Analiz İn Vivo Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Özet

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Özet

Hücre göçü, kanser metastazı da dahil olmak üzere birçok fizyolojik ve patolojik durumun anahtarıdır. Hücre göçünün hücresel ve moleküler bazları in vitro olarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Bununla birlikte, in vivo hücre göçü bir şekilde in vitro göçten farklıdır ve analiz edilmesinin daha zor olduğu, doğrudan gözlem ve manipülasyon için daha az erişilebilir olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, aday genlerin hücre göçündeki işlevini incelemek için bir model sistem olarak erken zebra balığı embriyosunda prospektif prekordal plakanın göçünü kullanır. Prekordal plaka progenitörleri, gastrulasyon sırasında embriyonik organizatörden embriyonun hayvan kutbuna yönlendirilmiş bir göç geçiren bir hücre grubu oluşturur. Önerilen protokol, mozaik embriyolar oluşturmak için hücre naklini kullanır. Bu, iyi görüntülemenin anahtarı olan izole hücrelerin etiketlenmesinin ve gözlemlenen hücrelere fonksiyon kazancı / kaybı etkilerinin sınırlandırılmasının ve dolayısıyla hücre özerk etkilerinin sağlanmasının birleşik avantajlarını sunar. Burada, hücre göçünde TORC2 bileşeni Sin1'in işlevini nasıl değerlendirdiğimizi açıklıyoruz, ancak protokol, in vivo hücre göçünü kontrol etmede herhangi bir aday genin işlevini analiz etmek için kullanılabilir.

Giriş

Çok hücreli organizmalarda, hücre göçü bu doku ve organların içine hücreleri organizasyonunu sağlayan embriyonun gelişimi için ve doku homeostazında (yara iyileşmesi) ve bağışıklık yer alır erişkin yaşamda, hem esastır. Bu fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, hücre göçü, kanser metastazı, dahil olmak üzere, özellikle de çeşitli patolojik durumlarda, katılır.

Hücre göçü düz yüzeylere hücre hareketlerini sağlayan moleküler mekanizmaların genel bir anlayış sağlayarak, yıllardır in vitro analiz edilmiştir. Vivo Bununla birlikte, hücreler daha karmaşık bir çevre tarafından karşı karşıya kalırlar. Açık bir şekilde taşıma kılavuz hücreleri ya da salgılanan kemokinler, komşu gibi hücre dışı matris olarak bir organizma içindeki geçiş dış işaretlere etkilenebilir geçmiş yıllarda ortaya çıkan ve bu tarif edilmiştir ne değişebilir hücre göçü tahrik mekanizmaları in vitro ^1,2. Vivo hücre göçü temin eden mekanizmaların in vitro çalışmalar ile karşılaştırıldığında, esas olarak, çünkü artan teknik zorluk, şimdiye kadar daha az ilgi görmüştür. In vivo özellikle hücre göçü analizi göç hücrelere doğrudan optik erişim gerektiren, benzersiz hücreleri etiketlemek için teknikler kendi dinamiklerini ve morfolojisi yanı sıra kazanç veya fonksiyon kaybını görmek için aday genlerin rolü test etmek için yaklaşımlar. Şimdiye kadar, bu özellikleri barındıran bir kaç model sistemler vivo hücre göçü ³ incelemek için kullanılmıştır.

Biz son zamanlarda vivo hücre göçü ^4,5 yılında kontrolünde aday genlerin fonksiyonunu değerlendirmek için yeni bir uygun model sistem olarak erken Zebra balığı embriyolarının prospektif prechordal plaka göç kullanılır. (Aynı zamanda, ön mesendoderm olarak da bilinir) Aday prechordal plakası Gast başlangıcında oluşturan hücrelerin bir grup olduğuEmbriyonun sırt tarafında rulation. Gastrulasyon sırasında bu grup topluca Notokordun için prechordal plaka, bir mesendodermal kalınlaşma, anterior oluşturur ve nöral plakayı altta yatan, embriyo ^6-8 hayvan kutup doğru göç eder. Posterior kısmı muhtemelen mezoderm ⁹ kafa katkıda iken prechordal plaka ön kısmı, kuluçka bezinin yol açacaktır. dış gelişme ve balık embriyo optik berraklık sayesinde, hücre göçü, doğrudan ve kolay bir yapı görülür.

Hücre nakli mozaik embriyoların ¹⁰ hızlı ve kolay yaratılması için izin veren çok güçlü bir tekniktir. İzole hücrelerin etiketleme nakledilen hücrelerin sonuçlarında floresan sitoskeletal belirteçleri ifade, morfolojisi ve dinamikleri olan kolaylıkla görülebilir. kayıp veya fonksiyon kazancı bu birleştiren izinlerin bir kutu hücre özerk fonksiyonların analizi yaklaşımlarıdidate geni.

Sunulan protokol in vivo ⁵ hücre göçü ve aktin dinamiklerini kontrol TORC2 bileşeni sin1 işlevini değerlendirildi açıklamaktadır. Sonuçlar belirtilen ve daha fazla ele alındığı gibi Ancak, in vivo olarak, hücre göçü kontrol herhangi bir aday genin potansiyel implikasyonları analiz etmek için kullanılabilir.

Protokol

Not: Şekil 1 protokolünün anahat sunar.

Enjeksiyon ve Transplantasyon için iğneler hazırlanması 1.

Not: İğneler her zaman hazırlanmış ve saklanabilir. modelleme kil bandında, bir Petri kabındaki tutun. tozdan korumak için parafilm çanak mühür.

1. Enjeksiyon iğneleri, bir mikropipet çektirmesi ile (Malzeme listesine bakınız) (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.58 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin. bunlar koryon delmek için daha etkin olarak kısa ve ince iğneler (yaklaşık 5 mm'lik konik bölümü tercih).
   Not: Enjeksiyon iğneleri tek kullanımlık vardır.
2. Hücre Nakli iğne
   1. Mikropipet çektirmenin ile (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.78 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin.
   2. Uiç çapı (hücre çapından biraz daha transplante edilecek) 35 um olduğu noktada iğne ucu kesilmiş bir microforge (malzemelerin listesine bakınız) şarkı.
   3. Konik 45 ° 'lik açı ile bir microgrinder (Malzeme listesine bakınız) ile kılcal kesim ekstremite.
   4. İsteğe bağlı olarak, microforge kullanılarak iğnenin ucundaki dikenlere çekin. Bunun için, konik ucu ile sıcak tel dokunun ve hızla embriyo nüfuz yardımcı olabilecek bir çengel oluşturarak, uzak çekin.
   5. eden bir şınngaya bağlanmış bir iğne tutucu iğne monte edin. şırınga kullanarak, bir cam artıkları ortadan kaldırmak ve daha sonra aseton ile üç kez durulama% 2 hidroflorik asit ile iğne üç kez iç yıkayın.
      Dikkat: hidroflorik asit toksik, eldiven ile, kaputun altında manipüle.
      Not: hücre nakli iğneler birkaç kez kullanılabilir.

2. HazırlıkEnjeksiyon ve Hücre Nakli Yemekleri

1. Isı tam güçte 1 dakika boyunca bir mikrodalga agaroz 0.5 g ihtiva eden ¹¹ orta embriyonun 50 mi embriyo ortamda% 1 agaroz alır. yaklaşık 60 ° C'ye kadar agaroz jeli soğutun ve bir 90 mm Petri kabı 50 ml dökün. özel olarak tasarlanmış kalıp (malzeme listesine bakınız) ya enjeksiyon çanak hatları ile ya da hücre nakli yemeğin kuyuların ile jel yüzeyinde yerleştirin.
   1. Agaroz çok sıcak değilse, agaroz kalıp şamandıra gözlemleyin. Agaroz jel ayarlandıktan sonra, forseps ile kalıp (- B Şekil 2A) çıkarın.
      Not: yemekler birkaç haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. kurumayı önlemek için, kapalı ıslak kutuda saklayın.
2. Kullanmadan önce bir 28 ° C inkübatör 30 dakika çanak yerleştirin.

Embriyoların ve Enjeksiyon 3. Koleksiyonu

1. Enjeksiyon solüsyonu hazırlanması
   Not: Aktin bağlama alanımCherry bağlı gibi LifeAct olarak protein 140 (ABP-140) bağlanma maya aktin çıkıntılı etkinliğini analiz etmek için, hücre içinde polimerize aktin görselleştirmek için kullanılır (ABP140 mCherry olarak da adlandırılır). Aday gen (baskın negatif ya da yapısal olarak aktif bir yapı örneğin mRNA veya morfolino oligonükleotitler) fonksiyonunu test etmek için başka bir bileşik ekleyin. (Şekil 3), biz Morfolino oligonükleotidleri kullanılan sonuç tarif edildiği gibi sin1 fonksiyonlarını değerlendirmek. Bir kontrol olarak, sin1 morfolino ama bu kontrol morfolino hedef RNA'yı eşleşmediğini şekilde dizisi boyunca dağıtılmış 5 nükleotidler denk bir morfolino kullanılır.
   1. Çözülme sin1 ve 5-uyumsuzluğu kontrol morpholinos (2 mM stok çözeltileri) ve buz üzerinde ABP140 mCherry mRNA'lar. MRNA 375 ng (75 ng / nihai uL) ve sin1 ya da 5-uyumsuzluğu kontrol morfolino ya da 0.75 ul (0.3 mM nihai) Danieau tampon maddesi (58 mM NaCI, 0.7 mM eklemeKCI, 0.4 mm _{(3) 2,} 5.0 mM HEPES, pH 7.6), 5 ul toplam hacme ulaşmak için, 0.6 mM Ca ₄ MgSO.
2. embriyo Koleksiyon
   Not: Bu deneysel kurmak için hem donör ve host embriyolar transgenik olan müstakbel prechordal plaka ¹¹ görselleştirmek için goosecoid (GSC) kontrolü destekleyicisi altında GFP ifade.
   1. (: GFP gsc) yumurta Tg toplayın. embriyo orta ile dolu bir 90 mm Petri kabı, yaklaşık 80 yumurta yerleştirin ve 28 ° C'de inkübe edin.
3. Donör Embriyolar enjekte
   1. Bir stereomikroskop altında, yavaşça embriyo orta ile dolu bir enjeksiyon çanak satırlara forseps ile toplanan embriyolar sıkın. forseps kullanarak, üste doğru hücrelerle embriyolar yönlendirmek. Embriyolar 4-hücreli sahne (1 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C'de inkübatör enjeksiyon çanak yerleştirin.
   2. 2 ul bir enjeksiyon iğnesi yükEnjeksiyon çözeltisi. Bir hava Transjektör için (malzeme listesine bakınız), bir mikro-manipülatör yerleştirilir ve politetrafloroetilen (PTFE) tüp (Malzeme listesine bakınız) ile bağlı bir iğne tutucu (malzeme listesine bakınız) içinde iğneyi (malzeme listesini görmek ).
   3. yavaşça ince forseps ile ucu dokunarak kılcal açın. Gerekirse, kendi ekstremite kısma açık kılcal kesti.
   4. iğne ile dört hücrelerden birini girin ve hücre hacmi (2 nl)% 70 doldurmak için hücre içinde çözüm enjekte. 30 embriyolar enjekte edilir.
      Not: Plazma zarı yumuşak olduğu hücrede iğne alma, zor olabilir. hücre ve yumurta sarısı arasında kavşakta hedefleyen iğne penetrasyonu kolaylaştırır.
   5. onlar küre sahne (4 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C inkübatör embriyolar yerleştirin.

Hücre transplant için Embriyolar 4. hazırlanmasıiyon

1. 200 ul penisilin / streptomisin (malzeme listesine bakınız) (Pen / Strep EM) ile embriyonun orta 20 ml hazırlayın.
2. küre aşamasında embriyo dechorionation (4 saat sonra döllenme)
   Not: Dechorionated embriyolar çok kırılgan ve hava veya plastik ile temas halinde patlayacak. Dolayısıyla agaroz kaplı tabaklara yerleştirilir ve yangın cilalı cam Pasteur pipetler ile transfer edilmesi gerekir.
   1. Bir plastik Pasteur pipeti kullanarak, embriyo ortamda% 1 agaroz ile kaplı ve Pen / Strep EM ile dolu iki adet 35 mm Petri kapları içine adım 3.3 enjekte adım 3.2 toplanan konak embriyolar ve donör embriyolar transfer. iki ayrı yemekler ev sahibi embriyolar ve donör embriyolar tutun.
   2. Elle ince cımbız (malzeme listesine bakınız) ile chorions embriyolar ayıklayın.
   3. onlar kalkan sahne (6 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C inkübatör embriyolar yerleştirin.

5. Hücre Nakli

1. Hücre Nakli Embriyolar düzenleyin.
   1. Bir floresan stereomikroskop altında seçin donör embriyolar kalkan (yeşil) içinde ABP140-mCherry (kırmızı) ifade.
   2. Bir yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak, Pen / Strep EM ile dolu hücre nakli plakasının gözenekleri içinde embriyo aktarımı. Komşu satırda bir satırda konak embriyolar ve donör embriyolar yerleştirin.
   3. bir kirpik kullanarak, dikkatle kalkan up ile embriyolar yönlendirmek.
      Not: Kalkanın pozisyon GFP tarafından değerlendirilir ya da anatomik olabilir.
2. Transplantasyon Sistemi Kurulumu.
   Not: Transplantasyon sistemi mikro sürücü ile donatılmış bir Hamilton şırıngaya (malzeme listesine bakın) PTFE tüp (Malzeme listesine bakınız) ve bir tüp konnektörü (Malzeme listesine bakınız) ile bağlantılı bir iğne tutucu oluşur (listeye bakın Malzemelerin). iğne tutucu3-yollu mikromanipülatör üzerine monte edilir (Malzeme listesine bakınız).
   1. eden bir şınngaya bağlanmış bir iğne tutucu kullanılarak,% 70 etanol ile hücre transplantasyonu için iğne yıkayın. iğne içine havayı emerek kuru. Bu toz iğne konik kısmında sıkışmış neden olabileceğinden, esen kuru etmeyin.
   2. yukarı konik, Hamilton şırınga bağlı iğne tutucu iğne takın.
3. Kalkan-to-kalkan Hücre Transplantasyonu
   1. transplantasyon iğne ile donör embriyo kalkanını girin ve ABP140-mCherry etiketli yaklaşık 10-20 hücreleri hazırlamak. Dikkatle sarısı çizim kaçının.
   2. ev sahibi embriyo kalkanı içine hücreleri nakli. Tüm ev sahibi embriyolar nakledilen kadar tekrarlayın.
   3. Bir yangın cilalı Pasteur pipeti ile hasarlı embriyolar çıkarın. 28 ° C inkübatör nakledilen embriyoların yerleştirin ve onları yaklaşık 30 dakika süreyle geri verelim.
   4. Bir iğne kullanarakBir şırınga bağlı tutucu, su ile hücre nakli iğne durulayın ve modelleme kil bandında bir Petri kabındaki geri yerleştirin. parafilm çanak mühür.

6. (İSTEĞE BAĞLI) Tek Hücre Nakli

Not: nakli iğne tek bir hücre çizmek zor olacak şekilde embriyo, hücreler birbirine yapışır. Biz kolayca tek prechordal plaka progenitör hücreler nakli için modifiye edilmiş bir protokol geliştirmiştir. Fikir transplantasyon öncesinde hücreleri ayırmak etmektir. İzole prechordal plaka progenitör hücrelerin kimliklerini kaybetme eğilimindedir, çünkü biz genetik Sox32 transkripsiyon faktörü yokluğunda, Düğüm sinyalizasyon yolunun aktive ederek, ileriye dönük prechordal plaka kimlik bunları empoze. Biz bu uyarılmış hücreleri, endojen prechordal plaka progenitör hücrelerin ⁸ gibi davranır doğruladıktan. Aşağıda tek bir hücre nakli gerçekleştirmek için belirli adımlar vardır. hücre dissociation, kalsiyum içermeyen Ringer ¹¹ embriyolar yerleştirerek bir eksplant kesme ve mekanik olarak karıştırılarak elde edilir.

1. Adım 2.1 yerine Embriyo Orta Kalsiyum içermeyen Ringer% 1 agaroz ile nakli yemek hazırlamak.
2. Aşama 3.1 'de, ABP140 mCherry RNA ve sin1 morfolino ilave olarak, 2, 3 (nihai 0.6 ng / | il) Düğüm reseptör Taram-A aktif formunu kodlayan RNA'lar ng ve sox32 karşı morfolino 1.25 ul (stok çözeltisi ekleyin mM, dolayısıyla 0.5 mM nihai).
3. Aşama 4, transfer yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak Pen / Strep kalsiyumsuz Ringer dolu hücre transplantasyonu için çanak seçilen üç donör embriyolar sonra. ince cımbız ile enjekte hücreleri (ABP140 mCherry etiketli hücreler) içeren bir eksplant teşrih. Hızla embriyoların kalanını atın.
4. Hücreler ayırmak kadar bir kirpik ile hafifçe eksplant karıştırın.
5. transplantasyon iğne tek bir izole hücre çizinve bir ev sahibi embriyo kalkan içine nakli.
6. Bir yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak, Pen / Strep EM ile dolu bir agaroz kaplı tabak embriyolar aktarılır. 30 dakika boyunca 28 ° C'de inkübatör içinde embriyo yerleştirin.

Montaj 7. Embriyo

1. Görüntüleme Odası
   1. Yöntem 1: Bir tarafta 3 mm yüksekliğinde kenarlı 4 delikli (5.5 mm çap), (Şekil 2C - D) ile delinmiş bir plastik slayt (75 x 25 x 0.5 mm) oluşan bir görüntüleme haznesi. siyanoakrilat yapıştırıcı (süper yapıştırıcı) ile arka tarafta bir cam lamel, Tutkal.
      Not: Deney sonunda, lamel kaldırmak ve zımpara kağıdı ile tutkal artıkları kurtulmak için bir gece suda odasına yerleştirin.
   2. Yöntem 2: 10 mm delik olan 35 mm Mattek cam alt yemekleri (Malzeme listesine bakınız) kullanın.
2. embriyo Montaj
   1. embriyo ortamda sıcak% 0.2 agaroz 1 ml cam şişe doldurun.ısı blokunda 42 ° C'de tutun.
   2. Floresan stereomikroskop altında, kırmızı nakledilen hücrelerin yeşil etiketli prospektif prechordal plaka (yani kırmızı nakledilen hücrelerin yeşil prospektif prechordal plaka içindedir, ve hayvan kutup doğru göç başlamıştır) bir parçası olduğu bir embriyo seçin.
   3. Bir yangın cilalı Pastör pipeti ile agaroz çözeltisi içine seçilen bir embriyo transferi. pipetle embriyo orta fazlalığı atın. agaroz ile pipet embriyo çizmek ve agaroz bir damla yatırılması, görüntüleme odasında embriyo transferi. agaroz ayarlanır önce, bir kirpik ile embriyo yönlendirmek. dik bir mikroskop ile görüntüleme için yukarı muhtemel prechordal plaka yerleştirin veya bir ters mikroskop ile görüntüleme için cam alt. Agaroz odasının yanındaki kuyuda başka embriyo monte etmeden önce (oda sıcaklığına bağlı olarak yaklaşık 1 dakika) ayarlanır kadar bekleyin.
      Not: Bir görüntüleme chamber 4 kuyu içeren 4 embriyolar kadar montaj sağlar.
   4. agaroz ayarlandığında, kurumasını önlemek için Pen / Strep EM ile odasını doldurun.

8. Canlı Görüntüleme

1. 40X su daldırma uzun menzilli lensi kullanın. GFP görüntü GFP ve mCherry (uygun filtre setleri kullanın:; uyarma BP 470/40, ışın ayırıcı FT 510 ve emisyon BP 540/50 MCherry için: uyarma BP 578/21, ışın ayırıcı FT 596 ve emisyon LP 641 / 75). Görüntü dinamiklerini optimize etmek için poz süresini ayarlayın.
2. plaka tüm hücreler görüntü için (ektoderm) prospektif prechordal plaka üzerinde bir kaç mikron başlayan ve (sarısında) prospektif prechordal plaka altında birkaç mikron biten, z-yığınları kazanır. 2 um z-adım kullanın. satın alma hızını optimize etmek için, z-yığınlarının arasında yerine kare arasında renkleri geçiş.
   Bu yeşil ve kırmızı görüntüler arasında hafif farklılıklara yol açabilir, ancak kesin co beri bir sorun değil: Notyeşil ve kırmızı sinyaller arasındaki -localization gereklidir. Işık daha fazla görüntüleme süresi ve maruziyeti azaltmak için, yeşil yalnızca bir kez prechordal plaka progenitör hücreleri tanımlamak için yeterlidir her 5 kez puan elde edilebilir.
3. çıkıntı sıklığını ve yönünü analiz etmek gereklidir iki dakikalık bir zaman aralığı içinde 4 embriyolar, görüntü gibi ayarları kullanma. çıkıntı ömür boyu analizi için, yüksek zaman çözünürlüğü elde etmek için 30 saniye zaman aralığını azaltmak. % 80 epiboly% 60 epiboly görüntü.

9. Hücre Dinamiği Analizi

1. ImageJ 4D görüntüleri yüklemek
   Not: edinimi için kullanılan yazılıma bağlı olarak, görüntüler farklı biçimlerde saklanır (görüntü başına bir dosya, z-yığınının başına bir dosya, bütün deney için bir dosya). Bazı ImageJ Eklentiler 4D yığınları açmak için online olarak hazırdır. Bizim verilerimiz z-yığınının başına bir dosya olarak saklanır. Veri kümesi büyük olduğundan, bunun sadece bir kısmını (bazı tim açmak için uygun olabilire noktaları, ya da z-yığını veya 8-bit bir Subpart) ... görüntüleri dönüştürülür. Biz talep üzerine dağıtmak için mutlu olurdu ki, bunu yapmak için bir ısmarlama ImageJ eklenti kullanmak.
2. Yönlendirme ve analizi Hücre çıkıntıların sıklığı
   1. prospektif prechordal plaka göçün ana yönünü belirlemek için GFP görüntüleri kullanın. Hücre çıkıntılar açı ölçümleri için bir referans olarak alır. Bu referans yönü görüntünün bir tarafına paralel olacak şekilde, yığın döndürün.
   2. Bir hücre izleyin. Seç açı aracı. Her kare ve her çıkıntı için, çıkıntı ve referans yönü (Şekil 3A) arasındaki açıyı ölçmek için açı aracını kullanın. (Klavyede basın veya M) değeri saklamak için ölçün / Analiz komutunu kullanın. bir txt dosyası olarak sonuçları kaydedin. Bir sonraki hücreye ile tekrarlayın.
   3. histogramlar olarak R ve arsa açısı dağılımı veri almak. Farklı koşullar karşılaştırmak için Kolmogorov-Smirnov testi (R ks.test) kullanın.
      Not: açı aracı klasik istatistiksel testler ve dairesel değil testlerin kullanımına izin veren, 0 ° ve 180 ° arasını kapsayan değerler sağlar.
   4. Bu veri seti ile, dakikada hücre başına uzantı sayısı emisyon frekansı hesaplayabilir. Kullanım Student t-testi (R t.test) farklı koşullar karşılaştırmak için.
3. Hücre Çıkıntılar ömür boyu analizi
   1. Her hücre ve her çıkıntı, ölçü çıkıntı süresi (çıkıntı kareler arasında mevcut x zaman aralığıdır sırasında kare sayısı) için.
   2. Farklı koşullar karşılaştırmak için R. Kullanım Student T-testi (R t.test) veri almak.
      Not: Diğer göç özellikleri hücre göçü karakterize etmek amacıyla analiz ilginç olabilir. Bu hız, yön ve sebat ölçümleri veya hücre morfolojisi, hücre parçaları içerir. Bazı ticari yazılım uygulamaları bu özellikleri ölçmek için kullanılabilir, ancak açık kaynak yazılım başvurunun çok sayıdaÖrneğin morphodynamics ¹² analiz etmek ADAPT olarak katyonlar ve ImageJ eklentileri de mevcuttur, diper göç ¹⁴ sırasında hücre sınırlarını izlemek için hücre yörüngeleri ve yön kalıcılık ^13, CellTrack bakmak için.

Sonuçlar

Sunulan teknik vivo hücre göçü kontrol, sin1, Tor karmaşık 2 (TORC2) çekirdek bileşenlerinden biri rolünü analiz etmek için kullanıldı. hücre nakli kullanımı izole hücreler ve hücre özerk etkilerinin analizi etiketleme izin verir. Film S1 nakledilen prechordal plaka progenitör hücrelerin göçünü gösteriyor. ABP140 ile Aktin etiketleme aktin zengin sitoplazmik uzantıların kolay görüntüleme sağlar. Biz onların sıklığını ve yönünü ölçülür. Yabani tip hücrelerin göç yönüne <...

Tartışma

Bu protokol, in vivo olarak, canlı görüntüleme hücre transplantasyonu ile kimerik embriyo oluşturulmasını birleştirerek hücre göçü bir aday genin rolünü araştırmak için kolay bir yol sunar.

mozaik embriyoların Yaratılış

Bir hücrenin dinamiklerini incelenmesi sitoplazmik uzantıları analiz etmek onun konturu görselleştirme gerektirir. böylece iyi bir görsel kontrast sunan, çevre - ya da farklı etiketli - Bu bir başka etiketsiz izole hücrelerin etiketlenmes...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cam kılcal damarlar (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.58  mm)	Harvard	Aparatı 300085	standart kalınlıkta
Cam kılcal damarlar (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.78 mm)	Harvard Aparatı	300085	ince duvarlı
Penisilin-Streptomisin	Sigma-Aldrich	P4333	10  000  birimler penisilin ve 10  ml ince cımbız başına mg streptomisin
	Dumont Güzel Bilim Araçları	11254-20	5F
cam alt tabaklar	MatTek	P35G-0-10-C
Hava transjektörü	Eppendorf	5246
Mikro dövme	Narishige	MF-900
Mikro öğütücü	Narishige	EG-44
Mikromanipülatör (enjeksiyon için)	Narishige	MN-151
Mikromanipülatör (hücre nakli için)	Leica	Leica Mikromanipülatör
Hammilton Şırınga	Narishige	IM-9B
Mikropipet çektirme	David Kopf Instruments	Model 720
Transplantasyon kalıbı	Adapative Bilim Araçları	PT-1
İğne tutucu	Narishige	HI-7
Tüp konektörü	Narishige	CI-1
PTFE boru	Narishige	CT-1