Method Article

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

DOI:

10.3791/53819

⸱

April 10th, 2016

 ,  , 
1Department of Advanced Technology, The MITRE Corporation, 2Center for Biomedical Engineering, Brown University, 3The MITRE Corporation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni antimikrobiyal proteinlerin potansiyel üreticileri için büyük mikrobiyal kütüphanelerin ilk değerlendirmeleri, daha fazla araştırma çabası ve kaynak harcamadan önce hedef enzimleri taramak için hem kalitatif hem de kantitatif yöntemler gerektirir. Bu protokolün amacı, bu ilk değerlendirmeleri yürütmek için iki tamamlayıcı test göstermektir. Mikroslayt difüzyon testi, hem canlı hem de ısıyla öldürülen bir dizi bakteri hedef substratına karşı proteolitik aktivitenin kalitatif ve hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için bir başlangıç veya basit bir algılama ekranı sağlar. Bir muadili olarak, boya salım testinin artan duyarlılığı ve tekrarlanabilirliği, protein antimikrobiyallerinin hidrolitik aktivitesini etkileyen çevresel etkilerin değerlendirilmesi ve karşılaştırılması için nicel bir platform sağlar. Spesifik ısıyla öldürülmüş hücre kültürü substratlarını Remazol parlak mavi R boyası ile etiketleme yeteneği, bu yeteneği, ilgilenilen enzimatik aktiviteyi karakterize etmek için boya salım testini uyarlamak için genişletir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antimikrobiyal ajanlar, virüsler, mantarlar ve bakteriler gibi çok çeşitli mikroorganizmaların hedeflenmesinde önemli bir rol oynar. Çeşitli bakteriler tarafından üretilen antimikrobiyal aktiviteler, klinik olarak ilgili bakteriyel patojenler de dahil olmak üzere geniş spektrumdan türe özgü olana kadar hedef özgüllük açısından değişir 1. Doğada, bakteriyosinler ve lizinler gibi protein antimikrobiyal bileşikleri, kendini savunma, replikasyon ve besin edinimi için mikrobiyal bir araç cephaneliğini temsil eder 2,3. Mikrobiyal topluluklar içinde popülasyon dinamiklerinin aracıları olarak hizmet eden protein antimikrobiyalleri, üreten organizmaya üretmeyen, hassas türlere göre rekabet avantajı sağlar 4. Rekombinant enzimler ve probiyotikler olarak, bu proteinler aynı zamanda ekonomik ve toplumsal bir öneme sahiptir, çünkü bakteri popülasyonu içindeki antimikrobiyal direncin her yeni genişlemesiyle yeni patojen kontrol kaynaklarına olan ihtiyaç artar 5.

Yeni keşfedilen protein antimikrobiyallerinin ilk değerlendirmeleri, enzimin doğasında bulunan temel fiziksel özelliklerin belirlenmesini içerir. Potansiyel antimikrobiyallerin hızlı taranması için yöntemler, istenen hedef substratlara karşı hidrolitik aktiviteye sahip adayların seçilmesine izin verir. Mikroslayt difüzyon deneyi ve kantitatif boya salım deneyi, enzimatik hidrolizin tespitinde çeşitli substratların kullanılmasına izin verir. Bakteri hücre duvarına karşı aktiviteye sahip protein antimikrobiyal enzimler için, bu testlerin çok yönlülüğü, canlı bakteri hücrelerine (yalnızca mikroslayt testi), ısıyla öldürülmüş tüm bakteri hücresi substratlarına veya hedef bakteriden saflaştırılmış peptidoglikana karşı hızlı ve etkili, kalitatif ve kantitatif taramaya izin verir. Bu tahliller, alternatif terapötikler, gıda takviyeleri ve biyofilm üretim inhibitörleri gibi alanlarda kullanım için antimikrobiyal enzim keşfinde faydalıdır.

Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, yeni protein antimikrobiyallerinin tespiti ve karakterizasyonu için gösterilen yöntemlerdir. Mikroslayt difüzyon testi, antimikrobiyal aktivitenin nispi (kalitatif) bir tahminini sağlar ve enzim konsantrasyonu ve aktivitesinin minimum çıkarımına izin verir. Bu yöntemi kullanarak, aktivite, bölge oluşumu eksikliği ile sonuçlanan aktivite yokluğu ile bir lizis bölgesinin gelişimi olarak kolayca görselleştirilir. Bölge gelişme hızı ve bölge çapı, numunede bulunan enzimin miktarının ve saflığının göstergesidir; Bununla birlikte, bu oran ve bölge içindeki substrat temizlemenin kalitesi, kirleticilerin varlığından, hidroliz reaksiyonunun eksiksizliğinden ve substrat tipinden de etkilenebilir. Enterferans yapan kirleticiler, kuyudan enzim difüzyon hızını etkileyebilirken, eksik hidroliz veya substrat tipinin varyasyonu, bulanık bir lizis 6 bölgesine neden olabilir.

Boya salım testi, enzimatik olarak hidrolize edilmiş substrattan reaksiyon süpernatantına salınan kovalent bağlı Remazol parlak mavi R boya ürünlerinin miktarını kantitatif olarak değerlendirir. Yöntem, substrattaki bir farklılıkla ilişkili yalnızca hafif bir değişkenliğe sahiptir, bu nedenle mikroslayt difüzyon testine kıyasla hidrolizin tespiti için daha fazla hassasiyet sağlar. Bu özellikler, yöntemin, enzimin biyokimyasal özelliklerinin karakterizasyonunda ve farklı antimikrobiyal enzimler arasında karşılaştırma için testin standardizasyonunda fayda sağlamasına izin verir.

Bu protokolde, her biri için algılama limitlerinin ve değişkenliğin ölçeğini gösterirken, temel mikroslayt difüzyon testini ve boya salım testini gerçekleştirmek için yöntemler sunuyoruz. Tahliller, karakterize edilmemiş bir toprak bakteri izolatının kültür süpernatantından saflaştırılmış bilinmeyen bir protein antimikrobiyalinin temel değerlendirmelerini yapmak için kullanılır. Tahlillerde bakteri hücresi substratlarına karşı gözlenen aktiviteler, daha önce karakterize edilmemiş bir protein antimikrobiyal ile bir kontrol proteolitik enzimi olan α-kimotripsin arasındaki reaksiyon aktivitelerinin karşılaştırılmasına izin verir. Bu protokoller, çeşitli uygulamaları barındırmak için genişletilebilen ve değiştirilebilen iki tekniğin uygulanması için bir temel sağlar.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel ve peptidoglikan Yüzeyler 1. hazırlanması

Not: Bütün hücre bakteri alt-tabakalar ve saflaştırılmış peptidoglikanlar mikroslayd difüzyon testi ile ve boya salım deneyinde, her iki enzim alt tabaka olarak kullanılır. Bu yüzeyler enzim reaksiyonları iletken öncesinde hazırlık gerektirir. Aşağıdaki protokol bunların hazırlanmasını tarif etmektedir.

  1. Tüm Bakteri Hücre Yüzey
    1. Bacillus subtilis 168 2 ml gecelik kültürü ile besleyici et suyu 500 mi inoküle bakteriyel hücre alt-tabakanın üretir (American Type Culture Collection ATCC 23857). Kültür bakteri kültürü ikiye katlanması ile elde edilen hızlı bir büyüme fazı olarak tanımlanan büyüme üstel bir faz ulaşana kadar (125 rpm) çalkalama ile 30 ° C'de inkübe edin. Salmonella enterica subsp ekimi için. Enterica (ATCC 10708), (125 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de büyüme ortamı olarak besin sıvısı kullanır.
    2. basınç 3 atmosfer altında, 121 ° C'de 10 dakika süre ile otoklavlama sureti her kültürün ısı öldürür.
    3. 5,000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj ile ısı ile öldürülmüş bakteriyel substrat hasat edilir. Tip 1 su ile pelet üç kez yıkayın ve su az miktarda yeniden askıya. Bu çalışmada, 1200 ul yüzeylerde askıya.
    4. Kısım 20 ° C'de 1.5 ml mikrofüj tüplerine ve saklamak için bakteriyel hücre alt tabakalar 300 ul.
  2. Arıtılmış peptidoglikan Yüzey
    1. (Malzemeler ve Ekipmanları Tablosuna bakınız) hedef alt tabaka bakteriden 7-10 den peptidoglikan arındırmak ya da bir satıcıdan kazanır. aksesuar hücre duvarı polimerlerden ham peptidoglikan hazırlıkları arındırın.

2. Nitel mikroslayd difüzyon deneyi [Lachica değişikliğe uğratılmış ve ark., 11]

Not: mikroslayd difüzyon deneyidirbir numunedeki antimikrobiyal enzimin varlığını tespit etmek için olan bir metottur. Enzim bir agaroz matrisine ihtiva eden alt-tabaka ile yayılır zamanda enzim substratı hidroliz gibi, açıklığın bir bölge geliştirir. Aşağıdaki protokol niteliksel proteini antimikrobik varlığını tespit etmek için mikroslayd difüzyon deneyi hazırlanması ve performansı açıklanmaktadır.

  1. üreticinin protokolüne göre bir Bikinkoninik asit (BCA) Protein Deney Kiti kullanılarak değerlendirilebilir antimikrobiyal enzim konsantrasyonunun belirlenmesi.
  2. bir enzim tampon olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanmaktadır; Bununla birlikte, deneysel olarak verilen enzim için tampon uygun olan belirler.
  3. reaksiyon tampon olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile antimikrobiyal enzim seri seyreltme gerçekleştirin. Bu mikroslayd difüzyon deneylerinde kullanılan seri seyreltme 0 ug, 10 ug, 100 ug, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug, 1 nihai deney proteini kitleleri üretilebilirreaksiyon hacmi ortalama 0 mg.
  4. Bireysel mikrofüj tüplerine, protein kitleleri koyun ve reaksiyon, kuyu mikroslayd ek hazırlık olarak PBS kullanılarak ul 20 protein seviyesini ayarlamak.
  5. PBS, 50 ml agaroz 0.25 g eritilmesi ile% 0.5 agaroz çözeltisi olun. agaroz tamamen eriyene kadar kaynama noktasına çözelti ısıtılır. ağırlıkça eritme işlemi sırasında kaybolan su belirlemek ve çözüm geri ekleyin.
  6. Agaroz çözeltiye, su içerisinde% 10 sodyum azid, 50 ul ekleyin ve bir su banyosu içinde 50 ° C'ye kadar çözeltinin sıcaklığını ayarlamak. Sodyum azit mikroslayd difüzyon deneyinin inkübasyon sırasında bakteri büyümesini kirletici inhibe etmek için ilave edildi. canlı hücreler alt-tabaka olarak kullanılması halinde, agaroz çözeltisi sodyum azid sayın.
  7. buz üzerinde ısı ile öldürülmüş bakteri substrat çözülme.
  8. Yeniden askıya yaklaşık agaroz çözeltisi 12 ml bakteri alt-tabaka bir 2.0 MCF bulanıklığının eşleşenArland (Malzeme Tablo) standart eşdeğerlik. yaklaşık bulanıklık elde edilene kadar agaroz bakteriyel maddesinin eklenmesi, çözümlerle beyaz arka plan üzerinde siyah bir çizgi görselleştirerek çözümler bulanıklığı karşılaştırın.
  9. Hemen, her mikroslayd (25 x 75 x 1 mm 3) agaroz-alt-tabaka çözeltisi 3 mL pipet.
  10. slaytlar kuvvetlendirmek sonra bir mantar delici (4.8 mm çap) kullanarak her mikroslayd agaroz-alt tabakanın üç kuyu yumruk. ilgili kuyucuklara her biri ayarlanabilir bir protein seri seyreltme 20 ul ekle.
  11. de bir negatif kontrol olarak PBS (20 ul) ya da sığır serum albümini (20 ul PBS içinde 5 ug) kullanın. Bir pozitif kontrol olarak, bu tür lizozim şekilde alt-tabaka için uygun bilinen bakteriyolitik enzimler kullanın.
  12. 37 ° C'de bir nem odasında slayt veya enzimin optimum aktivitesi sıcaklığı inkübe edin. inkübasyon süresi konsantrasyonuna bağlıdır veAntimikrobiyal enzimin spesifik aktivitesi. Tipik reaksiyon süresi, bir gece boyunca (yaklaşık 16 saat).
  13. inkübasyondan sonra, yaklaşık 30 cm odak mesafe 60 mm lens ile dijital tek lensli refleks kamera kullanarak gelişmekte olan testinin dolaylı ışık ve yakalama görüntüler altında slaytlar uyun.
    Not: Verilen alt tabaka için protein antimikrobiyal Enzimatik aktivite enzim agaroz içine yayılır yanı etrafında oluşturan hidroliz net bir bölge gelişimi ile ilişkilidir.
  14. enzimatik aktivitesini hak kazanmak için, her iyi etrafında oluşturan bölgelerin boyutlarını gözlemleyin. Düşük enzimatik aktivitesi niteliksel daha küçük bir bölgeye ilgili olsa da yüksek enzimatik etkinlik nitelik, daha büyük bir bölgesi ile ilgilidir.

3. Yüzey Etiketleme - Remazol Brillant Blue R Boya Etiketleme [Zhou 12 Modifiye]

Not: boya salım deneyinde, alt-tabaka kovalent linke oland parlak mavi R boyası Remazol için. Aşağıdaki protokol, boyanmış enzim substratları hazırlanmasını tarif etmektedir.

  1. Tip I su 99 ml 1 g NaOH çözülmesiyle 250 mM sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi yapmak 200 mM Remazol Parlak Mavi R boyası (RBB) çözeltisi yapmak için kullanılır.
  2. Taze 250 mM NaOH çözeltisi (adım 3.1) 98.75 ml ± 1 ml 1.25 g RBB eriterek 200 mM RBB çözüm olun.
  3. RBB çözeltisi, 30 ml 0.5 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda ısı ile öldürülmüş bakteriyel hücreler yeniden askıya. saflaştınldı peptidoglikan için, RBB çözeltisi, 30 ml 0.3 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda peptidoglikan yeniden askıya.
  4. yumuşak bir karıştırma ile, 37 ° C'de 6 saat süreyle dönüşlü bir platform üzerinde bir Erlenmeyer şişesi içinde, reaksiyon karışımının inkübe edin.
  5. 4 ° C inkübatör Reaksiyon karışımı aktarın ve yumuşak karıştırma ile ilave bir 12 saat daha inkübe edilir.
  6. İnkübasyondan sonra, 3000 x g'de santrifüj ile boyanmış alt-tabakanın hasat30 dakika karıştırıldı. alt-tabaka pelet boya çözeltisini süzün.
  7. ardından santrifüj Tip I su ile tekrar tekrar (yaklaşık 3-5 yıkama) boya etiketli hücreler veya peptidoglikan yıkanarak substrattan kovalent olmayan bir şekilde bağlanmış çözünebilir boya çıkarın. Her su ilavesi ile iyice pelet yeniden askıya.
    Not: ilişkisiz, çözünür boya artık santrifüj sonra suyla yıkayın görünür olduğunda. alt-tabaka bir ek yıkama verilmelidir. Son yıkama yüzer açık olacak ise alt tabaka, mavi kalacağını unutmayın.
  8. daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de bir su az miktarda süspanse boyanmış substratlar saklayın.

4. Kantitatif Boya-release Deneyi

Not: boya-release Deney sırasında reaksiyon süpernatant içine ürünleri boyalı enzimatik reaksiyon sürümlerde RBB-boyalı substrat hidrolizi. salınan boya miktarının kolorimetrik bir ölçümü amo gösterirBelirli bir enzimin numune içinde mevcut enzim etkinliğinin etkili olduğu akla. Kantitatif bir yöntem alt tabakalar üzerindeki farklı enzimlerin karşılaştırmasını sağlar ve enzimatik reaksiyonu (örneğin, sıcaklık, tuz ve pH) etkileyen çevresel koşulların varyasyona izin verir. Aşağıdaki protokol kantitatif protein antimikrobik enzimatik aktivitesini tespit etmek için, boya salimli bir tayinin hazırlanması ve performansı açıklanmaktadır.

  1. Boya salım analizi için hazırlık
    1. Dondurulmuş, boyanmış alt-tabaka, oda sıcaklığına dönmesi ve ampirik olarak verilen enzim için belirlenen deney tamponu (PBS) ile iki kere yıkayın izin verin.
    2. yapılacak boya salma tahlilleri sayısına göre 200 ul reaksiyon hacmi çarpılarak gerekli olan alt-tabaka süspansiyonu hacmi hesaplanır.
    3. (Optik yoğunluk elde edilene dek, 4.1.2 belirlenen deney tamponu hacmi, boyanmış alt-tabakanın eklenmesiyle alt-tabaka süspansiyonu hazırlamak2.0 OD) bir spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de elde edilmiştir. Konsantre çözeltinin 1 seyreltme: spektrofotometre fonksiyonel sınırlar dahilinde kalması için, 1 için 1.0 olarak 2.0 OD 595 ölçün. boş olarak deney tamponu kullanın.
      Not: Reaksiyon için alt-tabaka bulanıklığının yüksek verimli enzimlerin aktivite düzeylerinin eşleştirmek için 2.0 dışına kaldırılabilir.
    4. Protein antimikrobik Askıda 1 mg / ml'lik bir tahmini konsantrasyonda deney tamponu içinde değerlendirilmelidir.
    5. imalatçının protokolüne göre bir BCA Protein Deney Kiti mikroplaka testi kullanılarak, protein örneğinin gerçek konsantrasyon tahlil edilecek belirler. mi deney tamponu kullanılarak 1 mg / hazır süspansiyonun konsantrasyonu ayarlayın.
  2. Bir Protein Antimikrobiyal için Optimal Kuluçka Şartları belirleme Boya-release Testi kullanarak
    1. 100 ng / ul stok proteini antimikrobiyal süspansiyon sulandırmak. Bu konsantrasyon af verirhacme (10 ul) başına protein 1 ug nominal reaksiyon kütlesi deney reaksiyona ilave edildi.
    2. Termal aralığını belirlemek bakteriyolitik protein için değerlendirilmelidir. Bu deneylerde ısı aralığı 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C ve 65 ° C 'de yer.
    3. 0.5 mi mikrofüj tüplerinde Reaksiyon tahlilleri gerçekleştirin. her bir termal bir durum için, hazırlanan alt-tabaka süspansiyonu 200 ul stok protein 10 ul ekle.
    4. saatte bir kez ters çevirme ile karıştırılarak 8 saat, bir termal döngü içinde inkübe edin.
    5. inkübasyondan sonra, etanol 25 ul ekleyerek reaksiyonlar tutuklama.
    6. 2 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile Sindirilmemiş, çözünmeyen substrat çıkarın ve sindirilmemiş substratın pelet bozmak için dikkatli bir şekilde bir 96-gözlü düz dipli mikroplakanın her bir reaksiyon karışımı, reaksiyon yüzer 150 ul aktarın.
    7. Protein Antimicrob enzimatik aktivitesini ölçmekçözünebilir RBB boya miktarının belirlenmesi ile verilen alt tabaka için ial enzimatik hidroliz sonrasında substrat ayrışmış. enzimatik aktivitesini ölçmek için, bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de süpernatanın absorbansı ölçülür. etiketli substrattan süpernatan salınan çözünebilir boya ile artan emme enzimatik aktivitesinin kantitatif ölçüsüdür.
      Not: absorbanstaki değişiklik aktivitesi birimi (AU) ile temsil edilir burada 595 nm'de boya salimli Reaksiyon yüzen maddelerinin optik yoğunluğu bir 0.01 artış 1. Tüm sonuçlar. enzim hariç bütün reaksiyon bileşenleri ile kuluçkalanmıştır boş Reaksiyon, RBB-etiketli substrattan bağlı inkübasyondan bırakan herhangi bir boya çıkarma için kullanılır. Optimal enzimatik sıcaklık pik aktivite ünitesi ölçüm sağlar.
    8. Tekrarlayın 4.2.7 ile 4.2.1 antimikrobiyal enzimi için en uygun tampon koşulları belirlemek için çeşitli inkübasyon tamponlar kullanarak adımları. these deneyler, PBS kullanın.
  3. Boya-release Testi kullanarak bir Protein Antimikrobiyal için Optimal inkübasyon Sıcaklığında minimal Aktif Konsantrasyon belirleme
    1. deney tamponu kullanılarak hazır antimikrobiyal bir protein süspansiyonu bir seri seyreltme gerçekleştirin. seyreltme serisi aralığı antimikrobiyal enzim aktivitesi ile değişecektir. Bu deneylerde kullanılan seri seyreltme 0 ug, 10 ug, 100 ug, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug ve 10 ug son deney proteini miktarlarda üretilmektedir.
    2. 48-gözlü düz tabanlı bir mikrolevhadaki her Reaksiyon deneyi gerçekleştirmek. Her bir deney koşulu için, hazırlanan alt-tabaka süspansiyonu 200 ul ilgili protein süspansiyonu 10 ul ekle. Reaksiyon tamponu kullanılarak 10 ul reaksiyona ilave protein çözeltisinin hacmi herhangi bir değişiklik yapın.
    3. buharlaşma nedeniyle hacim değişimini önlemek için plaka sızdırmazlık film ile mikroplağı mühür. Belirlenen optimum olarak bir çalkalama inkübatörçalkalanarak 16 saat antimikrobiyal verilen protein için cubation sıcaklığı.
    4. ardından her etanol 25 ul ekleyerek reaksiyonu, durdurur ve 2 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile sindirilmemiş substrat çıkarın.
    5. Sindirilmemiş substratın pelet bozmak için dikkatli bir şekilde bir 96-gözlü düz dipli mikroplakanın her bir reaksiyon karışımı, reaksiyon yüzer 150 ul aktarın.
    6. enzimatik aktivitesini ölçmek için, bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de süpernatanın absorbansı ölçülür. enzim hariç bütün reaksiyon bileşenleri ile kuluçkalanmıştır boş Reaksiyon, RBB-etiketli substrattan bağlı inkübasyondan bırakan herhangi bir boya çıkarma için kullanılır. etiketli substrattan süpernatan salınan çözünebilir boya ile artan emme enzimatik aktivite için niceliksel ölçümünü sağlar.
      Not: absorbanstaki değişiklik aktivitesi birimi (AU), 1. Tüm sonuçlar ile temsil edilir595 nm 'de bir boya salimli Reaksiyon yüzen maddelerinin optik yoğunluğu bir 0.01 artış.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikroslayd difüzyon deneyi ve kantitatif boya-salınım testi tarama ve yeni bir protein antimikrobik ilk soruşturma ölçmek için etkili yöntemlerdir. Her deney avantajları ve sınırlamaları vardır; bağlantılı olarak gerçekleştirilen, ancak, bunlar, hızlı ilk tarama ve bir antimikrobiyal temel özelliklerini sağlar.

mikroslayd difüzyon deneyi etkin protein antimikrobiyal üreten mikrop kütüphanelerinin hızlı taranması için izin verir. Enzim konsantrasyonu seviyeleri endişe, algılama kısıtlamaları duyarlılığı reaksiyonu, daha boya salım deneyinde eklenecek enzimin daha büyük bir miktarda gerektiren deneyi sınırlayabilir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, tahlilin niteliksel özellikler gözlemci her bir mesafede bulunan göreli enzim miktarları karşılaştırma sağlar.

Şekil 1A gösterilen lizis gelişmekte olan bölgesi, içinde (25 enzim ug), bölgenin öncü, alt tabakanın bulanık veya eksik parçalanma görüntüler ise de en yakın bölge daha eksiksiz bir alt tabaka lizis gösterir. Bu olgu, ön kenarda difüzyon enzimin azalan konsantrasyonunun bir ürünü, bölge çapının doğru ölçüm zorlaştırmaktadır. Şekil 1 'de görülen oyuklar B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), D (1.0 ug), ve F (0.1 ug) ve tam lizis bölgesinin çapı yok olmasına dağıtır enzimin düşük miktarda ilişkilendirilmesi. Durum F (0.1 ug) için, agaroz içinde enzim konsantrasyonu bu alt-tabakanın hidrolize, agaroz içinde hareket ederken yayılan enzim görüntülenmiştir sağlayacak sınırının altındadır. Mikroslayd difüzyon deneyi de saflaştırılmış Bacillus subtilis peptidleri kullanılarak çalıştırıldıalt-tabaka olarak doglycan (Şekil 2). Bölge nedeniyle eşit agaroz askıya peptidoglikan isteksizliği bütün hücre Salmonella enterica ile gözlenen daha az tanımlanmış olmasına rağmen, bilinmeyen antimikrobiyal enzimi ile peptidoglikan hidroliz açıktır.

boya salım deneyi enzim reaksiyonu etkileyen çevresel faktörlerin bir alt saptama sınırı ve varyasyon sağlayan, mikroslayd difüzyon deneyi daha hassas ve çok yönlü bir testtir. Örnek deneyler, sıcaklık antimikrobik enzim için optimum sıcaklık saptanması için değiştirilmiştir, 35 ° C PBS içinde (Şekil 3) olarak belirlendi. Bu, en uygun mavi renk (Şekil 3B) ve 595 nm (Şekil 3A) absorbans ölçümlerinden elde edilen aktivite birimleri temsil edildiği gibi fazla miktarda Reaksiyon süpernatanları açıkça görülmektedir.boya salım deneyinde çok yönlülüğü araştırmacının hızlı bir şekilde belirli bir enzim için uygun kuluçkalama koşulları belirlemek için sıcaklık, aynı zamanda, reaksiyon tampon ve tampon bileşenleri sadece değişmesini sağlar.

Bilinmiyor antimikrobik enzim (Şekil 4) ve α-kimotripsin kontrol enzimi (Şekil 5) arasında aktivite düzeyi RBB-etiketli Bacillus subtilis ısı ile öldürülmüş alt-tabakaya karşı PBS içinde 35 ° C'de belirlenen uygun inkübasyon sıcaklığında ölçüldü. Şekil 4 ve Şekil 5 ile ilgili sonuçların karşılaştırılması bilinmiyor antimikrobiyal enzim B. neredeyse iki katı bir afiniteye sahip olduğunu göstermektedir subtilis alt-tabaka. Buna ek olarak, α-kimotripsin kontrol tamamen ısı ile öldürülmüş B. sindirmek vermedi oyuk içindeki subtilis alt-tabaka (veriler gösterilmemiştir). α-kimotripsin kontrol aktivitesi plaka başlarau 0.3 ug bilinmiyor antimikrobik enzim (Şekil 4 ve Şekil 5) Tüm enzim miktarları arasında aktivitesi birim olarak sürekli artış ile karşılaştırıldığında. Bu bilinmeyen enzim daha büyük bir kalıcı etkinliğe sahip olduğunu veya B içindeki enzime uygun yarılma bölgeleri daha fazla sayıda olduğu gösterebilir subtilis alt-tabaka.

figure-results-1
Şekil 1:. Salmonella enterica Tüm Hücre alt-tabakaya karşı Enzim Aktivitesi mikroslayd difüzyon deneyi niteliksel ısı ile öldürülmüş Salmonella enterica subsp karşı bilinmeyen bir protein antimikrobik etkinliğini değerlendirmek için kullanılan enterica (ATCC 10708).. ilgili kuyucuklara ilave edildi, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde süspansiyon haline bilinmiyor antimikrobik protein kütlelerislaytlar dahil 25 mikrogram (iyi A) ug (kuyu B), 10 ug 15 (iyi C), 5 mg (iyi D), 1 ug (iyi E) ve 0.1 ug (iyi F). Sadece PBS deneylerinin negatif kontroller kullanılmıştır. Lizis Bölgeleri 6 saat inkübasyondan sonra görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2:. Enzim Aktivitesi Bacillus subtilis karşı peptidoglikan Hücre duvarı mikroslayd difüzyon deneyi niteliksel Bacillus subtilis 168 peptidoglikan karşı bilinmeyen bir protein antimikrobik etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı. PBS 20 ul, bilinmeyen bir antimikrobik 10 ug içinde süspansiyon haline de bir mikroskopta ilave edildi. Sadece PBS negatif olarak kullanılmıştırtahlil (kuyu B) kontrolü. Lizis zon 37 ° C'de 6 saatlik inkübasyondan sonra görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: a. Protein optimal reaksiyon sıcaklığı Antimikrobiyal boya salım deneyinde çok yönlülüğü ilgi 6 enzim aktivitesi üzerindeki etkilerini belirlemek üzere inkübasyon sıcaklığı ve tamponlar gibi fiziksel ve kimyasal parametreler, farklılaştınlabilmektedir. Bu şekilde gösterildiği gibi, bilinmeyen bir protein, antimikrobik (1 ug) aktivitesi inkübasyon bir sıcaklık aralığı altında RBB-etiketli ısı ile öldürülmüş, Bacillus subtilis karşı PBS içinde değerlendirilmiştir. Aktivite birimleri (AU) (A), RBB-b absorpsiyon olarak görüntülenirHidroliz Bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de ölçülmüştür sonra ound ürün yüzer bırakıldı. her bir sıcaklık koşulu da eklenmiş bir enzim ile reaksiyonları çeşitli sıcaklıklarda inkübasyon sonucunda salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her inkübasyon sıcaklığına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümü (B) öncesinde görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: a. Protein faaliyet sahası Antimikrobiyal bilinmeyen bir protein antimikrobiyal için aktivite aralığı 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ve 1000 ng gece boyunca inkubasyon sonrası aktivite birimleri olarak ölçülmüştür BCA prot ile ölçülenEin deney (A). Bu reaksiyonlar için, RBB-etiketli B. subtilis için yüzey enzim (1.000 ng) en yüksek miktar ile reaksiyonu tamamen Reaksiyon inkübasyon süresi içinde mevcut bulunan tüm alt-tabakanın hidrolize etmedi sağlamak için 595 nm 'de 5.0 bir optik yoğunluk elde yükseltilmiştir. ilave enzimsiz kontrol reaksiyonları tek inkübe kaynaklanan salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her enzim miktarına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümleri (B) öncesinde görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5:. Α-kimotripsin için α-kimotripsin aktivitesi aralığı için Etkinlik Aralığı activ olarak ölçüldügecede inkubasyon sonrası lık birim 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ve enzim (A) 1000 ng. Bu reaksiyonlar için, RBB-etiketli B. subtilis için yüzey enzim (1.000 ng) en yüksek miktar ile reaksiyonu tamamen Reaksiyon inkübasyon süresi içinde mevcut bulunan tüm alt-tabakanın hidrolize etmedi sağlamak için 595 nm 'de 5.0 bir optik yoğunluk elde yükseltilmiştir. ilave enzimsiz kontrol reaksiyonları tek inkübe kaynaklanan salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her enzim miktarına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümleri (B) öncesinde görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikroslayd difüzyon deneyi ve boya-salınım testi tespit ve daha önce tanımlanmamış, protein antimikrobiyal karakterize etmek için avantaj sağlamaktadır. Bu hızlı ve hassas yöntemler büyük araştırma bilgi yatırım önce yararlı enzimler tanımlanması için bir organizma kaynağı kütüphanelerin yüksek verimli tarama sağlar. üst düzey hedef enzim tanımlanır gibi, tespit deneylerinin varyasyonları enzimi hızla tespit etmek veya enzim biyokimyasal özelliklerini belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, bir çok basamaklı protein saflaştırma şemasının, mikroslayd difüzyon deneyi hızlı konusu enzimi ihtiva eden fraksiyonlar algılayabilir. Buna ek olarak, enzim reaksiyon Optima boya salım deneyinde Reaksiyon tampon ve kuluçkalama sıcaklıklarının değiştirilmesiyle belirlenebilir.

mikroslayd difüzyon testinde tespiti için gerekli enzim olan kütle aralığı enzim karakterize eden bir fonksiyonudurampüller. Deneyin tarama sınırlamalar genellikle, boya-salım analizi daha enzimin yüksek miktarlarda kullanılmasını gerektirir. Bu çalışmada, boya salım analizi (Şekil 4) mikroslayd difüzyon deneyi (Şekil 1) tespit limitleri karşılaştırması mikroslayd difüzyon deneyi boya salım deneyinde daha az hassas bir teknik olduğunu gösterilen. Enzim konsantrasyonu bir endişe olmadığı zaman, mikroslayd tahlil düşük işgücü ve ekipman talepleri hedef yüzeylerde karşı protein Antimikrobiyal maddelerin üretimi için kütüphanelerin hızlı başlangıç ​​taranması için izin verir. daha fazla çaba ve ekipman gerektiren birlikte, boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için aynı ya da farklı enzimler, boya-salım deneyleri ile karşılaştırma yapmak kantitatif sonuçlar hasıl daha hassas ve tekrarlanabilir. iki yöntem kolayca çok özel enstrümantasyon gerek olmadan en mikrobiyolojik laboratuvarlarda yapılır. temsilcilerimiz içindemikroslayd difüzyon testinde tespit az miktarda 1 ug (veriler gösterilmemiştir) ise tive deneyler, kontrol enzimi, α-kimotripsin, boya salım deneyi kullanılarak 100 ng (Şekil 5) gibi düşük bir miktarda tespit edilmiştir.

Antimikrobiyal enzimler için kalitatif tespitinde olarak kullanıma sunan, difüzyon deneyi varyasyonları bir dizi 11,13 bildirilmiştir. Bu deneyleri incelerken, mikroslayd difüzyon deneyi ilk ekran olarak nispeten yüksek hassasiyet ve tepki gözetilmesi kolaylığı için geliştirilmiştir. Proteini ile de yayılır şekilde agaroz bindirmeleri Staphylococcus aureus suşları tarafından nükleazlara üretimini tespit etmek için kullanılan edildiği Lachica ve ark., 11 çalışması, değişikliğe uğratılmış mikroslayd difüzyon deneyi radyal immünodifüzyon yöntemi 14 ile benzer biçimde çalıştırılır agaroz alt tabaka ihtiva etmektedir. radyal immunodiffuSistem agaroz içinde yayılma antijen ve antikor arasındaki bir kompleks oluşumu denge ulaştığında yon yöntemi immünopresipitasyon bölgenin genişleme durur. Bunun aksine, mikroslayd difüzyon deneyinin alt-tabaka, ilk başta açıklanan çevreleyen liziz bir sürekli genişleyen bölgede yayılan bir protein antimikrobik ile sindirilmiştir. enzim aktivitesi, kaybeder ya da alt-tabaka bitene kadar bölge artan çapı devam eder. liziz bölgesinin üretim oranı enzim, saflık ve böylece belirli bir etkinlik olarak hızlandı veya enzim konsantrasyonu de artar ilave edildi.

Kantitatif ısı ile öldürülmüş B'ye karşı protein antimikrobik enzimatik aktivitesini değerlendirmek için subtilis boya salınım testi seçildi. Remazol parlak mavi R boyası (RBB) kullanılarak kolorimetrik analizler yüzeyler protein antimikrobiyal eylemlerinde çok yönlü ve hassas değerlendirilmesine imkan -etiketlity. hali hazırda 595 nm'de bir spektrofotometre ile ölçülebilir çözünebilen, mavi ürünlerin açıklamasında RBB-etiketli Substrat enzimatik hidrolizi. diğer protein antimikrobik enzimler karakterize etmek için geliştirilmiş RBB boya salım deneyinde çeşitli varyasyonları, diğer substratlar ile uygulama için, bu deneyde esnekliğini göstermektedir. Örneğin, bir bakteriyolitik lysostaphin etkisini belirlemede, Zhou ve ark., RBB-boyalı stafılokok hücreleri ve alt tabakalar 12 olarak stafilokokal peptidoglikan kullanılarak bir boya salım deneyi bildirilmiştir. Bu RBB boya salım deneyinde uygulanmasının bir modifikasyonunda, RBB-etiketli Micrococcus luteus alt-tabaka, örneğin bakteriyel enfeksiyon ve habis karsinom varlığında gibi hastalıkların teşhis etmek için bir hızlı ve hassas bir araç olarak kullanımı ve ekran için önerilmiştir hangi olabilir kan serumunda 15 insan lizozim ekspresyon düzeyleri ile korele edilebilir. Buna ek olarak, RBB-etiketli bakteriyel hücre substratları olduğu birLSO lizozim 16 tespit edilmesi için bir zimogram yöntemi kullanılmıştır.

Bu enzim üretimi için hızlı bir arşiv taraması için izin boya salım deneyinde alçaltılmış saptama limiti, kolaylık ve tekrarlanabilirlik göstermektedir. Deneyin değişiklikler sıcaklık, pH, tuzluluk etkilerinin yanı sıra antimikrobiyal proteinlerin 6 aktivitesi diğer proteolitik enzimlerin etkilerini de dahil olmak üzere alt niceliksel biyokimyasal karakterizasyonu deneyleri, izin verir. Buna ek olarak, sayısal boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için çok sayıda enzimlerin aktivitelerini karşılaştırmak için kullanılabilir. RBB boya salma tahlili karakterizasyonu ve protein antimikrobik maddelerin tespitine ek olarak, polisakaritler karşı aktivitesi olan enzimler için yardımcı bildirmiştir. Pettersson ve Eriksson selüloz, ksilan, manan ve pusula amorf, RBB-boyanmış polisakarid boncuklar kullanılarak endoglycanase aktivitesi tespit etmek için bir deney rapor17'sinde. Bu bulgular, bir genleşme Bacillus thuringiensis Bt-107 tarafından üretilen kitinaz enzimlerin saptanması için hassas bir yöntem RBB 18 ile etiketlenmiş kolloidal kitin kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ve diğer çalışmalardan, RBB-boyanmış substratlar Ticari kaynaklar keratin, amilopektin, amiloz, glikojen, Laminarin, D-ksilan, azo-arpa glukan ve nişasta karşı da dahil olmak üzere glikolitik aktivitesi, saptanmasında kullanım için ortaya çıkmıştır.

Bu çalışmada, kolorimetrik bir sonuç elde etmek için gereken RBB-etiketli substrat ve enzim hacmini azaltır, bir mikroplaka formatında boya salım deneyinde yararını göstermektedir. Şekil 4 ve Şekil 5 'de gösterildiği üzere, mikro boya salma tahlili enzimatik etkinlik algılaması için mikroslayd difüzyon deneyi daha düşük bir belirleme sınırına içerir. yorumlama hızlı kullanımı ile ilgili olarak, emeğin korunması ve kolaylığı ile, mikrofonroslide difüzyon deneyi, antimikrobiyal aktivitenin varlığı hem de alt baş protein izolasyon ve arıtma aşamalarında antimikrobiyal proteinin varlığının gösterilmesi için başlangıç, yüksek verimli taramalara bir fayda sağlar. Bu iki testin kombinasyonu yeni protein antimikrobik ilk tarama ve son karakterizasyonu birbirini tamamlayan

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim. MITRE Corporation, birden federal olarak finanse edilen araştırma ve geliştirme merkezleri (FFRDCs) faaliyet gösteren bir değil, kar amacı gütmeyen bir şirkettir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, MITRE İnovasyon Programı (Proje 25MSR621-CA) aracılığıyla The MITRE Corporation tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D. ve Caroline Gary'ye bu çalışmaya verdikleri destek ve incelemeleri için teşekkür eder.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Düşük buharlaşma kapaklı 48 oyuklu düz tabanlı mikroplakaBecton Dickinson3078
96 kuyulu düz tabanlı mikroplaka (Costar 3595)Corning, Inc.3595
agarozFisher ScientificBP162-100
&alfa;-kimotripsinMP Biyomedikaller215227205
Bacillus subtilis 168Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu23857
C1000 Dokunmatik Termal DöngüleyiciBio-Rad
mantar deliciHumboldtH-9661
lizozimSigma-AldrichL6876-1G
McFarland eşdeğerlik standardı (2.0)Fisher ScientificR20412
mikro slaytlarFisher Scientific22-38-103
besin suyuFisher ScientificS25959B
Bacillus subtilis peptidoglikan 168Sigma-Aldrich69554-10MG-F
fosfat tamponlu salin (1x)TeknovaP0200
Pierce BCA Protein Test KitiYaşam Teknolojileri23227
Synergy HT mikroplaka spektrofotometresiBioTek Instruments, Inc.
Remazol parlak mavi R boya (RBB)Sigma-AldrichR8001
Salmonella enterica subsp. entericaAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu10708
sodyum azidFisher ScientificS227-100
sodyum hidroksit (NaOH)Fisher ScientificS318-500
Titre Üstleri önceden kesilmiş yapışkan polietilen filmÇeşitlendirilmiş BiyoteknolojiT-TOPS-50
UltraPure damıtılmış suInvitrogen10977-015
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıComments
Solution
agaroz çözeltisi
50 ml PBS
0.25 g agaroz		Erimiş PBS/agaroz çözeltisine %10 sodyum azid ekleyin
Besin suyu ortamı
4 g besin suyu
500 ml Tip I su
250 mM sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi
1 g NaOH
99 ml Tip I su
200 mM Remazol parlak mavi R boya (RBB)
1,25 g RBB
98,75 ml 250 mM NaOH çözeltisi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anand, T. P., et al. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).
  2. Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).
  3. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
  4. Riley, M. A., Gordon, D. M. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).
  5. Tenover, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 119, S3-S10 (2006).
  6. Farris, M. H., Steinberg, A. D. Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete. Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).
  7. Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 61, 2811(1995).
  8. Srivastava, K. K., Siddique, I. H. Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes. Infect Immun. 7, 700-703 (1973).
  9. Heilmann, H. D. On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).
  10. Schumann, P. Taxonomy of Prokaryotes. Rainey, F., Oren, A. 38, Academic Press. (2011).
  11. Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).
  12. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).
  13. Osserman, E. F., Lawlor, D. P. Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. J Exp Med. 124, 921-952 (1966).
  14. Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).
  15. Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate. Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).
  16. Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).
  17. Pettersson, B., Eriksson, K. E. A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides. Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).
  18. Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases. J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AntimicrobialsMicroslide Diffusion AssayDye Release AssayEnzymatic ActivityAntimicrobial EnzymeBacterial SubstrateRemazol Brilliant BlueProtein ConcentrationThermal ConditionsAbsorbance Measurement

Related Articles