayları (- 3 Şekil 2A Ankastre 2) vurgulamaktadır.
- gözle ekzositik füzyon olayları saymak. Ekzositik etkinlik hızlı VAMP2-pHluorin plazma zarı (Şekil 2A ek 6) içinde dağılır olarak yayılan bir kırınım sınırlı floresans sinyali ortaya olarak tanımlanır.
- > Görüntü kullanarak ilk resmi vurgulayın ayarlayın> Threshold> tam hücre eşiği (- 8 Şekil 2A INSET 7) vurgulanan kadar kaydırıcıyı ayarlamak için Eşik komutunu kullanın.
- Ana altındaLyze, SetMeasurements seçin ve alanı ve ekran etiketi kontrol edin. (- 8 Şekil 2A INSET 7) ölçmek için asa izleme aracı ve basının 'm' ile eşiklenir hücresel alanını seçin.
- Hem ekzositik füzyon olayları saymak Transferi, bir elektronik tabloya hücre alanı ölçümleri ve geçen görüntüleme süresi ekzositik olaylar / mm 2 / süresi sayısını (Şekil 2A Ankastre 9) hesaplamak için kullanılır.
4. Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Akson dallanma Timelapse Mikroskopi
Not: DIC görüntüleme genel bir yaklaşım için tam bir protokol ve gösteri 12 mevcuttur. Bu protokol, DIC kullanır, diğer gönderilen ışık mikroskobu yöntemleri (örneğin: faz kontrast) aynı amaçlar için kullanılabilir.
- 2 SAYI anda, önceden ısıtılmış çevre odasında untransfected nöron içeren yer cam alt görüntüleme çanak nemli env korumak için% 5 CO2 ve 37 ° C ironment. En iyi görüntü kalitesi ve çözünürlük için 60X Plan-apochromat ile donatılmış mikroskop, 1.4 NA DIC objektif lens ve yüksek NA kondenser yararlanın.
- iletilen ışık aydınlatma kullanarak Okülerin aracılığıyla nöronlar bulmak için odak düzlemi ayarlayın.
- görüntüleme yazılımı çoklu alan edinme işlevi kullanarak, bulmak ve en az 6 hücre XYZ yerleri kaydedin. sahne yerleştirin, böylece en iyi sonuçları elde etmek için görüş alanı içinde faiz uyum nöronlar.
- 250 ng Canlandıracak / ml netrin-1 ve basın 'Çok alanlı alımı başlatabilirsiniz.' Sıralı gerektiği gibi satın alma ve odaklanma duraklatma, 24 saat boyunca her pozisyonda her 20 saniyede görüntü kazanır.
- Çok Boyutlu Veriler> açık dosya adını gözden> Apps kullanarak görüntüleme yazılımı görüntüleri inceleyin. istikrarlı akson dalları (20 mikron uzunluğunda) görüntüleme oturumu sırasında bu form tanımlayın. Bir stableaxon branc ölçmek için hat çizmek aracını kullanınucu akson de tabandan saat 20 mikron uzunluk yeterlilik karşılanmasını sağlamak.
- membran çıkıntılar doğmakta olan dalları uzunluğu 20 mikron ulaştığınızda dalları daha sonra yanı sıra netrin stimülasyon sonrasında kare sayısını oluşturan alanlarda başlattığınızda Elektronik tabloda, netrin uyarılmasından sonra kare numarasını kaydedin.
- Şube başına oluşum süresini hesaplamak için 20 saniye çıkıntı ve şube oluşumu arasındaki kare sayısını çarpın.
5. Toksin İşlemler ve Sabit Hücre Immunofluoresence
- Div 2 'de, 250 ng deney koşullarında nöronları tedavi / ml-netrin 1 ve / ya da 10 nM botulinum etkili / mi netrin- ng tuzak aracılı eksositoz 13 artı 250 inhibe böler SNARE proteini SNAP-25'in ve bir toksin (BoNTA), 1. kontrol koşulu olarak işlenmemiş nöronların bir set bırakın.
DİKKAT: hazırlanması ve kullanırken BoNTA göz ve solunum koruması kullanımını gerektirirçözümleri. en kısa sürede biyolojik tehlikesi malzeme ve otoklav gibi tüm kontamine malzemeler koruyun. - 3 bölme (24 saat sonra muamele) aspire ortam ve hemen PHEM düzeltme (ayrıntılar için Tablo 1 'e bakınız) en az 1 ml yerine 37 ° C'ye kadar ısıtıldı. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe edin.
- (4 ° C'de parafilm ve mağaza ile ileride kullanmak mühür) PBS ile 3x durulayın.
- Koyu renk, nemlendirilmiş boyama odası içinde lamelleri ve (% 10 Triton X-100, stoktan yapılmış) PBS içinde Yeni seyreltilmiş% 0.2 Triton X-100, 10 dakika boyunca hücre zarları permeabilize.
- Permeabilization çözüm çıkarın ve PBS ile 1x 50 ul ile yıkayın. 30 dakika boyunca blok ~ PBS (BSA-PBS) içinde% 10 Sığır Serum Albumin 50 ul ya da 10%, oda sıcaklığında PBS içinde eşek serumu Haşlanmış.
- Yine 1x PBS ile durulayın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile,% 1 BSA-PBS içinde (nöronal kimliğini teyit etmek için 1000 βIII tubulin 1) birincil antikor, 50 ul lamelleri inkübe, karanlıkta.
- PBS içinde 3x 5 dakika yıkama yapın. tübülin (1: 400) için spektral olarak farklı ikincil antikor, 50 ul lamelleri inkübe ve flüoresan Phalloidin (eksitasyon göre değişir: 100, 1 488 falloidin: 400, 647 falloidin 1), 1 saat boyunca% 1 BSA-PBS'de .
- 1x PBS içinde 3x 5 dakika yıkayınız ve montaj medyada Slaytlarınıza lamelleri monte edin.
- şeffaf tırnak cilası ile lamel ve mühür kenarlarından Vakum fazla montaj medya.
- 40X 1.4NA objektif, epifluorescent yetenekleri ve EM-CCD ters bir mikroskop widefield Epifloresans görüntüleri toplayın.
- El ile ImageJ kullanarak dallanma analiz. Penceresine dosya sürükleyerek veya> Aç> dosya adı (Şekil 4A inset 1) Dosya giderek ImageJ açın görüntü yığınları.
- Line> segmente hattını kullanarak, soma (- 3 Şekil 4A içerlek 2) uzanan en uzun akson olarak tanımlanan akson, iz.
- Analiz> Araçlar> ROI Manager'ı kullanarak, ilgi bir bölge olarak izleme akson kaydedin. Trace ve uzunluğu bir neurite ≥20 mikron olarak tanımlanan her akson dalı kaydedin. Analizi (- 4 Şekil 4A içerlek 3) 'de (doğrudan akson çimlenme çıkıntılar) yalnızca birincil dalları yer alır.
- Ü 'ilgi kaydedilen bölgeleri ölçmek ve mikron uzunluğunu hesaplamak için bir e-tabloya piksel uzunlukları aktarmak için.
- 100 mikron uzunluk başına akson şube sayısını elde etmek için 100 ile bölünmüş mikron akson uzunluğu, uzunluğu ≥20 mm akson şube sayısını bölün.