Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

suda çözünür Bileşikleri ile SCA1 Fare tedavisi, spesifik olmayan mitokondriyal fonksiyon Boost

10.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53758

⸱

22 Ocak 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

Bu makalede

Özet

Spinoserebellar ataksi tip 1 (SCA1) ve diğer serebellar nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için mitokondri hedefli suda çözünür bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için biyokimyasal ve davranışsal bir protokol sunuyoruz.

Özet

Mitokondriyal disfonksiyon yaşlanma sürecinde ve birçok kalıtsal spinoserebellar ataksi ve beyincik ilerleyici dejenerasyonu ile işaretlenmiş diğer hareket bozukluklarının da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklarda önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokolün amacı, Spinoserebellar ataksi tip 1 (SCA1) mitokondriyal disfonksiyon değerlendirilmesi ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak için suda çözünür bir bileşik süksinik asit yoluyla metabolik solunum farmakolojik hedefleme etkinliğini değerlendirmektir. Bu yaklaşım, diğer serebellar hastalıklar için de geçerlidir ve suda çözülebilen tedavilerin bir konakçıya uyarlanabilir.

Mitokondriyal solunumun ex vivo analiz algılar ve mitokondriyal fonksiyon hastalıkla ilişkili değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Genetik delil (yayınlanmamış veri) ve SCA1 fare modelinde mitokondriyal disfonksiyon proteomik delil ile, suda çözünen metabolik güçlendirici s ile tedavinin etkinliğini değerlendirmekev kafes içme suyu doğrudan bu bileşiği çözülerek uccinic asit elde edildi. kan-beyin bariyerini geçmek ilacın özelliği, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak çıkarılabilir. Bu bileşiklerin etkinliği daha sonra hızlanan totarod, Denge testi ve ayak izi analizi de dahil olmak üzere çok sayıda davranış paradigmalar kullanılarak test edilebilir. Serebellumun Cytoarchitectural bütünlüğü Purkinje hücresi çekirdek ve Purkinje hücresi dendrit ve soma tespit imüno-flüoresan deneyleri kullanılarak değerlendirilebilir. Bu yöntemler, mitokondriyal disfonksiyon ve serebellar nörodejeneratif hastalık suda çözünür bileşikler ile tedavinin etkinliğini belirlemek için güçlü bir tekniktir.

Giriş

Mitokondri elektron taşıma zinciri kullanarak oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ile üretilen mitokondriyal ATP çoğunluğu ile, adenozin trifosfat (ATP), hücresel enerji için önemli bir koenzim önemli üreticileridir. Beyin, yüksek metabolik talep ve nöral aktiviteyi güç için oksidatif fosforilasyon olan bağımlılığını göz önüne alındığında, mitokondriyal disfonksiyon son derece hassastır. Bunun bir sonucu olarak, mitokondriyal disfonksiyon yaşlanma sürecinde tetiklenir 1 ve birden fazla nörodejeneratif hastalıklar, 2, 3, 4 patojenezinde rol oynar. Nedenle, mitokondri nörodejenerasyonun için cazip tedavi hedefleri olduğunu izler.

Bu protokol, biz mitokondri çalışmanın bir model nörodejeneratif hastalık olarak Spinoserebellar ataksi tip 1 (SCA1) kullanımını benimsemişl disfonksiyon ve mitokondriyal hedefli tedavilerin geliştirilmesi. SCA1 diğer beyin bölgelerinde Purkinje beyincik nöronların ve nöron ilerleyici dejenerasyonu tetikler ataksin-1 gen ürününde bir poliglutamin (poliQ) tekrar genişleme mutasyonu neden olmaktadır. Bir Purkinje hücresi spesifik promotörünün kontrolü altında bir poliQ mutant ataksin-1 transgeni ifade (SCA-1 fare gibi belirlenen) Burada kullanılan transjenik fare soyu, SCA1 5 Purkinje hücresi bileşeninin hedeflenen analizi sağlar. SCA1 fareler kademeli Purkinje hücre dejenerasyonu geçmesi ve ataksik yürüyüş 6 gelişir.

Mitokondriyal karmaşık disfonksiyon ve mitokondriyal hedefli tedavi etkinliği, moleküler ve davranışsal deneyleri bir pil ile değerlendirilebilir. Mitokondriyal karmaşık disfonksiyon serebellar doku içinde değişmiş oksijen tüketimini tespit solunum tahlilleri ile ex vivo ölçülürelektron taşıma zinciri yüzeyler ve inhibitörleri 7 varlığı. Solunum tahlilleri, daha önce permeabilize doku mitokondriyal izolatlar ve bütün doku 7, 8, 9, kullanılmıştır. Bunlar transmisyon elektron mikroskobu ya immünofloresan boyama gibi morfolojik veri toplama yöntemlerinin aksine mitokondriyal fonksiyonun doğrudan değerlendirilmesi için izin verir. Bütün dokusu yerine izole mitokondri kullanımı izolasyon işlemi 7 sırasında oluşabilecek sağlıklı mitokondri önyargılı seçimini önler. gösterildiği gibi protokole adapte olduğunda, solunum tahlil serebellar nörodejeneratif hastalık durumlarında mitokondriyal disfonksiyon tespit etmek için değerli bir yöntemdir.

metabolizma spesifik olmayan aktivatörler nörodejeneratif hastalığı etkeni transgenik fare modellerinde mitokondriyal disfonksiyon anlaması için kullanılabilirE ve yeni tedavilerin geliştirilmesinde yardım. Kersetin, koenzim Q10 ve kreatin tüm hastalarda ve nörodejeneratif hastalık 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, hayvan modellerinde nörodejeneratif hastalık patolojisini iyileştirilmesi için gösterilmiştir. Burada metabolizmasını uyaran ve nörodejeneratif hastalıkta mitokondriyal fonksiyonu artırmak için yeni metabolik aktivatörü, süksinik asit, sunuyoruz. Aktivatör, kan-beyin bariyerini geçen olduğundan emin olmak için, HPLC ile tedavi edilmiş farelerde 17 nöral dokuya teslim tespit etmek için kullanılmıştır.

succinic asit ile oluşturulursa metabolik hedeflenen suda çözünür bileşiklerin terapötik etkisini değerlendirmek için, davranış paradigmalar ve immünopatolojik çalışmalar pil kullanılabilmektedir. duserebellar nörodejeneratif hastalık, ayak izi pist deneyi, ışın deneyi ve hızlanan dönen çubuk deneyinde bulunan motor koordinasyon açıkları e davranışsal patoloji 6, 18, 19 kurtarma tespit etmek için kullanılır. Bu önlemler, serebellar doku 6, 20, 21, tanımlı bir lobülün içinde molekül (Purkinje hücresi, dendritik mili uzunluğu olarak tanımlanır) tabaka kalınlığı ve Purkinje hücresi soma sayımları değerlendirerek serebellar hücre mimarisini bir immünopatolojik değerlendirilmesi ile takviye edilmiştir. Burada metabolik hedeflenen suda çözünür bileşikler ile tespiti ve mitokondriyal disfonksiyon tedavisi için çok sayıda nöropatolojik ve davranışsal yöntemler sunuyoruz.

Biz SCA1 tran mitokondriyal disfonksiyon analiz mitokondriyal solunum ex vivo analiz kullanmaksgenic fare. Ayrıca, hastalık semptomları ve patolojisi daha SCA1, hastalığın ilerlemesine mitokondriyal fonksiyon bozukluğu karıştığı, suda çözünür mitokondriyal güçlendirici süksinik asit ile geliştirilmiş olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol fare ile çalışmak için Skidmore College'de IACUC kuralları takip eder.

Suda çözülebilen bileşiklerinin 1. Tedavi

  1. Kafes, içme suyu içinde 0.75 mg / ml'lik bir konsantrasyona süksinik asit içinde çözülür. istenen konsantrasyonda ilgi herhangi bir suda çözünür bileşik, bu aşamada ikame edilebilir unutmayın. Bileşik tamamen çözündüğünden emin olmak için çözelti karıştırılır.
  2. farelerin tedavisine istenen yaşına sonra, adım 1.1 çözümü ile tedavi koşulu grubunun ev kafes içme suyu değiştirin.
  3. hem tedavi ve kontrol fareleri aynı miktarda su içme emin olmak için her gün iki tedavi ve kontrol grubu su şişeleri ağırlığını ölçün. kafes başına toplam ilaç dozu hesaplamak için bu ölçümleri kullanın. Deney ve monitör şişe ağırlığı boyunca tedaviye devam edin.

2. Ayak İzi Analizi

  1. zemin üzerine pist yerleştirin veyaKapalı bir odada bir tablo. Yatak ve ödül gıda ile kaplı ev kutusuna doğru hafifçe yukarıya kaldırarak (örneğin şekerli tahıl) pisti ayarlayın. beyaz bir kağıda ile pistin uzunluğunu hattı. konu 5 dakika boyunca ev kutusuna gelmesini bekleyin.
  2. mavi ve kırmızı toksik olmayan su bazlı boya ile, sırasıyla, ev kutusundan konuyu çıkarın ve sol ve sağ arka ayakları boya. Boya baskılar birden fazla çıkış davranışsal ölçümleri hesaplamak için kullanılır.
  3. pist başında konusunu yerleştirin ve konu ev kutusuna yürümek izin. konu ev kutusunu ulaştığında, tuzak kapağını kapatın ve konu ilgili ana kafesine dönmeden önce bir dakika boyunca evde kutusu içinde kalmak için izin verir. % 30 etanol ile pist ve ev kutusunu temizleyin ve yatak yerine, gıda ödüllendirmek ve bir sonraki konu için pist kağıdı.
  4. alınan dönüş adımlar sayısını, kapının genişliği, adım açısı ve sayısını ölçmekDaha önce 6 açıklanan analitik yöntemlere göre konuya göre. Başarılı bir ayak izi deneme etrafında dönen ya da durmadan konu hedef kutusuna doğru yürüyor olduğu 5 ardışık ayak izleri asgari olarak tanımlanır.

3. Kiriş Analizi

  1. Aşağıdaki 6 kirişler ile daha önce 6 açıklanan çubuk çapraz özelliklerine göre ışın cihazı kurmak: kiriş 1 = dikdörtgen, 28 mm genişlik; kiriş 2 = yuvarlak, 28 mm çap; kiriş 3 = dikdörtgen, 12 mm genişliği; kiriş 4 = yuvarlak, 12 mm çap; kiriş 5 = dikdörtgen, 6 mm genişliği; kiriş 6 = yuvarlak, 6 mm çapında. kirişin bir ucunda, ödül gıda ile karanlık bir ev kutusu kurmak.
  2. kiriş ilgili konuları yetiştirmek, yavaşça ev kutusuna ışın karşısında sonuna oturtmak kiriş 3 ile cihazı monte ve konu üzerinde yürümek için izin verir. Başarılı bir çalıştırmak elde etmek için üç 2-min çalışmalarda her konuyu izin, Kiriş kapısı ve 2 dakika içinde ev kutusunu girme olarak tanımlanan. denemelerde arasında, 2 dakika süreyle ev kutusundaki konu dinlendirin. konular arasında,% 30 etanol ile kiriş ve ev kutusunu temizleyin ve bir sonraki konu için hazırlık ödül gıda değiştirin.
  3. 3 ardışık eğitim gün toplam sonuçlanan önümüzdeki iki gün boyunca günde bir kez adımı yineleyin 3.2. Test günü, günde 4, sırayla eğitim günleri takip etmelidir.
  4. 4. günde konuları test etmek için, öncelikle kiriş 1 ile cihazı montajı ve adım 3.1 anlatıldığı gibi ev kutusunu kurmak. aparatın önünde bir video kamera yerleştirin ve tam ışın cihazı açıkça videoya yakalanabilir doğrulayın. Başarılı bir deneme tamamlamak için 3 2-min denemeye kadar izin Kayda başlamak ve ev kutusuna ışın karşısında ilk konuyu yerleştirin. denemelerde arasında, ev kutusuna 2 dakika süreyle geri kalanı tabi izin verir.
  5. numara sırasına göre altı kirişlerin her birinde konu test etmek için DevamBir sonraki ışın başlamadan önce ev kutusuna 2 dakika dinlenmeye konuyu sağlıyor. denekler arasında, her kiriş ve% 30 etanol ile ev kutusunu temizleyin ve her konu için hazırlık ödül gıda değiştirin.
    1. Videotape her deneme ve aşağıdaki gibi ışın başına konu başına başarılı çalışmaların sayısını kaydetmek: '1' konu, ilk deneme başarılı olduğunu gösterir '2' konu, ikinci deneme başarılı olduğunu gösterir '3' konu olduğunu gösterir üçüncü ve son deneme başarılı ve '4' konu üç çalışmanın herhangi başarılı olmadı gösterir.
  6. konunun deneysel koşullara kör olan skorer tarafından çalışmalar tedbir footslips video kayıtlarını kullanın. kirişin uzunluğu boyunca teorik orta hatta alt kısmında bulunan kamera daldırma doğrudan görünümünde arka ayak gibi footslip tanımlayın. Birden skorer gelen ortalama footslip puanları.
  7. s sayısını analiz etmekuccessful denemeler ve footslips veri sayısı, her genotip ve deneysel koşul kohort içinde ortalama ve standart hata hesaplayın. Başarılı çalışmaların ve footslips sayısı sayısı tedavisi ve genotip bir etkisi olup olmadığını belirlemek için tek yönlü ANOVA ve çoklu karşılaştırmalar post-hoc analiz yapmak.

4. rotarod hızlandırılması

  1. yargılama başlamadan önce deney odası 10 dk konuları alıştırıldı. Bu uyum sağlama sürecinde,% 30 etanol ile cihazın her bir şerit, temizleme rotarod aparatı hazırlanması.
  2. rotarod yazılımını açın ve 40 rpm 5 dk ve son hız ayarları 4 rpm ayarları, ivmesi ayarlarını başlatmak ayarlayın. 5 dakikalık bir süre boyunca 40 rpm - Bu ayarlar 4 sabit bir ivme sağlar. Fareler, 10 dakika maksimum çalışma uzunluğu için hızlanma süresinden sonra ilave bir 5 dakika boyunca 40 rpm'de döner çemberde geçirdiği kalabilir.
  3. Post-acclimation, yer konular okendi şerit totarod nto çubuk 4 rpm'de dönerken. Tüm denekler kendi şerit içinde bir kez, ilk deneme başlayacak. cihaz yazılımı kullanarak düşmeye gecikme kaydedin; ikinci bir zamanlayıcı yedek olarak kullanılabilir.
  4. Deneme tamamlanmasının ardından, yorgunluğu önlemek için bir sonraki duruşma öncesinde on dakika kendi şerit rezervuarlarda dinlenmek için her konuyu sağlar.
  5. Tekrarlayın dört deneme olmak üzere toplam 4.3 ve 4.4 adımları tekrarlayın.
  6. Deneme süresi boyunca tedaviye devam, dört gün üst üste olmak üzere toplam 4,5 - Tekrar 4.3 adımları. Tamamlandığında, konu 6 başına her deneme için dönen çubuk düşmek gecikme ölçmek.

5. Serebellar Ekstraksiyon ve Fiksasyon

  1. Kurumsal IACUC kurallarına göre Karbondioksit boğulma yoluyla fareler Euthanize. karbondioksit odasına konuyu yerleştirin ve odasına karbondioksit bırakın. İzlemekötenazi adımı sırasında her zaman hayvan ve gözetimsiz hayvan bırakmayın.
  2. nefes durdu ve konular arka ayak basıncı ile hiçbir kalan ağrı algısını göstermektedir sonra odasından konuyu kaldırmak ve kaudal epitel dokusu ile kafatası tabanına kafatasının ortasından epitel doku içinden üstün bir orta hat kesi yapmak.
  3. Diseksiyon makas kullanarak, bregma sagital sütür ile omurilikten de tabandan kafatası kesti. Künt forseps kullanarak frontal, parietal ve interparietal kemikleri çekerek önce her koronal sütür ile yanal kesti.
  4. beyincik kemik yanal koparmaya künt forseps kullanabilir. kolikül ve beyin beyincik ayırmak ve doku geri kalanından a'ya forseps kullanabilir. forseps ile sağ ve sol hemisfer içine beyincik ayırın.
  5. Hemen HPLC analizi için kaydetmek için sıvı azot içine doğru cerebelli koyundoku fiksasyonu önceden soğutulmuş% 4 paraformaldehid (PFA) içine parçalama ve sol cerebelli. aort kesilmesinin ve kurumsal IACUC kurallarına göre karkas atılmadan önce ilgi herhangi başka bir dokusunu hasat.
    DİKKAT: PFA son derece toksik yanıcı ve tahriş edicidir.
  6. Yirmi dört saat sonra ekstraksiyon, en fazla 4 ° C'de% 30 sukroz içinde doku yerleştirmeden önce (üç kez 5 dak / yıkama) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde PFA (PBS içinde% 4), sabit doku yıkama 2 hafta.

6. İmmunopatoloji Deneyi

  1. Bir lavabo musluk ve sıcaklık kontrol kutusuna bir kızak microtome boru takın. -25 ° C'ye mikrotom sahne soğutmak için sıcaklık kontrol kutusunu kullanın. 50 um kesit kalınlığı kadranını.
    NOT: kızak mikrotom üzerinde arama ince bir ayara kadranını ve buna göre ayar kaydırarak kalınlığı çarpın, 50 mikron ulaşamazsa (örneğin d set10 um ial ve 50 uM), toplam kalınlık için kesit önce beş kez kaydırır.
  2. sahneye Optimal Sıcaklık Kesme (OTC) çözümün bir kuruş boyutunda kısmını hafifçe sürün. OTC donuyor önce, mid-sagital kesim yüzeyi OTC katman üzerinde aşağı bakacak şekilde yarımkürede konumlandırmak için forseps kullanabilir. yarımkürede lateral ucu aşamasına üstün bıçak, doğru işaret böylece hızla çalışarak, yavaşça forseps ile doku yönlendirmek. OTC tamamen donmasına izin verin.
    1. katmanlar halinde çalışarak, OTC sonraki katmanı eklemeden önce tamamen dondurmak için izin doku etrafında ek OTC ekleyin. doku ve donma üstünde OTC ince bir katman ekleyin.
  3. Bölüm doku, kesit ise kesme bıçağı üzerine eşit vücut ağırlığı dağıtmak. 1x PBS içeren bir şekilde etiketlenmiş iyi plaka içine ince bir sanatçı boya fırçası ve yer kullanarak bölümleri toplayın. bölümler arasında, üzerinde kesme kalınlığını yeniden ayarlamakGerekirse 50 um, mikrotom kadranı kızak.
  4. Üre çözeltisine [PBS içinde 0.01 M üre] ile iyi bir plakanın her bir PBS yerine ve buz üzerinde plaka koyun. Hazır olduğunuzda, 15 saniye boyunca üre çözeltisi içinde immunolabeling için epitoplar meydana çıkarmak için her seferinde üç kez buz ve kaynatın bölümlerden plakasını çıkarın. Bu adım kolayca kaynama ayarlanmış bir ısıtma bloğu üzerinde plaka yerleştirerek gerçekleştirilebilir. Her kaynar adım arasında, buz üzerinde doku bölümleri içeren plaka serin.
    Not: 96 oyuklu bir plaka içerisinde, birincil antikor, ikincil antikorun bağlanması ve DAPI adımları engelleme üre gerçekleştirmek için, içinde 100 uL birimleri kullanır. Farklı büyüklükte de kullanılırsa, buna göre reaktif hacimlerini ayarlamak. Bir ısıtma bloğu yerine, bir mikro dalga üre doku örnekleri kaynatmak için kullanılabilir. Üç 15 s aralıklarla ayarı yüksek bir güç mikrodalga örnekleri.
  5. Mesaj kaynama, çözüm yerine, numaralı bölümleri üç kez, her zaman mevcut çözüm çıkarmadan yıkama1 x PBS ile 10 dakika süre ile çalkalanmıştır.
  6. Oda sıcaklığında yumuşak çalkalama ile bir saat süreyle serum içerisinde dokuyu inkübe etme ile eşek serumu çözeltisi (% 3 normal eşek serumu, PBS içinde% 0.3 Triton X-100) ile blok bölümleri. eşek serum çözüm çıkarın.
  7. 0.2 ug / ml anti-kalbindin ve 1 etiket bölümleri: eşek serumu çözeltisi içinde 2.000 anti ataksin-1 antikoru (11NQ) 16 ve yumuşak çalkalama ile 72 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  8. (500 Alexa Fluor-488-anti-keçi, 1: eşek serumu çözeltisi içinde seyreltilmiş 500 Alexa Fluor-594-anti-tavşan antikorları, 1), 4 ° C'de uygun bir ikincil antikor bölümleri inkübe önce adım 6.5 olarak PBS ile bölümleri yıkayın yumuşak çalkalama ile 48 saat karıştırıldı.
  9. DAPI ile markalama hücre çekirdeğinde önce adım 6.5 (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) PBS içinde 0.5 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar seyreltilir solüsyon olarak kesitler, PBS ile üç kez yıkanır. DAPI kuluçka on dakikayı geçmemelidir. Solutio kaldırn ve adım 6.5 olarak PBS ile yıkayın.
  10. photobleaching azaltmak üzere, aracın montajı% 2 jelatin kaplı slaytlar üzerine monte dokusudur. Lamel ve tırnak cilası ile mühür.
  11. Bir tarama konfokal mikroskop ile aydınlık ışığı altında beyincik birincil çatlak bulun. 10X UIS2 amacı ile, tarama ve sırayla bir DM488 / 559 nm ile birlikte DAPI, AlexaFluor-488 ve sırasıyla 405 nm diyot lazer, 488 nm argon gazı lazer ve 559 nm diyot lazer kullanılarak AlexaFluor-594 kanal, heyecanlandırmak dikroik ışın ayırıcı. Ayrı ve sırasıyla SDM490 ve SDM560 ışın bölücülerin ve BA575-675 bant geçiren filtre kullanarak ışık yaydığı toplamak.
    1. Her kanal için, z = 20 mikron ve adım = 0.1 mikron ile birincil fissür içinde z-yığını inşa. Nihai görüntü bir boyut işaretleyici eklemek konfokal mikroskop ile sağlanan post-processing yazılımını kullanın.
      Not: Alternatif lazerler, filtre ve flüoroforlar availabili göre ikame edilebilirty. AlexaFluor-488 veya AlexaFluor-594 algılama zayıfsa, bir galyum fosfit (GaAsP) yüksek hassasiyetli dedektör varsa sinyalini arttırmak için kullanılabilir.

7. ükler Moleküler Tabaka Kalınlığı ve Purkinje Hücre Numaraları

  1. ImageJ, lekeli birincil fissür z-yığın görüntüyü açmak ve Renk Menüsü Resim sekmesinden Bar, 'Renk' ve 'Bölünmüş Kanallar' dan 'Image' seçerek onun kırmızı, mavi ve yeşil kanallara her görüntüyü bölünmüş kullanarak sekmesi.
  2. bölündü her kanalın maksimum Z projeksiyon oluşturun. ilgi kanallı görüntü açıkken, menü çubuğundan 'Resmi' seçeneğini, "Bölümler" sekmesinden Resim sekmesinde ve 'Z-projesi' dan 'Bölümler'. 'Z-proje' komutu menüsü içinde, 'Max Z projeksiyonu' seçin ve 'Tamam' düğmesine tıklayın. Her kanal için tekrarlayın.
  3. inci 'Eklentiler' seçerek Hücre Sayım eklentisi açıne Menü Çubuğu, Analiz sekmesinden "Sayacı Cell" Eklentiler sekmesinden 'Analiz' ve.
    NOT: ImageJ ve ImageJ Hücre Sayım Cihazı eklentisi Malzeme ve Ekipman Tablo sağlanan web sitelerinde indirilebilir.
  4. Birincil fissür anterior ve posterior uzunlukları önceden belirlenmiş bir 200 um streç boyunca uzanan ataksin-1-işaretli çekirdekleri sayarak Purkinje hücrelerinin sayısını ölçmek. ataksin-1 etiketli çekirdeklerin durumunda ilgi kanalı (kırmızı bir eşik harita yapmak ayarlayın sekmesinden Resim sekmesinde ve 'Eşik' dan 'yapılması' Menü Bar 'Image' seçerek eşik harita kullanmak ).
    1. ölçümü (örneğin 31-225 piksel) boyunca normalize edilebilir piksel aralığı seçin. Eşik penceresinde "Karanlık Arka Plan" kutusunu işaretleyerek görüntüleri gürültü atın. Görüntü sinyali sayma kolaylığı için ters olabilir.
  5. Moleküler tabaka thic niceliğiniAdımlar 7.1 ve 7.2 gibi 'Bölünmüş Kanallar' ve 'Eşik' Haritası aracını kullanarak yeşil kanalda kness. Bir kılavuz olarak her görüntünün boyut kalem kullanarak, rastgele her birincil fissür görüntünün 200 mikron uzanıyor belirlenen iki her birinde üç moleküler tabaka uzunluklarını ölçmek. Purkinje dendritik çardak uzak ucuna Purkinje soma dibinde Purkinje dendritik çardak proksimal ucundan ölçümleri yapmak.
  6. Kayıt Purkinje hücre sayımları ve aracı olarak moleküler tabaka kalınlığı artı veya eksi standart hata. Çoklu karşılaştırmalar ile hücrelerin sayısında ve dendritik çardak uzunluğuna tedavi koşulları ya da genotip etkisini test etmek post-hoc analizi tek yönlü ANOVA gerçekleştirin.

Serebellar süksinik asit konsantrasyonları Mesaj muamele 8. HPLC Analizi

  1. Analiz için Numune Hazırlanması
    1. önce her hasat sağ serebellar yarımküre tartmakHPLC analizinde kullanımı. Her homojenize devre 17 metanol çözeltisi: Su önceden soğutulmuş Dounce homojenizatör içinde aynı anda hemisferik Yarıları bir kıyma ve (hacim ile) 75:25, 0.5 ml.
    2. dar bir ön-soğutulmuş homojenleştirici kullanılarak, fena halde 5 Dounce vuruş ile doku break up. ince 20 Dounce vuruşları uygulamak, daha geniş bir homojenleştirici her doku örneği kıymaya devam ediyor.
    3. ependorf tüp soğutulmuş öncesi homojenatları aktarın. Her numune sonra, buz soğukluğundaki su, 0.5 mL homojenleştirici yıkayın: metanol çözeltisi ve mikrosantrifüj tüpüne durulama ekleyin.
    4. Santrifüj homojenat örnekler 25 ° C'de 30 dakika boyunca 1300 x g'de ve temiz bir mikrosantrfuj tübüne supernatant toplamak.
    5. 10 kilodalton (kDa) nominal moleküler ağırlık sınırı bir rejenere selüloz filtre ile yerleştirilmiş bir santrifüj filtre ünitesi sayesinde süpernatant Filtre. hemen HPLC analizi çalışmıyorsa, mağaza -80 ° örnekleri süzülmüşC.
  2. HPLC Alet ve Koşullar
    1. En az 30 cm'lik bir uzunluğa ve yüksek performanslı sıvı kromatografi ile 7 um arasında bir parçacık boyutu olan bir iyon dışlamalı kromatografi sütunu takın.
    2. Hazırlama 5 arasında bir pH değerine ayarlanmıştır, 1 mM asetat tamponu yeterli miktarda gaz boşaltılır.
    3. 0.8mL / dak, mobil faz hızı ile HPLC ayarlayın. UV-Vis detektörü kullanılarak durumunda, 224 nm dedektör dalga boyu seçin. Bu koşullar altında süksinik asit için tipik yıkama süreleri, 10 ve 12 dakika arasındadır.
  3. Koşu ve Standartlar ve Örnekleri Analiz
    1. 0 ile 250 ppm arasında süksinik asit konsantrasyonları asetat tamponu mobil fazda bir dizi standardı hazırlayın.
    2. Her standart çalıştırın ve her çalışması ölçülen pik alanını kullanarak bir kalibrasyon eğrisi hazırlamak.
    3. doğru bir standart eğri elde edildikten sonra, asetat tamponu içinde seyreltilmiş önceden hazırlanmış örneklerini yürüt.ölçüm daha doğruluğu için, numuneler, mobil faz içinde seyreltilmiş olan süksinik asit, bilinen konsantrasyonları ile delinmiş olabilir. üç nüsha tüm örnekleri çalıştırın.
    4. numune hacmi ile çarpılması ve orijinal numune kütleye bölünmesiyle kalibrasyon eğrisi kullanılarak ve örneklerin süksinik asit konsantrasyonunu tespit etmek için HPLC kromatogramlar analiz edin.

Bir Oksijen Elektrot Kontrol Ünitesi Kullanma Serebellar Mitokondriyal İşlevselliği 9. Ex Vivo Analizi

  1. İlk potasyum klorid düşüşü uygulanarak ticari olarak temin edilebilen bir sistem kullanan bir Clark-tipi elektrot oluşturma (% 50 KCI / h) Platin katodda çözeltisi, ticari bir tütün 1.5 cm2 parçanın kesilmesi haddeleme kağıt ve yavaşça kağıt üzerinde yerleştirerek platin katot.
    1. Politetrafloroetilen (PTFE) kağıt 2.5 cm2 parça ile katot ve çevresindeki anot kaplama ve kuytu hem memb güvenceyeolmadığından emin yapma Ç halkalarla ranes, zarların içinde hiçbir kıvrımları veya kabarcıklar vardır. iyi çevredeki içine% 50 KCl çözeltisi damla.
  2. tahlil odasına premade elektrot Güvenli ve hava doymuş su ile doldurun. 30 ° C'ye ısıtın odası, çözeltiye 0.8 cm bir karıştırma çubuğu ilave edin ve gösterge yazılımı kullanılarak 70 rpm'de karıştırın. sıfır oksijen kurarak odasına kalibre edin. Bunu yapmak için, seri çözeltiye indirgeyici madde, sodyum ditiyonit birkaç kristali ekleyin.
    1. Kalibrasyon elde edilir,% 70 etanol ile bir kez bölme yıkama ve sonra, (5 mM MgCl2, 60 mM KCI, 100 mM mannitol, 10 mM odası solunum tamponu 1.5 mL gelmesini izin vermeden önce deiyonize su ile altı kez yıkama KH 2 PO 4, 0.5 mM Na2EDTA, 60 mM Tris-HCI [pH 7.4]) 7.
      NOT: sodyumditiyonit tüm izleri tamamen ölçmek için denemeden önce yıkama adımları sırasında kaldırılması gerekirSolunum deneyler sırasında oksijen konsantrasyonu.
  3. Yavaşça homojenat tamponu 0.5 mL tartılır serebellar hemisferlerin homojenize (0.25 M sukroz, 0.5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI [pH 7.4]). temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne Homojenat aktarın ve tahlil başlamadan kadar soğutulmuş tutun.
  4. 2 ml'lik bir son hacme ulaşan bölmeye Homojenat ekleyin. digitonin veya saponin (5 mg / mL) 40 uL eklenmesiyle serebellar Homojenat permeabilize; Homojenize doku, 10 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Digitonin ve saponin toksik ve inkübasyon süreleri minimumda tutulmalıdır.
  5. oksijen tüketimini kaydetmeye başlamak için, aktivasyon ve sırasıyla alt tabakaların ve inhibitörlerin kullanarak oksidatif fosforilasyon zinciri (3 dk kayıtları substrat başına) engellenmesi yoluyla mitokondriyal fonksiyonunu belirler.
    1. aşağıdaki gibi temiz şırıngalar kullanılarak yüzeyler ekleyin: 10 uL 2 M glutamat [nihai konsantrasyon (fc) 0.01 M],5 uL 0.8 M malat [fc 2 mM], 20 uL 0.5 M adenozin difosfat (ADP) [fc 5 mM], 1 uL 1 mM rotenone [fc 0.5 uM], 20 uL 1M süksinik asit [10 mM], 1 ul 5 mM antimisin [FC 2.5 uM] 1 uL 0.8 M askorbat [FC 0.4 mM] ve 5 uL 0.2 M tetrametil-p-fenilendiamin (TMPD). [Fc 0.5 mM] odasına yüzeylerde eklerken sisteme hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun.
      NOT: Her alt-tabaka ve inhibitör ile kaynaklı fonksiyonel etkisi ile ilgili detaylı bilgiler, daha önce yayınlanan bir protokolün 7'de tarif edilmektedir. Bireysel bir doz-yanıt eğrilerinin, daha önce ele preparasyonlar / dokular / türlerde substratların ve önleyicilerinin uygun konsantrasyonlarını belirlemek için oluşturulan gerekebilir. Aynı şekilde, protokol dokusunun doğuştan metabolik eğilimleri için optimize edilebilir / türler gibi alt tabaka tercihleri ​​gibi, çalışılmaktadır.
  6. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, yavaşçaserebellar homojenatları spirate ve etanol ve deiyonize su ile haznesi temizlenir. Bir kez temiz, ek serebellar homojenat örnekleri sürece PTFE membran bozulmadan kalır olarak ek kalibrasyon olmadan çalıştırılabilir. silika jel veya kurutucu ile iyonu giderilmiş su ve etanol ve mağaza nihai tamamlama temiz elektrot sonra.
    NOT: Aynı gün çalışan arasında deiyonize su membran kurumasına olmadığını sağlamakla odasını doldurun.
  7. enstrüman yazılımı tarafından oluşturulan veri sayfasını kullanarak, iki dakika başlayan solunum verilerinin ihracat 40 dk bir elektronik tablo programına substrat ilavesi sonrası.
  8. substrat veya inhibitör başına solunum hızını hesaplayınız. askorbat-TMPD substrat eklenmesi sırasında solunum hızı, toplam solunum bölerek veri normalleştirmek.
    Not: solunum hızı nörodejenerasyon deneyler özellikle istenebilecektir doku protein içeriği daha fazla normalleştirilmiş olabilirki burada doku içeriği değişebilir. Bunu yapmak için, bir standart protein deneyinde kullanılmak için (adım 9.3) Örnek homojenat 50 uL saklıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

süksinik asit ile serebellar mitokondri farmakolojik hedefleme sayesinde serebellar nörodejeneratif hastalık SCA1 bir fare modelinde mitokondriyal disfonksiyon önlemek edebiliyoruz. Suksinat dehidrojenaz, süksinik asit, kanonik elektron verici işleme (Şekil 1A), aşağıdaki tedavi ve nöropatolojik değerlendirme ikinci haftasında davranışsal değerlendirme başlangıcı ile, bir ay SCA1 farelerin ev kafes içme suyu içinde çözülmüştür. Izi tahlilinde, kiriş dene...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

tarif edildiği gibi, bu yöntemler kullanılabilir, bunlar tespit ve serebellar nörodejeneratif hastalık fare modellerinde oksidatif fosforilasyon aracılı mitokondriyal fonksiyon bozukluğu hafifletme yeteneğine sahiptir. Kombine biyokimyasal ve davranışsal deneyler serebellar nörodejeneratif hastalık patolojiye mitokondriyal katkının boyutlarını belirlemek için çok yönlü yöntemlerdir. metabolizmayı uyarır ve mitokondriyal fonksiyonunu artırmak için süksinik asit ile fareler tedavi, biz serebellar davranış açıkları ve sere...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Minnesota Üniversitesi'nden Dr. Harry Orr'a transgenik farelere cömert hediyesi için teşekkür ederiz. Ayrıca, önceki deneyleri gerçekleştiren çalışmaları için aşağıdaki Skidmore College mezunlarına da teşekkür etmek isteriz: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson ve Cheyanne Slocum. Ayrıca, bu yöntemlerin geliştirilmesini finanse ettiği için Skidmore College'a teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Adenozin difosfatSigma AldrichA2754ADP
AskorbatSigma AldrichA7631
Sığır serum albüminiSigma AldrichA2153BSA
4 ', 6-Diamidino-2-fenilindolSigma AldrichD9542DAPI
DigitoninSigma AldrichD141
DitiotreitolSigma AldrichD0632DTT
Eşek serumuSigma AldrichD9663
GlutamatSigma Aldrich1446600
MalatSigma Aldrich6994
MannitolSigma AldrichM4125
ParaformaldehitSigma AldrichP6148
Potasyum-laktobiyonatBiyo-Şekerler69313-67-3
RotenoneSigma AldrichR8875
SaponinSigma Aldrich47036
Süksinik AsitSigma AldrichS3674
N, N, N ve prime;, N & prime; -Tetrametil-p-fenilendiaminSigma AldrichT7394TMPD
Triton X-100Sigma AldrichT9284
ÜreSigma AldrichU0631
Vectashield montaj ortamıVector LabsH-1000
Antikorlar< / güçlü >
11NQ antikoru (anti-ataksin-1 )Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 anti-fare ikincil antikoruYaşam TeknolojileriA-11015
Alexa Fluor 594 anti-tavşan ikincil antikoruYaşam TeknolojileriA-11012
Calbindin antikoru (keçi)Santa CruzC-20
Hayvanlar
Transgenik fareleri kontrol edinHarry Orr, Ph.D.A02Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
SCA1 fareleriHarry Orr, Ph.D.B05Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Wildtype farelerJackson Laboratuvarı001800
Equipment
ESM-100L mikrotomERMAKızak mikrotomu
Fluoview FV1200 Konfokal MikroskopOlympus
Gliserol-jelatin slaytlarFD Nöro TeknolojilerPO101
Hamilton şırıngaSigma AldrichVCAT 80465
OXYT1 Oxytherm Elektrot KontrolÜnitesi Hansatech Instruments
PTFE kağıdıCole-ParmerUX-08277-15
Rotallion RotarodPPP & Gbilgi için sorumlu yazarla iletişime geçin
Ultimate 3000HPLC Dionex
Software
ImageJNational Institute of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
Hücre sayacı eklentisi (ImageJ için)National Institute of Healthhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
>3P& G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod yazılımı)PPP & GBilgi için sorumlu yazarla iletişime geçin
Phidget21.dll (rotarod yazılımı için gereklidir)DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

Kaynaklar

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S ksinik Asit UygulamasDavran sal Analizlermm nofloresan AnalizlerHPLC AnaliziMitokondriyal RespirasyonSerebellar DokuN rodejeneratif Hastal k
suda çözünür Bileşikleri ile SCA1 Fare tedavisi, spesifik olmayan mitokondriyal fonksiyon Boost
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.