Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi

8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53753

⸱

23 Nisan 2016

 , 
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, University of Arizona College of Medicine, 2Center for Applied Genetics and Genomic Medicine, University of Arizona College of Medicine

Bu makalede

Özet

Burada stabil sentetik LINE-1 ifade eden HepG2 hücre hatlarının kromozom yayılır tek çekirdek düzeyinde HAT-1 retrotransposition izlemek için FISH metodolojisini kullanır.

Özet

Uzun serpiştirilmiş nükleer element-1 (Line-1 veya L1), insan genomunda bulunan DNA'nın yaklaşık %17'sini oluşturur. L1'lerinçoğunluğu 5' kesilme nedeniyle inaktif olsa da, bu elementlerin ~ 80-100'ü retrotranspozisyon yetkin kalır ve RNA ara ürünleri aracılığıyla genom boyunca farklı yerlere yayılır. Daha eski L1'lerin genomun AT açısından zengin bölgelerini hedef aldığına inanılırken, daha yeni, daha aktif L1'lerin kromozomal hedefleri tam olarak tanımlanmamıştır. Burada, tek çekirdek seviyesinde L1 yerleştirme modellerini ve ektopik L1 dahil etme oranlarını izlemek için kullanılabilecek floresan in situ hibridizasyon (FISH) metodolojisini açıklıyoruz. Bu deneylerde, ektopik L1'i stabil bir şekilde eksprese eden HepG2 hücrelerinde in vitro L1 retrotranspozisyonunu izlemek için floresein izotiyosiyanat / siyanin-3 (FITC / CY3) işaretli neomisin probları kullanıldı. Bu metodoloji, toksisitenin neden olduğu retrotranspozisyon oranlarının tahminindeki hataları önler ve tek bir çekirdeğe birden fazla eklemenin meydana gelmesini açıklar.

Giriş

İnsan Uzun Interspersed Nükleer Element-1 (Hat-1 veya L1) retrotransposition mekanizmasını bir geçiş genomu içinde yayılır "kopya ve yapıştır" özerk mobil unsurdur. Tipik bir insan L1 ~ 6 kb uzunluğundadır ve bir promoter olarak hizmet veren bir 5'UTR (çevrilmemiş bölgesinin) oluşur, iki açık okuma çerçevesi (ORF): L1 -ORF1 L1 -ORF2 ve polyA bir 3'UTR . bobin bobin alanı, bir RNA tanıma motif ve C-terminal sahası, L1 -ORF2 proteini endonükleaz sahipken, transkriptaz ve sistin zengin alanları 1,2,3,4,5 tersine: yükleme L1 -ORF1 proteini üç farklı etki vardır. L1 -ORF2 retrotransposition 1,2,6 için gerekli iki proteinler ile, enzimatik aktiviteleri sağladığına; L1 -ORF1, nükleik asit şaperon aktivitelerini sergiler.

L1 retrotransposition bir döngü L1 5'UTR transkripsiyon ile başlar RNA polimeraz II, translokasyon sitoplazmaya ve çeviri tarafından bicistronic mRNA. Sitoplazma L1 -ORF1 sergiler, ya diğer RNA paketleri kendi RNA paketleri sis bağlayıcı eksojen veya trans bağlayıcı eksojen (örneğin, sinüs / SVAS / sözde genlerin) L1 -ORF2p 7 olan bir ribonükleoprotein parçacık (RNP) oluşturmak için, 8. Bu ana ters transkriptaz tarafından kullanılan da gruptur, 9 ve 3 'ucundan DNA sentez RNA ters - RNP L1 -ORF2p çentik genomik DNA (gDNA) arasında endonükleaz aktivitesi, OH ortaya çıkarmak için çekirdek içine. Ters sentezi sırasında, DNA'nın ikinci şerit imzası L1 ekleme dizileri (örneğin, TTTTAA) olarak adlandırılan hedef site duplikasyonları (TSD) 9,10 oluşturmak için doldurulur sendeleyerek kesmeleri oluşturmak için orijinal nick sitesinden 7-20 bp nicked edilir. Bu işlem, hedef ana ters transkripsiyon (TPRT) olarak bilinir ve inserti neden olduğueklenen dizinin her iki ucunda TSDs L1 / diğer DNA'lar tam ya da tepe bölümü kesik kopya ile. L1 retrotransposition aracılığıyla da aracılık ettiği gösterilmiştir homolog olmayan uç birleştirme bazı hücre tiplerinde 11 TPRT benzeri.

Çalışmalarımızda kullanılan L1 retrotransposition vektör epizomal olmayan ve etiketli L1 -ORF1 ve 2p Birleştirilen CMV L1-5'UTR promoterler tarafından tahrik (şekil 1) 12 oluşur. Bu yapının önceki versiyonları maya ve insan hücre kültürleri 13,14,15 kullanıldığı çalışmalarda tarif edilmiştir. 3 'ucu yapıştırma ve entegrasyon sonrasında neomisin ekspresyonunu tahrik etmek için ters yönde yerleştirilmiş olan 5' ve 3 'yer alan iki ayrı CMV promoterler, vektörün sona erer. 3 'ucunda retrotransposition göstergesi kaseti L1 -ORFs bir neomisin geni yerleştirilmiş antisens oluşur ve topak iki parçaya ayrılması ile aktif olmayan haleeklenmiş verici (SD) ve eklenmiş alıcı (SA) siteleri (Şekil 1) introna, uygun olarak. Bir kromozom içine entegrasyon üzerine, L1 bir bicistronic mRNA ve inaktif neomisin mRNA oluşan bir mRNA üretmek için ortak promotör transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin intron tamamen işlevsel bir neomisin geni geri neomisin genin dışında birleştirilir. Hibrid mRNA cis bir RNP içine paketlenmiş ve TPRT kullanılarak tam uzunluklu ya da kesilmiş ya da sokulmasını genomuna entegre edilir çekirdeğe transloke edilmiştir.

Burada tek çekirdek düzeyinde L1 -retrotransposiition desen ve yerleştirme oranlarını izlemek için özel olarak eklenmiş neomisin geni (sneo) yönelik problar ile in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanan bir metodoloji tarif eder. verimlilik ve algılama özgüllüğü det yetkili retrotransposition ve beceriksiz yapıları ve problar kullanılarak teyit edildiEKT sneo veya intron kavşağı 16 globin neomisin ve. Bu metodoloji, çoklu eklemeler, koloni direnci ve olumlu klon genişleme olarak hücre kültürü temelli retrotransposition deneyleri, eksikliklerin bazıları oluşturmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Bireysel reaktifler nasıl hazırlanacağını ilgili ayrıntılar için Reaktifler bölümüne bakın.

1. Etiketleme L1 Probları

NOT: Sondalar kimyasal veya PCR etiketleme etiketli olabilir.

  1. kimyasal etiketleme
    1. etidyum bromür (0.5 ug / ml) ekleyin, sonra eriyene kadar, bir mikrodalga Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu, ısı 0.7-1% agaroz jeli yapmak jeli soğumasına izin verin ve. Jel tepsiye dökülür tarak ekleyin ve jel, oda sıcaklığında katılaşmaya sağlar.
    2. üreticinin protokolüne uygun olarak, 1 saat boyunca 37 ° C'de CY3 ya FITC ile sneo probu (1-2 ug) etiketleyin.
      Not: sneo S retrotransposition tam bir döngüsünden sonra ifade Neo Vankomisine geni pliced ​​gösterir. prob boyutu ~ 1000 bp. Sneo PCR herhangi bir vektöre veya genom büyütülmüş edilebiliric DNA. Streptavidin-CY3 / FITC etiketleme reaktif hakkında bilgi almak için Malzemeler ve Reaktifler Tablo bakınız.
    3. her kuyuya 1x DNA yükleme tamponu, yük ile etiketlenmiş sneo prob çözüm karıştırın ve 15-20 dakika boyunca 75-100 voltta çalışır.
    4. Ultra-Violet (UV) Aydınlatıcı kullanarak prob bandı gözünüzde canlandırın. Sneo prob boyutu ayarlanabilir olduğu ve Kilit çekirdekler asit (LNA) de (Şekil 2) eklenebilir kullanılabileceğine dikkat ediniz.
    5. Kesme çözündürülmesi ve imalatçının protokolüne göre, bir PCR Temizleme kiti kullanılarak jelden sneo prob saflaştırılması, temiz bir bıçak ile jelden sneo etiketlenmiş prob.
      DİKKAT: Kapak koruma kalkanları (yani, laboratuvar mont ve UV şeffaf yüz maskesi) ile vücudun her maruz parçası görüntüleme ve jel keserken. PCR ürünleri arındırmak jel bilgi için Malzeme Tablosu ve Reaktifler bakın.
    6. Yeniden çalışma sneo 5 ul% 0.7 agaroz jeli üzerinde un etiketli sneo probu ile etiketlenmiş prob con (1.1.1 bakınız)firma büyüklüğü artışı ve sinyal yoğunluğu kaybı (Şekil 2).
    7. Nükleaz bilgilerini H2O içinde 260 nm'de absorbans ölçümü ile etiketlenmiş sneo prob miktarını ölçmek ve 10 ng sneo prob seyreltik / ul alikotları -20 ° C'de saklayın alikotları.
  2. PCR Etiketleme (prob etiketleme için alternatif yöntem)
    1. Sneo spesifik primerler birleştirin (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 've 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3'), tek bir tüp içine PCR ile: 13.6 ul nükleaz bilgilerini H2O; 0.1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0.05 ul dTTP (10 nM); 0.05 ul dUTP-biyotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul tampon 5x Tag git; 0.4 ul Etiket Polymerase git; 1 ul sneo şablonu (10 ng). PCR ile ilgili bilgi için Malzeme ve Reaktifler Tablo bakınız.
    2. Numunelerin toplam sayısı ile çarpılarak her reaktif maddenin miktarını ayarlayın.
    3. Aşağıdaki PCR bisiklet parametresini kullanıns amplifiye ve etiket sneo Probes: 2 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye, 30 saniye için 62 ° C, 60 sn için 72 ° C, 95 ° C 35 döngü; 2 dakika 72 ° C; belirsiz bir süre 4 ° C'de tutun.
      Not: bağlanma sıcaklığı ayarlanabilir veya degrade PCR diğer problar için en uygun tavlama belirlemek için tamamlanabilir.
    4. bölüm 1.1.1, yük gibi 0,7-1% jel yapmak ve bölüm 1.1.4 gibi sonda bandı görselleştirmek.
    5. Kes ve bölüm 1.1.5 gibi etiketlenmiş sneo probu arındırmak.
    6. Yeniden çalışma sneo 5 ul (bakınız Şekil 2) boyut artışı ve sinyal yoğunluğu kaybını doğrulamak için un etiketli sneo probu ile etiketlenmiş prob.
    7. Nükleaz bilgilerini H2O içinde 260 nm'de absorbans ölçebilecek etiketli sneo prob miktarını ölçmek ve 10 ng sneo prob seyreltik / ul alikotları

2. Hazırlama Kromozom Farkları

  1. vektör omurgası ifade stabil klonlar oluşturmak (controStandart bir seçim yöntemleri kullanılarak L) veya retrotransposition yetkin L1. epizomal olmayan muhabir transkripsiyon çalışmaları ile bağlantısının kullanıldı birlikte 12,16, epizomal vektörleri de kullanılabilir. Stabil kontrol veya L1 vektör tam büyüme ortamı (gerektiği gibi yapılmış plaka boyutu ayarlamaları ile 10 cm plaka başına 1 x 10 6 hücre) ifade eden hücreleri büyür. HepG2 hücreleri, RPMI-1600,% 10 FBS ve higromisin 200 ug / ml,. 37 ° C'de% 70 ortak akışa kadar büyümeye ve kültürler% 5 CO2.
    Not: büyüme ortamının seçimi, hücre tipine bağlıdır. Burada kullanılan plazmidler higromisin ve neomisin hem seçim kaseti taşıyan göz önüne alındığında, klonların stabil bir seçim higromisin seçimi neomisin ile yapılabilir, ancak neomisin miktarı, her hücre türü için tolerans seviyelerinin tutturulması için optimize edilmesi gerekmektedir.
  2. Kültür ortamına colcemid (0.4 ug / ml) ilave edin ve 90 dakika metaph hücreleri yakalamak için inkübease. Farklı hücre tipleri kullanıldığında, deneysel olarak uygun metafaz tutuklama colcemid ve maruz kalma süresi (60, 90 ve 120 dakika) optimal konsantrasyonunu belirlemek.
  3. Yıkama hücreleri, hücreler 3-5 mL% 0.25 tripsin solüsyonu eklenip hücreleri ayırmak için 5 dakika boyunca inkübe 1X Dulbecco PBS (DPBS), tripsinize 10 ml 2x. % 10 FBS ihtiva eden ortamın eşit miktarda tripsin inaktive.
  4. , 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika süre ile hücreler santrifüj hücre topağından orta aspire ve DPBS ile yıkama hücreleri. hücrelerin yeniden askıya DPBS 200 ul bırakarak aspire tüm DPBS. Sağlamak hücreler iyice karıştırılır ve kümeleri dağılmış olduğu. mix ve kümeleri dağıtmak ve vorteks önlemek için titrek ve nazik pipetleme kullanın.
  5. Hipotonik çözelti 5 ml (yani, 75 mM KCI) yatay olarak 15 ml tüp dönerken 37 ° C'de damla damla önceden ısıtılmış ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Malzeme ve Reagen Tablosu görünelde edilir ve hipotonik bir çözüm nasıl yapılacağı hakkında bilgi almak için ts.
  6. Her yıkamadan sonra hücrelerin yeniden askıya hipotonik solüsyon yaklaşık 200 ul bırakarak 2.5 3x - 5 4 ° C'de dakika ve yineleme için 120 xg'de Santrifüj hücreleri 2.4 adımları. 3 yıkar sonunda, pelet gözle görülür beyaz ve şişmiş olduğundan emin olun.
  7. Carnoy Sabitleme çözeltisi 200 ul pelet yeniden askıya artı 1: Carnoy Sabitleme çözeltisi içinde 8, 1:16 seyreltme: 2, 1: 4, 1. üzerinde yaklaşık 1 cm bir kuru, temiz slayt üzerine her seyreltme 10 ul damla ve hemen 30 saniye süreyle kaynar su sıcak buhara yayılmış serbest tarafını ortaya çıkarmak. Carnoy Sabitleme çözüm yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
  8. 0.1 ug / ile, oda sıcaklığında, leke yayılır Kuru mi Hoechst-33342 Coplin kavanoza 15-20 dakika boyunca daldırma ile ve yıkama DPBS ile 3 kez. Hoechst-33342 çözüm yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
  9. Görünüm 40X büyütmede floresan / faz-kontrast mikroskop yayılır. Yayılma hazırlık optimize sonra, formalar Hoechst-33342 ile boyanmış olması gerekmez. Görünüm Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi yayılmış kalite ve ayırma belirlemek için 10X büyütmede faz-kontrast mikroskop yayılır (Şekil 3).
  10. Seçip sürgünün karşı tarafında bir elmas noktası Marker iyi yayılır daire (örneğin, yayılabilir içermeyen tarafı).
  11. Mağaza bir aya kadar -20 ° C'de yayılır. neme maruz kalmaktan kaçının.

Yerinde Hibridizasyon 3. Floresan (FISH)

  1. Yayılır, stabilize edici ve dehidre
    Not: -20 ° C'de muhafaza edildiğinde dengeye metafaz kromozom, oda sıcaklığına kadar yayılır. elde etmek ve reaktifler yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
    1. Inkübe metafaz kromozom 200 ul RNaz A ile yayılır37 ° C'de 1 saat.
    2. Yıkama her biri 10 mm HCI çözeltisi ile durulama, ardından 5 dakika boyunca iki kez 2 x SSC tamponu-slaytlar.
    3. Deiyonize H2O ile yıkayın ve her biri 5 dakika için 2X-SSC tamponu ile iki kez yıkanır, 37 ° C'de 10 dakika süre ile% 1 pepsin ile yayılır inkübe edin.
    4. 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile yayılır inkübe ve her biri 5 dakika iki kez 2 x SSC tamponu içinde yıkayın.
    5. % 70,% 80 ve% 95 etanol: etanol seri 2 dakika süreyle inkübe edilerek yayılır dihidrat.
    6. Hava kuru slaytlar.
  2. Melezleme L1 -etiketli retrotransposition probları ile yayılır (yani, sneo)
    DİKKAT: Doğrudan etiketli problar için, her zaman ışıktan uzak tutun. elde etmek ve reaktifler yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
    1. 10 dakika süre ile 72 ° C'de hibridizasyon tamponuna sneo 30 ng, ısıtılır ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca soğutulur.
    2. e sneo prob çözeltisi 30 ul ekleach yaymak, lamel ile kaplayın ve kauçuk çimento ile kenarları mühür. hiçbir kabarcık oluşumunu sağlamak.
    3. yavaş yavaş 37 ° C'ye kadar sıcaklık düşüşü ve 37 ° C de karanlık bir nemlendirilmiş oda içinde bir gece boyunca inkübe bir sıcaklıkta bir blok üzerinde 5 dakika boyunca 72 ° C'de slayt ısıtın.
  3. Yıkama ve Görüntüleme (veya İkincil Antikor ilavesi)
    DİKKAT: Doğrudan etiketli problar için, her zaman ışıktan uzak tutun.
    NOT: Malzeme ve nasıl hazırlanacağı konusunda bilgi almak için Reaktifler Tablo bakınız. tüm kromozom yayılmasını karşılamak için yeterli hacimde kullanılması tavsiye edilir. lamel eklendiğinde fazla hacim kaybolur unutmayın.
    1. lamelleri kaldırmak için 2x SSC tamponu slaytlar daldırın.
    2. 5 dakika boyunca 45 ° C'de 2x SSC tamponu-batırılarak slaytlar yıkayın.
    3. 5 dakika sonra 2x 45 ° C'de yıkama tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
    4. 10 dakika boyunca 45 ° C'de 0.1X SSC tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
    5. 10 dakika boyunca 45 ° C 'de 2X SSC tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
      Not: Talep bir su banyosu içinde önerilen tamponu ihtiva eden bir Coplin Kavanoz, 45 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlanır.
    6. Soğuk oda sıcaklığına kadar slaytlar ve algılama tampon slaytlar dengeye.
    7. direkt etiketli problar için, 3.4.10 adıma geçin.
    8. Dolaylı etiketli problar için, 20-30 dakika süreyle ve tampon engelleme blok DPBS 3x yıkayın.
    9. 1 saat boyunca (blokaj tamponu örneğin, 5 ug / ml streptavidin-FITC veya αCY3) ikincil antikor, 50 ul inkübe edin.
    10. iki kez 5 dakika süreyle 2x SSC slaytlar yıkayın.
    11. 10 dakika süre ile Hoechst-33342 solüsyonuna (0.1 ug / ml) ile karşıt.
      NOT: Bu boyama prob ile eş-lokalizasyonu için kromozom leke yapılır.
    12. , Montaj orta bir damla ekleyin, DPBS 3x yıkayın lamel yerleştirin ve tırnak cilası ile kenarları mühür.
    13. 40X ma floresan mikroskop kullanılarak L1 retrotransposition analizgnification.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

L1 retrotransposition vektörünün şematik bir diyagramıdır, Şekil 1 'de sunulmuştur. Vektörü sens yönlenmede bir globin intronu ile kesilmiş ve SD ve SA siteleri tarafından sandviç L1 ORF antisens yönlenmede bir neomisin geni içerir. Kararlı biçimde bir kromozomda entegre olduğunda, L1 mRNA Birleştirilen CMV ve L1-5'UTR promotörünün (Şekil 1) transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin intron neomisin genin dışında ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Böyle tüm genom dizileme, ters PCR ve güney blot olarak metodolojileri L1 retrotransposition incelemek için istihdam edilmiştir. Bu metodolojiler L1 eklemeleri genomları içinde meydana nerede yerini son derece değerli olmasına rağmen, hepsi için bir karıştırıcı zorluk dizileri yeniden birleştirmek için-siliko programlama için ihtiyaçtır. Burada açıklanan BALIK yöntemi, özellikle kültür hücrelerinde ektopik L1 retrotransposition analizleri gerektiren çalışma durumunda, bu yöntemleri ta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar potansiyel rakip çıkarları beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (ES014443 ve ES017274) ve AstraZeneca'dan KSR'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Etiketleme Probları
Go Etiketi DNA polimerazPromegaM3178
GO Etiketi 10x renksiz tamponPromegaM3178
Bireysel dNTPSigmaDNTP10dATP, dGTP, dCTP konsantrasyonunu 2 'ye ayarlayın; mM ve dTTP'den 1.5 'ye kadar; Nükleaz içermeyen suda mM.
dUTP-16-Biotin (0.5  mM)Roche11093070910
dUTP-FITC (0.5  mM)Thermo ScientificR0101
dUTP-CY3 (0.5 & nbsp; mM)SigmaGEPA53022
MIRUS BALIK Etiketleme KitiMIRUSMIR3625
MIRUS BALIK Etiketleme KitiMIRUSMIR3225
NucleoSpin PCR Temizleme Kiti Qiagen1410/0030NucleoSpin PCR Temizleme Kiti yerine herhangi bir PCR temiz reaktifi
PCR MakinesiEtiket ürününü yükseltmek için herhangi bir Thermocycler makinesi kullanılabilir.
AgaroseSigmaA9539
Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması
ColcemidLife Technologies 15212-012Colcemid'i doğrudan büyüme ortamına 0.4  &mikro; g/ml
1  M KClSigmaP9541Seyreltik 1  75 'ye kadar M KCl çözümü; Hipotonik Çözelti yapmak için mM çözeltisi
Carnoy Fiksatif Çözeltiyapmak için 3 hacim metanol ve 1 hacim asetik asit karıştırın. Her seferinde taze yapın.
MetanolSigma322415
Asetik asitSigma320099
Hoechst-33342Thermo Scientific62249Hoechst-33342'yi PBS'de 1  nihai konsantrasyona kadar çözün; mg/ml'dir.
Diamond Point MarkerThermo Scientific750
Buzlu SlaytlarThermo Scientific2951-001
Tripsin-EDTA (%0.25)Life Technologies R001100Hücreleri detekte etmek için, hücreyi Tripsin içinde 5 dakika inkübe edin ve eşit hacimde tam ortam ile inaktif hale getirin.
Kapak kızaklarıVWR48366067
Coplin KavanozlarıThermo Scientific107
Isı BloğuBu amaç için herhangi bir ısı bloğu kullanılabilir, ancak kızakları ısıtmak için takılan bloklar önerilir.
Beher (600  ml)SigmaCLS1003600Beheri suyla doldurun, kaynatmak için ısıtın, kromozomları patlatmak için sıcak buharı kullanın.
Nikon MikroskopNikon125690Yayılma kalitesine bakmak için herhangi bir mikroskop kullanılabilir.
BALIK için Reaktifler ve Malzemeler
Trisodyum sitratSigmaS1804
Sodyum KirürSigmaS3014
FormamidSigmaF9037
Ara-20SigmaF1379
Detran SülfatSigmaD8906
SDSSigmaL3771
Somon Sperm DNAYaşam Teknolojileri 15632-011
Sığır Serum Albümini (BSA)SigmaA8531
HCl (N)Sigma38283
Etil AlkolSigma459844
MetanolSigma322415
DPBSLife Technologies 14190-250
NaOHSigmaS8045
Rnase ASigmaR4642
PepsinSigmaP6887
Paraformaldehit (PFA)SigmaP6148
Hoechst-33342Thermo Scientific62249Hoechst-33342'yi PBS'de 1  nihai konsantrasyona çözün; mg/ml'dir.
Kauçuk Çimento/Cytobond Mastik 2020-00-1
Yedi Coplin KavanozThermo Scientific107
Koyu Nemlendirilmiş odaSigmaCLS2551
Kapak slaytlarıVWR48366067
Kuru Dijital Isı BloğuVWR13259
Floresan Mikroskobu
20x Salin-Sodyum Sitrat (20x SSC)175 g NaCl ve 88.2  birleştirin; 800 ml moleküler sınıf H2O içeren g trisodyum sitrat pH 7'ye ayarlarken karıştırın. Tüm tuzlar çözüldüğünde, hacmi 1 L'ye ayarlayın ve 0.22 & mikro; m Filtre kağıdı. 4 ° C'de saklayın.
1  mg / ml Rnase A20x SSC tamponunu 2x SSC tamponuna seyreltin. RNase A'yı 2x SSC tamponunda 1 'lik bir nihai konsantrasyona çözün; mg/ml'dir. Her seferinde taze çözelti yapın.
% 1 PepsinPepsini (W / V) 10 mM HCl içinde% 1'lik bir çözelti nihai konsantrasyonuna çözün. Her seferinde taze yapın.
% 4 Paraformaldehit (% 4 PFA)Çeker ocakta 4.0 g PFA tartın, 50 ml 1xPBS ekleyin, 60 ° C'ye ısıtın; ° Karıştırırken C ve tüm PFA çözülene ve çözelti berraklaşana kadar pH'ı NaOH damlaları ile ayarlayın. Ses seviyesini 100  olarak ayarlayın; ml, 0.22 & mikrodan süzün; m Kağıdı filtreleyin ve 5 ml alikotları -20 'de saklayın; °C. PFA'nın alikotunu 37 °C'de çözün &°; Sonraki kullanımlar için 10-15 dakika C. Paraformaldehit miktarına bağlı olarak filtre boyutunu ayarlayın.
Yıkama Tamponu100 ml Formamid (% 20) ile 2.5 ml 20x SSC'yi birleştirin, 1.0 M HCl ile pH 7'ye ayarlayın ve hacmi moleküler dereceli H < sub > 2 < / sub>O ile 500 ml'ye getirin.
Hibridizasyon Tamponu%50 formamid, %10 dekstran sülfat, %0.1 SDS ve 300 ng/ml Somon Sperm DNA'sını 2x SSC tamponunda birleştirin. Formamid miktarı, kromatitlerin ne kadar odaklandığını belirler; Miktarı titre edin.
Algılama Tamponu20x SSC tamponunu 4x'e seyreltin ve algılama tamponu yapmak için %0,2 Tween-20 ekleyin.
Blokaj Tamponu: % 5 sığır serum albüminini (BSA) 4x SSC tamponunda% 0.2 Tween-20 ile birleştirin.
Dehidrasyon Çözeltisi%70, %80 ve %95 etanol çözeltileri yapın.
kullanılabilir :

Kaynaklar

  1. Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
  2. Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
  3. Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
  4. Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
  5. Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
  6. Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
  7. Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
  8. Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
  9. Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
  10. Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
  11. Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
  12. Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
  13. Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
  14. Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
  15. Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
  16. Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
  17. Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
  18. Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
  19. Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
  20. Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
  21. Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
  22. McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
  23. Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
  24. Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
  25. Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Floresan In Situ HibridizasyonTek Çekirdek AnaliziHepG2 HücreleriSNeo Prob EtiketlemeMetafaz Kromozom YayılımlarıFITC CY3 ProblarıHipotonik Solüsyon UygulamasıCarnoy Tespit YöntemiDAPI Montaj Medyumu
Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.