Bu makalede, entübasyon yoluyla fare trakea içine doğrudan bleomisin yönetmek için hızlı ve basit bir yöntem sunar. Bu yöntemin en önemli avantajları usta son derece tekrarlanabilir kolay ve özel ekipman ya da uzun iyileşme süreleri gerektirmez vardır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Trakea hızlı intübasyon için geliştirilmiş bir yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Bazı anatomik ve fizyolojik farklılıklara rağmen, fare modelleri insan akciğer hastalığını incelemek için önemli bir araç olmaya devam ediyor. Bleomisin toksisitesi, hem akut akciğer hasarını hem de fibrozu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir ve bleomisin (ve diğer toksik ajanlar) akciğerlere uygulamak için birçok yöntem geliştirilmiştir. Bununla birlikte, transtrakeal damlatma gibi bu yaklaşımların çoğunun, güçlü anestezikler ve sağkalım cerrahisi ihtiyacı da dahil olmak üzere doğal dezavantajları vardır. Bu makale, hafif inhale anestezi, trakeanın görselleştirilmesi ve maruziyeti doğrulamak için vekil spirometre kullanımını içeren hızlı, tekrarlanabilir bir intratrakeal entübasyon yöntemini bildirmektedir. Kavramın bir kanıtı olarak, 8-12 haftalık C57BL / 6 farelerine 2.0 U / kg bleomisin veya eşdeğer bir hacimde PBS uygulandı ve hem hasar hem de fibrotik uç noktalar maruziyet sonrası ölçüldü. Bu prosedür, araştırmacıların büyük bir fare kohortunu nispeten kısa bir süre içinde, çok az masrafla ve minimum işlem sonrası bakımla tedavi etmelerini sağlar.
Giriş
Bazı anatomik ve fizyolojik farklılıklar olmasına rağmen, 1 fare modelleri hayvancılık açısından bakıldığında, insan biyolojisi ve hastalık patogenezi. 2 modelleme için çok değerli, fareler, kullanımı kolay olan, düşük üreme zamanı, hızlandırılmış ömrü var ve nispeten ucuzdur devam eve. Farklı genetik suşları ve stratejiler (örn., Koşullu knock-out raportör fareler, soy izleme yaklaşımlar, vs.), ve bunun yanı sıra reaktifler geniş (örn., Antikorlar, rekombinant proteinler, inhibitörlerin geliştirilmesi ile, vb), fareler, insan homeostasis ve hastalık süreçlerini ortaya çıkarmak için önemli bir örnek omurgalı organizma haline gelmiştir. 3
Fareler insanlarda 4 ALİ travma, yaralanma veya sepsis neden olabilir. Akut akciğer hasarı (ALI) ve pulmoner fibrozis dahil olmak üzere akciğer koşulları, çalışmak için özellikle değerli olmuştur ve epitel ile karakterizedir veendotel sızıntı (yani., ödem), enflamasyon ve oluşmakta olan fibroz. Birçok hastada, ALI genellikle solunum yetmezliği nedeni ile fibroz ve ölümle sonuçlanan onun ağır formu, akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), ilerler. 5,6 pulmoner fibrozis ekstraselüler matriksin aşırı birikmesi ile karakterize ilerleyici, ölümcül patolojidir en önemlisi. Ben engelli akciğer fonksiyonu yol açan kolajen bleomisin (BLM) 7,8 Yönetim yazın deney hayvanlarında ALI ve fibroz uyarmak için en yaygın kullanılan ve en iyi karakterize modeldir. 9 kemirgenlerde pulmoner fibrozis BLM kaynaklı olsa da yapar tamamen insan fibrotik fenotipleri, bu model ile 10 fare çalışmaları başlangıcı ve hastalığın ilerlemesini etkileyen birçok önemli faktörlerden keşfine yol açmıştır özetlemek değil. 11
BLM kaynaklı fibrogenezisin arkasında kesin mekanizması (ler) bilinmemekle birlikte, başlangıç hasarınıniletken hava yolları ve alveolleri ve özellikle de tip 1 pnömositler döşeyen epitel hücrelerinde kontak bağımlı DNA zincir kırıkları kaynaklandığı düşünülmektedir. 12 BLM ve pulmoner epitel arasında doğrudan temas ihtiyacı sağlam bir dağıtım yolunun önemini vurgulamaktadır ve bu endişeleri de rekombinant proteinlerin, antikorların, siRNA, virüs, bakteri, partikül, ve daha fazlasını içeren distal hava hedeflenen tedavilerin geniş bir yelpazede, germane vardır. Orofaringeal aspirasyon (OPA), yaygın olarak, bu amaçla 13 kullanılmaktadır, ancak OPA önemli bir eksiklik teslim maddenin bir bölümü bu şekilde uygulanan dozun belirginsizlik yol mide bağırsak Yutulan edilebilir olmasıdır. Yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, doğrudan solunum yollarına bir ajanın trakea ve damlatma maruz güçlü anestezi altında trakeostomi gerektirir transtrakeal damlatma vardır. 14 Ancak, sadece bu tür olabilirBir prosedür nedeniyle invaziv olması istenmeyen olabilir, ama o da zaman tüketen bir eğitim adil biraz gerektirir ve içine ajanlar direkt uygulanmasını içerir. 15,16 Çeşitli protokoller geliştirilmiştir solunum yolu güçlü bir yaralanmaya neden cerrahi müdahaleye gerek kalmadan trakea, 16,17,18,19,20 ancak bu yöntemler geniş bir alanını içermektedir kurtarma süreleri güçlü anestezik neden, pahalı ekipman kullanımı (yani., otoskop / laringoskop, ticari olarak mevcut prosedür panoları, fiber-optik doz ile ilgili olarak tel ve benzeri), ağız boşluğu içinde manipülasyon aşırı ve belirsizlik.
Bu çalışma, bir araştırmacının hızla ucuz ve güvenilir bir şekilde çevre dokulara bakiye hasar sınırlı risk ile murin akciğer içine bir reaktif aşılamak sağlar entübasyon yoluyla uygulama nispeten kolay bir yöntem tarif etmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Washington ve Cedars-Sinai Tıp Merkezi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) bu çalışmalar için gerekli hayvan çalışmaları onayladı.
1. Hazırlık
- Künt uç forseps ve basacağı yoluyla otoklav hem sterilize.
- biyolojik güvenlik kabini kullanarak, liyofilize toz PBS içinde BLM bir çalışma stok hazırlamak. Karıştırma daha emin olmak için 35 kHz'de 10 dakika süre ile çözelti sonikasyon.
Not: ul 30 ile 45 toplam hacmi oldukça büyük hacimli pipet düşük ucunda varyasyon ve boğulma önlemek için tavsiye edilir. - Yaklaşık 1 prosedürü kendisi için m 2, yanı sıra işlem öncesi ve sonrası her iki kafesleri için belirlenen yerleri içeren temiz bir çalışma alanı hazırlayın.
- taban ve Underl genelinde laboratuvar bant 2 ya da 3 şerit koyarak hemen araştırmacı önünde tezgah prosedür kurulu tabanını Fixtezgah ying. Bir tahta oluşturma konusunda daha fazla özellikleri için Bkz: Şekil 1.
- prosedür kurulu iki konumlandırma vida arasındaki büyüklük 4.0 dikiş ipliğinin tek uzunluğunu kravat.
- kaldırılması ve üç 1 ml'lik şırınga pistonu atarak ve hava geçirmez bir mühür formu her varil üst içine PBS 60 ul yatırarak derme çatma bir spirometre oluşturun. gevşek şırınga birine kateter göbeğini Güvenli ve yönetim kurulu bir tarafa koyun.
- 1 ml şırınganın içine havanın aspire 300 ul ve yönetim kurulu bir tarafa koyun.
- bir tarafa bant uzunluğu ve yerinde yaklaşık 6 inç ek bir parça kesin. Bu aşamada 2.4 kuruluna hayvan sabitlemek için kullanılır.
- Bir izofluran odasını kurmak. Pozlama odasına ve boşluk vakum hem de uygun portlara O 2, izofluran ve vakum takın. Alternatif olarak, anestezik yönetmek bir izofluran uyumlu biyolojikgüvenlik kabini.
2. Entübasyon
- o bilincini kaybeder ve solunum uygun bir orana yavaşlatır kadar odasında izofluran ile fare anestezisi. Tipik bir pozlama 3-4 dakika süreyle% 4 izofluran ve% 2 O 2 içerir ve ideal bir sonuç sedasyon 2 ila 2,5 dk. Bu 1 nefes her 2 sn bir solunum oranına karşı gelmektedir.
- bir tarafa bir pipet ve yerine BLM 30 ve 45 ul arasında ayarlamak için sedasyon, aspirat için beklerken.
- Hazır olduğunda, işlem platformu konumlandırma vida bağlı akıştan üst kesici dişlerin tarafından sedasyon fare askıya. Hayvanın sırtı platformu yüzeye karşı düz durduğundan emin olun.
- havalandırma kısıtlamak için dikkatli olmak, sadece diyafram üstünde, gevşek göğüs boşluğunun alt (kaudal) kısmı boyunca bir parça bant yerleştirin. Yerleşim proc sırasında düzgün hizalama korumak için sıkı yeterli olmalıdıredure, ancak solunumu kısıtlar o kadar sıkı değil.
- 80 ile% ve% 100 yoğunluğuna aydınlatıcı açın ve solar plexus yakın cilt yüzeyinden 1 2 cm, böylece deveboynu yönlendirmek. Periyodik olarak fare zarar vermez emin olmak için ısı deveboynu ucu kontrol edin.
- platformun arkasında duran, dil bulmak için steril, künt uç forseps kullanabilir. Alt kesici dişler, yavaşça kavrama önlemek ve ağız boşluğunun dışında dilini çekmek için dikkatli olmak.
- Kalan elinizi kullanarak, basacağı yerleştirin ve ağız boşluğunun zemin karşı dilini düzleştirmek için kullanabilirsiniz. forseps bırakın, ancak sonraki iki aşama için yerinde basacağı bırakın.
- trakea o Ana kök bronşların seviyesine ulaşıncaya kadar güneş pleksus seviyesinden proksimal deveboynu rehberlik ederek görünür böylece ışığı yönlendirmek.
Not: trakea kolayca solunum aksiyonu ile ayırt edilebilir, WHIch şiddeti dalgalanmaya yayılan ışığı neden olur. Doğru yerleştirilmiş, bu yapının ağız boşluğunda kendisi minimal ortam ışığı ile ışık merkezi bir pim gibi eksenel düzlemde ayırt olacaktır. - Açı düz lümenine, damlacık içeren ekli şırınga ile, trakea doğal yolu izler ve 22-G kateter ucu düşürmek, böylece şırınga. PBS kabarcık yükselişi ve başarılı yerleştirme üzerine her nefeste düşmeye başlayacaktır.
Not: Bu eylem, derin sedasyon sonucunda birkaç saniye kadar gecikebilir. - ek 5 mm kateter besleyin. dil çıkarın depressor.
- yavaşça şırınga kaldırmak, ters el şırınga Shift ve göbek sürükleyici.
- Kateter hub iç merkezi haline BLM 30 ve 45 ul arasındaki mevduat, ikinci şırınga takın ve göbek içine hava 300 ul dağıtmak.
- ikinci değiştirinİlk PBS balonu içeren şırınga. kabarcık yükselişi ve işlemi başarıyla gerçekleştirildi olup olmadığını düşmeye devam edecektir.
3. Post-prosedürel Bakımı
- kateter ve bandı çıkarın ve bilinci yerine gelene kadar bir kuru ılık bir yerde hayvan yerleştirin - tipik birkaç dakika içinde.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Entübe farenin kilo kaybı ve sıkıntı için günlük olarak izlenmiş ve% 2.5 2,2,2-tribromoetanol intraperitonal enjeksiyon yoluyla 4, 10 ya da 17 gün sonra feda edilmiştir. Bronkoalveoler lavaj (BAL) PBS üç yıkamadan içinde toplandı 21 başka bir yerde tarif edildiği gibi ve sağ akciğer,% 10 formalin sabit parafine gömülü ve Washington Histoloji ve Görüntüleme Çekirdek 22 Üniversitesi tarafından Masson trikrom ile boyandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Aerosol haline getirme sınırlı olması nedeniyle reaktif temin edilebilirliği, emniyeti ve maliyet için pratik örneklerde, doğrudan nefes borusu idaresi akciğerlere dışsal ajanların uygulanması için üstün bir yöntemdir 16 Transtrakeal instilasyon yaygın Bunu gerçekleştirmek için kullanılmaktadır.; Ancak, tüm cerrahi müdahale ile olduğu gibi, o da onunla prosedürün kendisinden kaynaklanan komplikasyonlar için potansiyel taşır ve mutlaka ajan telkin ediliyor. 13 Bu nedenlerden dolay...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar trikrom boyama ve analizi ile yardım için Washington Üniversitesi Histoloji Brian Johnson ve Görüntüleme Çekirdek teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe HL098067 ve HL089455 tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Enjeksiyon için Bleomisin, 30 birim / flakon | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | En iyi sonuçlar için, BLM PBS'de askıya alınmalı, aliquoted edilmeli ve tek kullanımlık liyofilize alikotlar olarak saklanmalıdır |
| Künt Uçlu Forseps | |||
| Dil Bastırıcı (yani bükülmüş Valleylab Blade Elektrot, 2.4 ") | Covidien | E1551G | Kullanmadan önce bıçak ucundan 1,5 cm 45 derecelik bir bükülme oluşturun. Benzer boyutlardaki herhangi bir metal aletten uygun bir bastırıcı da oluşturulabilir. |
| Exel Safelet Kateter 22G X 1"Exel | International | 26746 | |
| 1 ml Kayar Uçlu Tek Kullanımlık Tüberkülin Şırınga (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0,2 ml Pipetleyici ve Filtre Uçları | |||
| Fiber-Lite Aydınlatıcı. Model 181-1: Model 180, Standart Çift Deveboynu aydınlatıcı | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Düşük çıkışlı LED aydınlatıcılar, trakeayı yeterince aydınlatamadıkları için önerilmez. |
| Entübasyon Kurulu | Şema 1'e bakınız. | ||
| Renkli Etiket Bandı: 0.5 içinde. Geniş | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oksijen | |||
| Fosfat Tamponlu Salin, 1X | Corning | 21-040-CV | Ürün steril olmalıdır |
| Steril Olmayan İpek Siyah Örgülü Sütür Makarası, 91.4 m, Boyut 4-0 | Harvard Aparatı | 517698 | |
| Masa Üstü Anestezi Makinesi İzofluran | Yayla Tıbbi Ekipmanları | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top İndüksiyon Fare İzofluran Odası | MIP / Anestezi Teknolojileri | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (izofluran, USP) İnhalasyon İçin Sıvı 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Dijital Patoloji sistemi | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Kantifikasyon Kiti | Bethyl Laboratuvarları | E90-101 |
Kaynaklar
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601(2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261(2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
