Yöntem makalesi

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği Xenopus Böbrek

DOI:

10.3791/53799

⸱

3 Mayıs 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Pediatric Research Center, University of Texas McGovern Medical School, 2Program in Genes & Development, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 3Program in Cell & Regulatory Biology, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Genetics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Xenopus laevis embriyolarının böbreğine yol açan bireysel blastomerlere enjeksiyonları hedeflemek için kader haritalarını ve soy izleyicilerini kullanmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis (kurbağa), pronephros, embriyonik böbrek tek nefron oluşur ve böbrek hastalığı için bir model olarak kullanılabilir. Xenopus embriyolar dışarıdan geliştirmek, büyük ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi işlemler tarafından manipüle edilebilir. Buna ek olarak, kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulmuştur. sonuçta bir organa veya ilgili dokuya sebebiyet verecek bağımsız blastomere hedefli mikroenjeksiyon seçici gelişen embriyonun geri kalan ikincil etkilerin azaltılması, aşın ya da, bu sınırlı bölge içinde gen ekspresyonunu yıkmak kullanılabilir. Bu protokol, biz 4 ve 8 hücreli embriyolar belirli blastomer içine mikroenjeksiyon yoluyla gelişen Xenopus böbrek (pronephros), hedef kurulan Xenopus kader haritaları nasıl kullanılacağını açıklar. soy izleyicilerin enjeksiyon enjeksiyon spesifik hedefleme doğrulamasına imkan sağlar.Embriyolar 38 evresine kadar gelişti sonra - 40 tüm montaj immün Pronephric gelişimi görselleştirmek için kullanılır ve pronephros hedeflenen hücrelerin katılım değerlendirilebilir. Aynı teknik pronephros ilave olarak diğer doku tiplerini hedef uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimini ve hastalığın incelemek için iyi bir modeldir. Embriyolar, harici olarak geliştirilmesi büyük boyutta, çok sayıda üretilebilir ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi prosedürler ile işlenir. Buna ek olarak, memeliler ve amfibiler böbrek gelişimini yöneten genler korunur. Embriyonik amfibiler bir pronephros var ve yetişkin amfibi bir metanephros varken, pronephros, mesonephros ve metanephros 1: Memeli böbrekler üç aşamadan yoluyla ilerleme. Bu, böbrek formlarının temel filtreleme birimi nefron ve memeli ve amfibi hem nefrogenezisi 2, 3 geçmesi, aynı sinyal iletim ve endüktif olayl....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(: HSC-AWC-13-135 protokol #) Aşağıdaki protokol Kurumsal Bakım ve Kullanım Kurulu olarak hizmet vermektedir Laboratuar Hayvan Hastalıkları Hayvan Refahı Komitesi için Houston'ın Merkezi'nde Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Böbrek hedefli Enjeksiyonlar için blastomer 1. Kimlik ve Seçimi

  1. Embriyoların oluşturmadan önce, embriyo erken hücre bölünmeleri yönünü anlamak için Xenopus Kalkınma 21 Normal Tablo kullanın. Alternatif olarak, Xenbase 11 Xenopus erken gelişim aşamaları erişim şemaları.
  2. Mikroenjeksiyon için hedeflenen hangi blastomere seçmek için Xenbas....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MEM-RFP mRNA ile 4 ve 8 hücreli Xenopus embriyoların Microinjections pronephros hedefleme farklı düzeylerde göstermektedir. 4 gösterileri sahne doğru MEM-RFP mRNA ekspresyonu ile 40 embriyolar Şekil. Embriyolar, sol ventral blastomere (Şekil 4A) enjekte ve MEM-RFP mRNA uygun ekspresyon modeli için kriteri edildi. Ara uzak proksimal, MEM-RFP'yi tanımlayan ve böbrek tübülleri bağlanmanın yanı sıra, uygun bir şekilde enjekte edilen.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus embriyoların geliştirilmesi pronephros Hedefleme belirlenmesi ve doğru blastomer enjekte dayanır. 8 hücreli embriyo V2 blastomer enjeksiyon sol pronephros 18 hedefliyor. Bu bir iç kontrol olarak kontralateral sağ pronephros bırakır. morfolino demonte veya RNA aşırı böbrek gelişimi değiştirmek için kullanıldığı takdirde, kontralateral sağ pronephros sol pronephros gen demonte veya aşırı ekspresyonuna etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu durumda, böyle bir uyumsuz kontrol morfolino.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Texas McGovern Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatri Bölümü'nden Sağlık NIDDK hibe (K01DK092320) ve başlangıç ​​fon Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sodyum klorürFisherS271-3
Potasyum klorürFisherP217-500
Magnezyum sülfat ve nbsp;FisherM63-500
Kalsiyum klorürFisherC79-500
HEPESFisherBP310-500
EDTAFisherS311-500
Gentamisin çözeltisi, 50 mg / mlAmrescoE737-20ML
L-Sistein,% 99 +Acros Organics52-90-4
FicollFisherBP525-100
100 mm x 15 mm Petri kabıFisherFB0875712
Mini Buzdolabı IIBoekel260009Embriyolar için tezgah üstü inkübatör.
Gap43-RFP plazmidiİzleyici RNA yapmak için. Referans: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dekstran, 10.000 MWInvitrogenD1817İzleyici.
Moleküler biyoloji sınıfı, USP steril arıtılmış suCorning46-000-CI
7 "Drummond yedek tüplerDrummond3-000-203-G / XLMikroenjeksiyon iğneleri.
İğne çektirmeSutter InstrumentsP-30
İnce forsepsDumont11252-30Mikroenjeksiyon iğne ucunu kırmak için.
Nanoject IIDrummond3-000-204Mikroenjektör.
Mineral yağ, ağırFisherCAS 8042-47-5İğneler için yağ.
27 G Monoject hipodermik iğneCovidien8881200508Mineral yağı mikroenjeksiyon iğnesine yüklemek için kullanılır.
5 ml Luer-Lok şırıngaBD309646Mineral yağı mikroenjeksiyon iğnesine yüklemek için kullanılır.
60 mm x 15 mm Petri kabıFisherFB0875713A
800 mikron Polyester ağKüçük ParçalarCMY-0800-C
Transfer pipetleriFisher13-711-7MEmbriyoların transferi için. Embriyoların pipet tarafından kolayca alınması için ucu kesin.
6 oyuklu hücre kültürü plakasıNest Biotechnology
MOPSFisherBP308-500
EGTAAcros Organics67-42-5
FormaldehitFisherBP531-500
15 mm x 45 mm Vidalı şişeFisher03-339-25BEmbriyoları sabitlemek, boyamak ve saklamak için.
24 oyuklu hücre Kültür plakasıNest Biyoteknoloji
BenzokainSpektrumuBE130
EtanolFisherBP2818-4
MetanolFisherA412-4
Fosfat tamponlu salin (PBS) 1x tozFisherBP661-50
Sığır serum albüminiFisherBP1600-100
Triton X-100FisherBP151-500
3D Mini rocker, model 135Denville Scientific57281
Keçi serumu, Yeni Zelanda menşeliInvitrogen16210064
Sodyum azidFisherS227I-25
Monoklonal 3G8 antikoruAvrupa Xenopus Kaynak MerkeziProksimal etiketlemek için birincil antikor Kamışı.
Monoklonal 4A6 antikoruAvrupa Xenopus Kaynak MerkeziAra, distal ve bağlantı tübüllerini etiketlemek için birincil antikor.
anti-RFP pAb, saflaştırılmış IgG / tavşanMBLPM005Gap43-RFP izleyiciyi etiketlemek için birincil antikor.
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgGLife TechnologiesA11001Böbrek tübüllerini etiketlemek için ikincil antikor.
Alexa Fluor 555 keçi anti-tavşan IgGLife TechnologiesA21428Gap43-RFP izleyiciyi etiketlemek için ikincil antikor.
9 Boşluklu nokta plakasıCorning7220-85
Benzil benzoatFisher105862500İsteğe bağlı - embriyoları temizlemek için
Benzil alkolFisherA396-500İsteğe bağlı - embriyoları temizlemek için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
  2. Brandli, A. W.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Xenopus EmbriyosuMikroenjeksiyon Tekni iPronefros Geli imiBlastomer HedeflemeKader Haritas Kullan mB t n Ba lama mm nboyamaKonfokal MikroskopiMembrana Ba l K rm z Floresan ProteinEmbriyo EvrelemeDokuya zg Enjeksiyon

İlgili makaleler