Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
canlı hücrelerde dinamik sinyal olaylarının Görselleştirme bir meydan okuma olmuştur. Bu, bitki hücrelerinde sinyal transdüksiyonu uzaysal dağılımının izlenmesi için test protein-protein etkileşimi kurulu bir geçici ifade sisteminin tütün epidermal hücrelerinde biyomoleküler floresan tamamlama (BiFC) deneyi genişletilmiştir. Bu protokol, etkileşimi ve Arabidopsis MAPKKK Yoda ve MAPK6 arasındaki sinyal plazma membranında meydana göstermek için BiFC tahlili kullanılmıştır. çatgı proteini BASL birlikte ifade edildiğinde Yoda-MAPK etkileşimi dağıtılabilir ve mekansal CFP-BASL ile birlikte polarize. Bu modifiye tütün sentezleme sistemi lokalizasyonu ve dinamik değişiklikleri (az 4 gün) ve floresan protein renk (en az üç) çarpanı ağırlayacak sinyalizasyon hızlı inceleme için izin verir. Biz de protein dağılımı (asimetrik mekansal lokalizasyonu, ya da "kutuplaşma" ölçmek için ayrıntılı yöntemler sundu;), Tütün hücrelerinde. Bu gelişmiş tütün ifade sistemi, canlı bitki hücrelerinde dinamik sinyal olaylarının hızlı test için yaygın olarak kullanılan bir potansiyele sahiptir.
Giriş
Proteinler öngörülemeyen hücresel ortamda meydana gelen neredeyse tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır karmaşık bir hiyerarşik ağ ve form kompleksleri içinde etkileşimde. Ancak, büyüme yanıtları bitki gelişiminden, sadece hızlı değil, aynı zamanda etkin bir şekilde hücre içi düzeyde bu dinamik sinyal olaylarını tespit etmek ve izlemek edemez uygun araçlardan bir eksikliği vardır.
Tütün yaprağı epidermis geçici protein sentezleme sistemi canlı hücrelerin floresan proteinleri görselleştirmek için avantajlar cazip gelmiştir. Bu sistem post-translasyonel protein modifikasyonu ve protein lokalizasyonu hızlı incelenmesine olanak....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Plazmid Yapı
- Daha önce 1,6 açıklandığı gibi teknoloji klonlama yoluyla yapıları oluşturmak.
- İlk BASL kodlama dizilerini amplifiye etmek için uygun olan primerler ile yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanarak, YDA ve MPK6 ve giriş vektörleri içine alt klonlanması. 7'de ayrıntılı protokol bulun.
- (Sırasıyla DNmpk6 8 ve DNyda 4) MPK6 ve YDA baskın negatif sürümlerini oluşturmak için şablon olarak MPK6 ve YDA giriş plazmidleri kullanmak ve bölgeye yönelik mutajenez yöntemi 9 ile nokta mutasyonlar.
- PH35CG 10 içine BASL entegre standart LR (attL x....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
hiperaktif MAPK sinyallemesinin başlatılan hücre ölümünü engellemek için, YDA (DNyda) ve MPK6 (DNmpk6) kinaz aktif olmayan ve tütün hücrelerine eş-sentezleme tahlilinde kullanılmıştır. Ne BiFC de CFP-BASL kendisinde oluşturulan düzensiz dağılım deseni (Şekil 3A-B) ortaya DNyda ve DNmpk6 arasındaki etkileşim. CFP-BASL DNyda-DNmpk6 etkileşim çifti girmiştir Ancak, OBP ve YFP sinyalleri hem son derece kutuplaşmış bir şekilde (Şekil 3C) yeniden dağıtılır bul.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Genel Kullanım ve sinyal iletimi için Tütün geçiş sentezleme sisteminin olası değişiklikler: floresan proteinin aşırı ekspresyonunu (FP) başarılı bir şekilde, bitki hücrelerinde protein hücre içi lokalizasyonu hızlı inceleme için kullanılmıştır Tütün epidermis proteinleri etiketli. Bununla birlikte, in planta protein kompleksi dinamik sinyal dağılımını incelemek komplike hücre içi ortamlarda, geçici protein-protein etkileşimi ve sinyal transdüksiyon etkinlikleri için zor bir konudur. Bu zorluğu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
El yazması düzenlemesi için Yumeng (Helen) Xia'ya (Rutgers Üniversitesi) teşekkür ederiz. BASL polarite oluşumu üzerine yapılan çalışmalar, ABD Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden J.D. (R01GM109080) ve Rutgers Üniversitesi'ne verilen hibelerle desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Phusion DNA polimeraz | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Yaşam Teknolojileri | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Sahaya Yönelik Mutajenez Kiti | Agilent Technology | 200521 | |
| LB suyu | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamisin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampisin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamisin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spektinomisin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slayt | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Kapak camı | VWR | 48393-241 | |
| Lazer taramalı konfokal mikroskop | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite yazılımı |
| 40X objektif lensi | Leica | HCX APO Planı | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Santrifüj | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Delgeç | Zımba | ||
| 50 ml şahin tüpleri | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forseps | Canemco & Marivac | 205EQA-Teknik Özellikler |
Kaynaklar
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (200....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
