Burada, Xenopus laevis embriyolarının böbreğine yol açan bireysel blastomerlere enjeksiyonları hedeflemek için kader haritalarını ve soy izleyicilerini kullanmak için bir protokol sunuyoruz.
Yöntem makalesi
Burada, Xenopus laevis embriyolarının böbreğine yol açan bireysel blastomerlere enjeksiyonları hedeflemek için kader haritalarını ve soy izleyicilerini kullanmak için bir protokol sunuyoruz.
Xenopus laevis (kurbağa), pronephros, embriyonik böbrek tek nefron oluşur ve böbrek hastalığı için bir model olarak kullanılabilir. Xenopus embriyolar dışarıdan geliştirmek, büyük ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi işlemler tarafından manipüle edilebilir. Buna ek olarak, kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulmuştur. sonuçta bir organa veya ilgili dokuya sebebiyet verecek bağımsız blastomere hedefli mikroenjeksiyon seçici gelişen embriyonun geri kalan ikincil etkilerin azaltılması, aşın ya da, bu sınırlı bölge içinde gen ekspresyonunu yıkmak kullanılabilir. Bu protokol, biz 4 ve 8 hücreli embriyolar belirli blastomer içine mikroenjeksiyon yoluyla gelişen Xenopus böbrek (pronephros), hedef kurulan Xenopus kader haritaları nasıl kullanılacağını açıklar. soy izleyicilerin enjeksiyon enjeksiyon spesifik hedefleme doğrulamasına imkan sağlar.Embriyolar 38 evresine kadar gelişti sonra - 40 tüm montaj immün Pronephric gelişimi görselleştirmek için kullanılır ve pronephros hedeflenen hücrelerin katılım değerlendirilebilir. Aynı teknik pronephros ilave olarak diğer doku tiplerini hedef uyarlanabilir.
Xenopus embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimini ve hastalığın incelemek için iyi bir modeldir. Embriyolar, harici olarak geliştirilmesi büyük boyutta, çok sayıda üretilebilir ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi prosedürler ile işlenir. Buna ek olarak, memeliler ve amfibiler böbrek gelişimini yöneten genler korunur. Embriyonik amfibiler bir pronephros var ve yetişkin amfibi bir metanephros varken, pronephros, mesonephros ve metanephros 1: Memeli böbrekler üç aşamadan yoluyla ilerleme. Bu, böbrek formlarının temel filtreleme birimi nefron ve memeli ve amfibi hem nefrogenezisi 2, 3 geçmesi, aynı sinyal iletim ve endüktif olaylar. Xenopus pronephros proksimal, orta ve distal tübülleri bağlayan oluşan tek nefron içerir, ve (memeli glomerulus benzer) glomus 1, 4-6 (Şekil 1 ). Xenopus pronephros tek büyük nefron, bu böbrek gelişim ve hastalık süreçlerinde rol oynayan genlerin incelenmesi için basit bir model olarak uygun hale getirir.
Hücre kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulan ve serbestçe Xenbase 7-11 online olarak mevcuttur edilmiştir. Aynı teknik, kalp ya da gözler gibi diğer hedef dokulara adapte edilebilir, ancak burada, gelişmekte Xenopus pronephros hedef soyu izleyicilerin mikroenjeksiyon için bir teknik açıklanmaktadır. Köken izleyiciler erken blastomere enjekte edilebilir, geliştirme sırasında bu hücre soyu görselleştirme sağlayan (vital boyaların, floresan etiketli dekstranlar, histokimyasal tespit enzimler, ve mRNA floresan proteinleri kodlayan dahil) etiketlerdir. Bu protokol MEM-RFP mRNA kodlama membran soy izleyici olarak, kırmızı floresan proteini 12 hedef kullanır. Hedeflenen Mikroenjeksiyon teknolojiBurada tarif edilen 4- ve 8 hücreli embriyolar bireysel blastomerlerin için bir dizi yöntem vasıtasıyla ilgili bir geni fazla-sentezlemek üzere gen ekspresyonunu veya eksojen RNA ile yıkmak morpholinos enjeksiyon için kullanılabilir. ventral, bitkisel blastomer içine enjekte edilerek, öncelikle embriyo pronephros gelişimsel bir kontrol olarak kontralateral pronephros bırakarak, hedeflenecektir. Bir izleyicinin ko-enjeksiyon doğru blastomere enjekte edildi doğrular ve embriyoda dokular gösterir pronephros hedeflenmesi doğrulayarak, enjekte blastomer ortaya çıktı. pronephros immün Pronephric tübüller hedef alınmıştır ne kadar iyi görselleştirme sağlar. Overekspresyonu ve demonte etkiler daha sonra bir gelişimsel kontrol olarak hizmet veren embriyo, kontralateral tarafa karşı gol olabilir ve Pronephric indeksi 13 hesaplamak için kullanılabilir. hücre kaderinin haritaların temini bu hedefli mikroenjeksiyon tekniği oth hedef dokulara kullanılmasına olanaker pronephros ve, bir floresanlı işaretleyici birlikte enjeksiyon dışında her bir dokuya hedeflenmiş mikroenjeksiyon analiz öncesi doğrulanmasına izin verir.
Embriyo mikroenjeksiyon sırasında, gelişimsel sıcaklık, sıkı regüle Xenopus gelişme oranı o 14 oranda bağımlı olduğu verilmelidir. Geliştirme süresi yavaşlatılır için 4 ve 8-hücresi enjeksiyonu - (16 ° C 14) Embriyolar daha soğuk sıcaklıklarda inkübe edilmelidir. 22 ° C, evre 1 (1 hücreden) kalkınma anda 16 ° C geliştirme anda 3 yaklaşık 4 saattir sahneye iken 3 (4 hücreleri) yaklaşık 2 saattir sahneledi. Bu 22 ° C'de 8 hücreli (evre 4) embriyo için bir 4-hücreli embriyo gitmek için yaklaşık 15 dakika sürer, ancak 16 ° C'de yaklaşık 30 dakika sürer. Benzer bir şekilde, 22 ° C 'de, sadece bir 16 hücreli embriyo (Aşama 5) ilerleme için bir 8-hücreli embriyonun 30 dakika sürer. Bu kez 16 ° C'de 45 dakika için artırılır.refore, embriyolar, 16 hücre aşamasına kadar ilerleme önce, 8-hücre aşamasında enjeksiyon için yeterli zaman sağlamak için embriyo gelişimi hızını yavaşlatmak için yararlıdır. Buna ek olarak, büyüme sıcaklığı hız veya böbrek tam gelişmiş kadar embriyo gelişimini yavaşlatmak için modüle edilebilir.
Iribaş aşamalı Xenopus embriyoların epidermis dokusu 15 diseksiyon veya takas olmadan gelişen pronephros kolay görüntüleme için izin nispeten şeffaftır. Nedeniyle Xenopus embriyoların göreli şeffaflık, canlı hücre görüntüleme de 16,17 mümkündür. Sonra Xenopus embriyolar 18-20 gen ifadesinin manipülasyonu hedeflenen Pronephric gelişmenin değerlendirilmesinde izin 40 embriyolar - pronephros görselleştirmek için immün, orta distal proksimal ve sahnenin bağlantı tübül 38 etiket kurulan antikorlarla mümkündür tüm montaj.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
(: HSC-AWC-13-135 protokol #) Aşağıdaki protokol Kurumsal Bakım ve Kullanım Kurulu olarak hizmet vermektedir Laboratuar Hayvan Hastalıkları Hayvan Refahı Komitesi için Houston'ın Merkezi'nde Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Böbrek hedefli Enjeksiyonlar için blastomer 1. Kimlik ve Seçimi
Embriyolar 2. Hazırlık
Enjeksiyon Çözümleri ve Embryoların Mikroenjeksiyon 3. hazırlanması
4. Sabitleme ve Embriyolar immün
Embriyolar ve Hedeflenen Pronephric Doku Analizi 5. Görselleştirme
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
MEM-RFP mRNA ile 4 ve 8 hücreli Xenopus embriyoların Microinjections pronephros hedefleme farklı düzeylerde göstermektedir. 4 gösterileri sahne doğru MEM-RFP mRNA ekspresyonu ile 40 embriyolar Şekil. Embriyolar, sol ventral blastomere (Şekil 4A) enjekte ve MEM-RFP mRNA uygun ekspresyon modeli için kriteri edildi. Ara uzak proksimal, MEM-RFP'yi tanımlayan ve böbrek tübülleri bağlanmanın yanı sıra, uygun bir şekilde enjekte edilen...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Xenopus embriyoların geliştirilmesi pronephros Hedefleme belirlenmesi ve doğru blastomer enjekte dayanır. 8 hücreli embriyo V2 blastomer enjeksiyon sol pronephros 18 hedefliyor. Bu bir iç kontrol olarak kontralateral sağ pronephros bırakır. morfolino demonte veya RNA aşırı böbrek gelişimi değiştirmek için kullanıldığı takdirde, kontralateral sağ pronephros sol pronephros gen demonte veya aşırı ekspresyonuna etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu durumda, böyle bir uyumsuz kontrol morfolino...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Bu çalışma Texas McGovern Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatri Bölümü'nden Sağlık NIDDK hibe (K01DK092320) ve başlangıç fon Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sodyum klorür | Fisher | S271-3 | |
| Potasyum klorür | Fisher | P217-500 | |
| Magnezyum sülfat ve nbsp; | Fisher | M63-500 | |
| Kalsiyum klorür | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamisin çözeltisi, 50 mg / ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Sistein,% 99 + | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri kabı | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Buzdolabı II | Boekel | 260009 | Embriyolar için tezgah üstü inkübatör. |
| Gap43-RFP plazmidi | İzleyici RNA yapmak için. Referans: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dekstran, 10.000 MW | Invitrogen | D1817 | İzleyici. |
| Moleküler biyoloji sınıfı, USP steril arıtılmış su | Corning | 46-000-CI | |
| 7 "Drummond yedek tüpler | Drummond | 3-000-203-G / XL | Mikroenjeksiyon iğneleri. |
| İğne çektirme | Sutter Instruments | P-30 | |
| İnce forseps | Dumont | 11252-30 | Mikroenjeksiyon iğne ucunu kırmak için. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Mikroenjektör. |
| Mineral yağ, ağır | Fisher | CAS 8042-47-5 | İğneler için yağ. |
| 27 G Monoject hipodermik iğne | Covidien | 8881200508 | Mineral yağı mikroenjeksiyon iğnesine yüklemek için kullanılır. |
| 5 ml Luer-Lok şırınga | BD | 309646 | Mineral yağı mikroenjeksiyon iğnesine yüklemek için kullanılır. |
| 60 mm x 15 mm Petri kabı | Fisher | FB0875713A | |
| 800 mikron Polyester ağ | Küçük Parçalar | CMY-0800-C | |
| Transfer pipetleri | Fisher | 13-711-7M | Embriyoların transferi için. Embriyoların pipet tarafından kolayca alınması için ucu kesin. |
| 6 oyuklu hücre kültürü plakası | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehit | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Vidalı şişe | Fisher | 03-339-25B | Embriyoları sabitlemek, boyamak ve saklamak için. |
| 24 oyuklu hücre Kültür plakası | Nest Biyoteknoloji | ||
| Benzokain | Spektrumu | BE130 | |
| Etanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Metanol | Fisher | A412-4 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) 1x toz | Fisher | BP661-50 | |
| Sığır serum albümini | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Keçi serumu, Yeni Zelanda menşeli | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodyum azid | Fisher | S227I-25 | |
| Monoklonal 3G8 antikoru | Avrupa Xenopus Kaynak Merkezi | Proksimal etiketlemek için birincil antikor Kamışı. | |
| Monoklonal 4A6 antikoru | Avrupa Xenopus Kaynak Merkezi | Ara, distal ve bağlantı tübüllerini etiketlemek için birincil antikor. | |
| anti-RFP pAb, saflaştırılmış IgG / tavşan | MBL | PM005 | Gap43-RFP izleyiciyi etiketlemek için birincil antikor. |
| Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG | Life Technologies | A11001 | Böbrek tübüllerini etiketlemek için ikincil antikor. |
| Alexa Fluor 555 keçi anti-tavşan IgG | Life Technologies | A21428 | Gap43-RFP izleyiciyi etiketlemek için ikincil antikor. |
| 9 Boşluklu nokta plakası | Corning | 7220-85 | |
| Benzil benzoat | Fisher | 105862500 | İsteğe bağlı - embriyoları temizlemek için |
| Benzil alkol | Fisher | A396-500 | İsteğe bağlı - embriyoları temizlemek için |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste