Yöntem makalesi

Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması

17.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53822

⸱

3 Haziran 2016

 , 
1Department of Medicine 3, Rheumatology and Immunology, Universitätsklinikum Erlangen, 2Nikolaus Fiebiger Center of Molecular Medicine, Universitätsklinikum Erlangen

Bu makalede

Özet

Yağ dokusu (AT) tüm vücut homeostazını etkileyebilir, bu nedenle adiposit farklılaşması ve fonksiyonunun moleküler mekanizmalarını anlamak önemlidir. İndüklenmiş adiposit apoptozu için bir model olarak adiposit homeostazı, farklılaşması ve hipoksi maruziyetini analiz ederek bu süreçlere yeni bakış açıları kazandırmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Yağ dokusunun (AT) endokrin bir organ olduğu düşünülürse tüm vücut metabolizmasını etkileyebilir. Aşırı enerji depolanması, adipositlerin düzensizliğine yol açar ve bu da adipokinlerin anormal salgılanmasına neden olarak obezite, dislipidemi, hiperglisemi, hiperinsülinemi, insülin direnci ve tip 2 diyabet gibi metabolik sendromları tetikler. Bu nedenle, adiposit disregülasyonunun arkasındaki moleküler mekanizmaların araştırılması, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Protokolümüz, yetişkin farelerde adiposit apoptozu ile ilişkili olan AT'nin hipoksik koşullarından etkilenen moleküler mekanizmayı değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu protokol, hipoksik hücrelerin veya HIF-1α proteininin boyanması yoluyla tespit edilen, hipoksi maruziyeti sırasında adiposit farklılaşması, proliferasyonu ve apoptozun histolojik analizinin yanı sıra gen ekspresyonu profillemesi yoluyla AT'nin in vivo olarak nasıl analiz edileceğini açıklar. Ayrıca, adiposit farklılaşmasının ve çeşitli uyaranlara verdiği yanıtların in vitro analizi, metabolik sendromlara yol açan olası adiposit disfonksiyonunun arkasındaki moleküler yolların karakterizasyonunu tamamlar.

Giriş

Dünya Sağlık Örgütü 2014 raporuna göre, dünyanın yetişkin nüfusunun% 39 aşırı kilolu ve% 13 1 obez olduğunu. Yakın gelecekte, kilolu insanların yaşlı nüfusun önemli bir bölümünü oluşturacaktır. Obezite ve yaşlanma önemli bir özellik morbidite ve mortalite 2 ile ilgili olarak yağ düzensizliği olduğunu. Adipokinler, adipoz dokuda (AT) tarafından salgılanan proteinler, obezite gibi metabolik sendromlar tetikleyebilir ve 2 diyabetin 3 yazabilirsiniz. Metabolik hastalıklar çoğunlukla genişleme 4 AT sonuçlanır adipositlerin lipid damlacıkları aşırı enerji depolama, kaynaklanır. Bu nedenle kontrol etmek fırsatları bulmak için nedenleri ve AT genişleme moleküler mekanizmaları belirlemek için ilgi çekicidir.

Aşırı beslenme iki olay tarafından düzenlenir AT genişleme yol açar: aşırı enerji depolama adipositlerin lipid damlacıkları halinde, bir süreçAyrıca, adiposit hiperplazisi 5 olarak bilinen (adiposit boyutunda bir artış) ve artan adipogenesis, hipertrofiye neden olur. Adipogenesis adipositlere multipotent mezenkimal kök hücreler (MSC), farklılaşma, bir işlemdir. Birincisi, MKH taahhüt aşamasında preadipositlerden dönüşür. İkincisi, Preadipositler daha olgun ve işlevsel adipositlerin 6 özelliklerini elde etmek için ayırt. Çeşitli transkripsiyon faktörleri, örneğin çinko parmak protein 423 (Zfp423) ve erken B hücre faktör 1 (Ebf1) halinde preadiposit tespiti için ana düzenleyici olarak tanımlanmıştır. Zfp423 erken bağlılık indükler ise, Ebf1 adiposit progenitörlerin 6 üretimi için gereklidir. Terminal farklılaşma sıkı peroksizom proliferatör ile aktive olan reseptör γ (PPARy) esas transkripsiyon faktörü 7, burada bir transkripsiyon kaskadı ile kontrol edilmektedir. Bundan başka önemli transkripsiyon faktörleri (Cı CCAAT / güçlendirici bağlayıcı protein olan/ EBP) ailesi üyeleri (C / EBPα C / EBPβ ve C / EBPδ) Kruppel benzeri faktör (KLFs) cAMP karşılık elemanı bağlama proteini (CREB) ve erken gelişme tepkisi 20 (Krox20) 6.

Son zamanlarda, aktive edici protein-1 (AP-1) Aile adiposit farklılaşması işlemi 8,9 rol oynadığı gösterilmiştir. AP-1 Aile Fos, Haz ve / veya aktive edici transkripsiyon faktörü (ATF) üyeden oluşan bir dimerik protein kompleksi ile oluşturulur. Fos-ilgili bir antijen 1 ve 2 (Fra-1 ve Fra-2) adiposit farklılaşmasını regüle edebilirler. Fra-1 Fra-2 kontrol adiposit devir 9 ise, / EBPα 8 C inhibe adiposit farklılaşmasını bozar. Fra-2, böylece sadece adiposit farklılaşması sırasında PPARγ2 ifadesini bastırmak yoluyla adiposit sayısını azaltır, aynı zamanda hipoksi-indüklenebilir faktör (HIFs) ifade doğrudan baskı yoluyla adiposit apoptoz azalır. HIF aile HETE olduğunuHIF-1 a, 2a, HIF-HIF-1 p oluşan rodimeric transkripsiyon faktörü kompleksi. Heterodimerler bir oksijen duyarlı HIF-α protein (HIF-1α HIF-2α) ve oksijen duyarsız HIF-1β alt-biriminin 10 oluşur. Normoxia sırasında, HIF-α proteinler poli ubiquitinylated ve nihayet proteazomlar 11 tarafından yıkılırlar. genleşme sırasında meydana gelen hipoksik koşullar altında HIF-α proteinler artık hidroksillenmiş vardır. Bu nedenle yapısal olarak ifade HIF-1 p ile stabilize ve form dimerleri olur. HIF yanıt elemanları ile kontrol genlerin transkripsiyonel aktivasyon anjiyojenez, metabolizma ve enflamasyon 12 düzenlenmesi ile ilgili. Gerçekten de, HIF-1α, glukoz tolerans indükte enerji sarfiyatını ve lipit çevresel kullanımı engellenmesi, hem de tarafından leptin seviyesi ve HFD kaynaklı hepatik steatoz 13 arttırarak disfonksiyonu teşvik eder. Ayrıca, HIF-1α adipocy düzenlerte apoptoz, in vivo ve in vitro 9.

Mevcut protokol erişkin farelerde adiposit homeostazının moleküler özelliklerini çözülmeye durumu AT çalışmak için yöntemleri açıklar. Bu apoptoz, çoğalması ve in vivo ve in vitro olarak, adipositlerin farklılaşmasının hipoksi ile kontrol edilebilir gösterir. Bunu yapmak için, Fabp4-CreERT fareler 9 Fra-2 floxed alelleri taşıyan farelerin geçerek oluşturulan Fra-2'nin adiposit belirli bir silinen fareler kullanır. Fabp4-Cre ERT fareler kullanılarak, silme adiposit tamoksifen enjeksiyon 14 belirli ve indüklenebilir. Yetişkin modeli için, tamoksifen periton içine enjeksiyonlarla 6 haftalıkken itibaren 5 ardışık gün boyunca gerçekleştirilir. Analiz yapılmadan önce Böylece, fareler 6 hafta boyunca normal bir diyet veya yüksek yağ içeren bir diyete tabi tutulur. Bu çalışmada kullanılan fare erkek gibi östrojenler gibi kadınlık hormonları, önlemek için bir C57BL6 arka dayanmaktadırVücut yağ dağılımı 15 düzenleyen gösterilmiştir. Başka genetik arka plan kullanarak da lipid yönetiminde 16 suş ile ilgili farklılıklara, metabolik fenotip değiştirebilir.

Bu protokol histoloji kullanarak hipoksi altında AT nasıl analiz ve immünohistokimyasal ve profil analizleri geni kullanılarak in vivo adiposit apoptoz, çoğalmasını ve farklılaşmasını ölçmek için nasıl gösterir. Çalışma hipoksi maruz kalma değişmiş birincil adiposit farklılaşması ve apoptoz nasıl analiz edileceğini gösteren in vitro deneyler ile tamamlanmıştır.

Protokol

ETİK TABLOSU: Hayvanlar Alman Hayvan Refahı Yasası yönergeleri izleyerek standart şartlarda muhafaza edilir. Hayvanlar, standart bir diyet ve su ad libitum beslendi ve 12 saat gün / gece döngüsü ile tutulur. hayvanlarla Tüm deneyler yerel etik komitesi tarafından yetkilidir.

Yetişkin Erkeklerde Adiposit Homoestaz Vivo Analizi 1.

  1. (: 25 g fare içine 1.5 mg enjekte örneğin) daha sonra 60 mg / intra-peritoneal katı pimonidazol hidroklorür kg vücut ağırlığı enjekte ilk farelerin vücut ağırlığını belirlemek, in vivo hipoksi ölçmek için. Pimonidazol proteinler, peptitler ve amino asitler tiol grupları ile ilave maddelerin oluşturduğu ve spesifik bir antikor ile tespit edilir etkili hipoksik markör vardır.
  2. Fareler Kurban ve perigonadal yağ yastıkları (Şekil 1) çıkartın.
    1. 45 dakika enjeksiyonundan sonra, CO 2 boğulma ve sonraki servikal dislokasyon ile fareler kurban.
    2. (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) farelerin uzuvları sıkıştırmak ve periton boşluğu açmak. Sol ve periton boşluğuna içinde sağ perigonadal (epididimal) yağ yastığı çıkarın.
      Not: Şekil 1 'de gösterildiği gibi, yağ yastığı periton broşürleri ile epididimis bağlıdır (perigonadal yağ pedleri oklar ile belirtilmiştir).
    3. yağ yastığı gelen gonadal dokuların kaldırmak için özen gösterin. yağ yastığı ağırlığı (g) vücut ağırlığı (g) başına: oranını hesaplamak için yağ yastığı ağırlıkları belirler.

figure-protocol-1
Şekil 1: farelerin peritonal boşluğuna perigonadal yağ tamponlar yer. kurban edildikten sonra yetişkin farelerde perigonadal yağ lokalizasyonu resmi. Perigonadal yağ yastıkları oklarla gösterilir. V için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu iew.

  1. kantitatif gen tanımlama profili derlemek için, RNA izole etmek için bir perigonadal yağ yastığı kullanın. Not: Doku işlenene kadar -80 ° C'de ya da sıvı nitrojen içinde RNA stabilizasyonu çözeltisi saklayın doku örnekleri alındı.
    1. yağ yastığı homojenize etmek, guanidin izotiosiyanat ve fenol 1 ml tek fazlı çözeltisine yağ yastığı ekleyin. (30 sn duraklama, 2 kez 20 sn) 6500 rpm'de bir homojenleştiricide doku ezmek için, seramik boncuklar (1.4 mm) ihtiva eden tüpler kullanın.
    2. (Chomczynski ve Sacchi 17 tarafından tek adımlı yöntem) aşağıdaki gibi RNA izole.
      1. 5 dakika süreyle oda sıcaklığında santrifüj 5 dakika için 12,000 x g boyunca inkübe 15 saniye boyunca çalkalanır, fazlar ayrıldı mikrosantrifüj tüpüne homojenize yağ yastığı transferi, 0.2 ml hacim kloroform ekleyin. Bir yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine RNA içeren üst akıcı faz (yaklaşık 400 ul), aktarın. dahil etmeyin DNA-ihtivaing interfaz veya protein içeren fenol aşaması.
      2. (-20 ° C sıcaklıkta gece boyunca inkübe etmek de mümkündür) karıştırmak ve 4 ° C'de 15 dakika süreyle inkübe edilir, RNA çökeltilmesi izopropanol 1 hacim ekleyin. 10 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin. dikkatlice izopropanol süpernatantı. 10 dakika için 12,000 x g'de santrifüj adımları ile% 75 etanol ile iki kez yıkanır.
      3. Oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca çökelen RNA kurutulduktan sonra 50 ul içinde çözülür H2O (RNaz içermeyen). Bunu kolaylaştırmak için, 65 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin.
        Not: -80 ° C'de veya uzun süreli saklama için sıvı nitrojen içinde% 75 etanol ile RNA tutun.
      4. (Optimum bölüm 1.8 ve 2.2 arasında) bir 260/280 RNA hazırlıkları ölçmek ve A 260 ile konsantrasyonunu hesaplamak:
        figure-protocol-2
    3. DNA kontaminasyonu önlemek için, RNA hazırlık 1 mikrogram sindirmek10 ul bir hacim içinde, 37 ° C 'de 30 dakika süre ile 1 U DNase I. 10 dakika boyunca 65 ° C'de etkisiz hale getirirler.
      Not: Bu adım isteğe bağlıdır.
    4. kantitatif PCR uygulama için uygun olan, tek dallı cDNA oluşturmak için ters transkriptaz reaksiyonu için 1 ug RNA, RNA hazırlama 10 ul kullanın. Bileşenleri ve miktarları Tablo 1 'de listelenmiştir.
    5. kantitatif real-time PCR reaksiyonu için bir PCR Master Mix kullanın. Bütün yağ yastığı metabolik değişiklikleri belirlemek için, AT homeostazı (Tablo 2) ve Tablo 3'te listelenen PCR koşullarına yer alan genlerin spesifik primerler kullanmak.
    6. Real-time PCR veri analizi.
      1. Taban çizgisi (Şekil 2), floresan sinyalleri herhangi bir değişiklik yoktur 1 15 normal döngüsü tanımlayın. Gerçek zamanlı PCR programı ile sonuçlanan, taban floresans ve dahili referans boyasına ROX belirli bir floresan sinyalleri normalleştirirprimerler ile spesifik sinyallerin büyüklüğü, ö Rn (ΔRn).
      2. amplifikasyon eğrisinin üstel faz içinde eşik ayarlayın. kesişim eşik döngüsü (Ct) tanımlar. CT değeri dayanarak, bağıl ifade (ACt) ve katlık değişime (ΔΔCt) hesaplamak:
        figure-protocol-3
        figure-protocol-4
Bileşen Cilt ul / reaksiyon
10x RT tampon 2.0
25x dNTP Mix (100 mM) 0.8
10x RT Rastgele Astarlar 2.0
MultiScribe Ters Transkriptaz 1.0
Nükleaz içermeyen H 2 O 4.2
1 ugRNA 10
Toplam başına reaksiyonu 20

Tablo 1: Tek-şeritli cDNA oluşturmak için ters transkriptaz reaksiyonu için, ilgili hacim bileşenleri.

Resmi tam adı sembol Sıra 3 '-> 5'
ileriye Geri
adipogenesis Delta-1 gibi homolog (pref-1) Dlk1 GACACTCGAAGCTCA
CCTGG 		GGAAGGCTGGGACGG
GAAAT
Erken B hücre faktörü 1 Ebf1 CCACCATCGACTACGG
CTTC 		TCCTGGTTGTTGTGGGG
CATC
Çinko parmak proteini 423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA
CGTA 		GGCGACGTGGATCTGA
UÇUŞ KONTROL KULESİ
Yağ asidi bağlayıcı protein 4 (Ek 2) Fabp4 TCACCTGGAAGACAGCT
CCTC 		AAGCCCACTCCCACTTC
TTTC
CCAAT / güçlendirici bağlama proteini (C / EBP), alfa Cebpa AAGAGCCGCGACA
AGGC 		GTCAGCTCCAGCACCT
tgtg
CCAAT / güçlendirici bağlama proteini (C / EBP), beta Cebpb TTTCGGGACTTGATGC
AATC 		CCGCAGGAACATCTTT
AAGG
bağlayıcı protein 1 cAMP karşılık elemanı Creb1 ACTCAGCCGGGTACT
ACCAT 		TTGCTGCCTCCCTGTT
CTTC
CCAAT / güçlendirici bağlama proteini (C / EBP), ö Cebpd CAGCGCCTACATTGAC
TCCA 		GTTGAAGAGGTCGGCG
AAGA
Kruppel benzeri faktör 4 Klf4 GCAGTCACAAGTCCCC
TCTC 		TAGTCACAAGTGTGGG
TGGC
Erken büyüme yanıtı 2 (Krox20) Egr2 AGGCGGTAGACAAAATC
CCAG 		GATACGGGAGATCCAG
GGGT
Peroksizom proliferatör ile aktive edilen reseptör gama Pparg AGAGGTCCACAGAGCTG
ATTC 		GATGCACTGCCTATGAGC
ACTT
lipogenez Asetil-Koenzim A karboksilaz a Acaca TGGGGACCTTGTCTTCA
tcat 		ATGGGCGGAATGGTCTC
TTTC
Yağ asidi sentezi FASN ACATCCTAGGCATCC
GAGA 		CCGAGTTGAGCTGGGT
Tagg
Stearoyl-Koenzim A 1 desatüraz SCD1 CGGGATTGAATGTTCTTG
TCGT 		TTCTTGCGATACACTCTG
GTGC
lipoliz Patatin gibi fosfolipaz alanı containing 2 Pnpla2 AAGGACCTGATGACCA
CCCT 		CCAACAAGCGGATGGT
Gaag
Yağ asidi alımı Lipoprotein lipaz LPL GTATCGGGCCCAGCAA
CATTATCC 		GCCTTGCTGGGGTTTTC
TTCATTC
CD36 antijeni CD36 GTCTTCCCAATAAGCATGT
CTCC 		ATGGGCTGTGATCGGA
ACTG
hipoksi Hipoksi indüklenebilir faktör 1, alfa alt birimi Hif1a CCTGCACTGAATCAAGAG
GTGC 		CCATCAGAAGGACTTGCT
GGCT
(Olarak da bilinir: HIF-2alpha) Endotel PAS domain proteini 1 Epas1 CAAGCTGAAGCTAAAG
CGGC 		TTGGGTGAATTCATCG
GGGG
Von Hippel-Lindau tümör baskılayıcı VHL ACCGAGGTCATCTTTG
GTGC'nin 		TTCCGCACACTTGGGT
AGTC
(Olarak da bilinir: HIF-1 beta) aril hidrokarbon reseptör nükleer translocator Arnt TGGGTCATCTTCTCGC
GGTT 		TGTCCTATCTGAGCAT
CGTG

Tablo 2: adiposit homeostazı analiz etmek için kullanılan ilgili primerlerin dizisi ile geninden oluşan liste.

adım Sıcaklık (° C) Süre (dk: sn)
Polimeraz aktivasyon Bekle 95 10:00
PCR 40 döngü Denaturize 95 00:15
Tavlama / Uzatma 60 01:00
erime eğrisinin 60-95 0.5 ° C / sn

Tablo 3: Gerçek zamanlı PCR koşulları.

figure-protocol-5
Şekil 2:. Gerçek zamanlı PCR eğrisinin özellikleri bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. adiposit homeostazındaki histolojik analizi gerçekleştirmek için, ikinci perigonadal yağ yastığı kullanın. doku ayrılacak etmeyin!
    1. % 3.7 olarak parafin embed gecede PBS tamponlu formaldehit, yağ yastığı Fix (başka yerde 18 açıklandığı gibi talimatları izleyin) ve 2-5 mikron kalınlığında kesitler (maksimum 5 mikron) içine gömülü doku kesti.
    2. hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyanarak parlak alan mikroskobu alanda ve adiposit boyutu başına adipositlerin sayısını belirler:
      1. ksilen içinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkanması ve% 100 etanol içinde 2 dakika ve% 96 etanol içinde 2 dakika süreyle 2 kez bölüm 2 kez rehidrate ile Deparaffinize bölümleri. Son olarak, 5 dakika için damıtılmış H2O bölümü yıkayın.
      2. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile, damıtılmış H2O ile 5 ve 5 dakika için H2O yıkama: hematoksilin ile Leke, 1 seyreltilmiştir. Eozin çözeltisi ile Leke 30 sn (20 mi,% 5 Eosin Y / 210 mL kadar H2O / 25 ul saf asetik asit damıtılmış) ve 5 dakika boyunca, H2O ile tekrar yıkanır.
      3. 5 dakika boyunca 2 dakika, ve ksilen için 3 kez% 96 etanol ve% 100 etanol 2 kez her kullanılarak bölümleri kurutmak. susuz montaj ajanı ile bölümleri monte edin.
      4. parlak alan mikroskobu altında bölümleri değerlendirin. ImageJ 1.48v 19 adiposit analiz etmek için nasıl tipik bir örneği Şekil l'de gösterilmiştir. 3: alan başına hücreleri (2 um) sayısı, hücre alanı (X 10 3 um 2 ), hücre boyutu (um).
        1. ImageJ 1.48v ile bölümün resmi açın. Görüntünün parametreleri yerine uzunluğunda bir birimin piksel olarak belirtilir varsa, ölçeğini ayarlamak.
        2. Araç çubuğundaki * Düz çizgi * seçin ve ölçek çubuğuna referans bilinen bir mesafeye hattı ayarlayın. Analiz git -> Set Ölçeği hattının mesafe piksel cinsinden gösterilir;. bilinen bir mesafe ve uzunluk ünitesi, örneğin, um ekleyin. OK ile onaylayın. resmin boyutunu ve parametrelerin analizi belirli bir uzunluk birimi belirtilmiştir.
        3. adipositlerin parametrelerini belirlemek için, eşik ayarlayın. Görüntü git -> ayarlama -> Eşik Eşik penceresini açmak için. Aşağıdaki ayarları seçin: Eşik yöntemi: Varsayılan; Eşik rengi: B & W, Renk alanı: HSB. resim artık siyah ve beyaz görüntülenir. AyarlamakParlaklık beyaz adipositlerden temizlemek ve Şekil l'de olduğu gibi, siyah arası boşlukları kapatmak için. 3b.
        4. Araç çubuğundaki * çok noktalı * seçim ile mikron 2 (Şekil 3e) başına adiposit sayısını ve sayım her bir hücreyi işaretleyin.
        5. Adiposit boyutunu belirlemek için, araç çubuğundaki tekrar * Düz çizgi * seçmek ve bir adiposit (Şekil 3c) çapını çizin. Analiz git -> Ölçü ve yeni bir pencere açılacaktır, mikron çap uzunluğunda.
        6. Adiposit alanı belirlemek için, * Değnek (izleme) aracını seçin * ve adiposit içini tıklatın. Adiposit iç duvar kırmızı (Şekil 3d) seçilmiştir. Analiz git -> Ölçü ve yeni bir pencere açılacaktır, mikron 2 Bu adiposit alana sahip.
    3. immunohist içinaşağıdaki gibi ochemistry, antikor ve TdT aracılı dUTP-biotin çentik uç işaretleme (TÜNEL) boyama bölümü hazırlamak:
      1. ksilen içinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkanması ve% 100 etanol içinde 2 dakika ve% 96 etanol içinde 2 dakika süreyle 2 kez bölüm 2 kez rehidrate ile Deparaffinize bölümleri. Son olarak, damıtılmış H2O bölümü yıkama
      2. Antijen geri alımı için, çalışma çözeltisi Proteinaz K ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca doku kesiti sindirimi (10 mM Tris / HCI, pH 7,4-8 20 ug / ml) ve PBS ile yıkayın.
    4. Islak odalarında antikor boyama gerçekleştirin:
      1. endojenez peroksidazı bloke etmek için, daha sonra, PBS içinde 5 dakika için 2 defa yıkama ile, 10 dakika boyunca PBS içinde% 3 hidrojen peroksit kullanır. Antikorların Spesifik olmayan bağlanma bloke etmek için, PBS içinde% 10 serum kullanımı. Bu durumda keçi, ikincil antikor konak serum kullanın.
      2. boyama için, apoptoz, çoğalması ve hipoksi tespiti için antikorlar (kullanmak Tablo 4). PBS /% 10 keçi serumu antikorlar seyreltilir. gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. PBS içinde 5 dakika boyunca bölümlerinin 3 kere yıkayın.
      3. Sinyal Tablo 5 'de gösterildiği gibi, hipoksi tespiti için. Seyreltme ile biyotinlenmiş sekonder antikor kullanımı, ikincil antikor olarak HRP ile konjüge edilmiş tavşan anti-FITC kullanımının arttırılması için. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. bölümlerinin 2 kez PBS ile 5 dk yıkayınız.
        Not:) FITC MAb1 ile hipoksi boyama için, adım 1.4.4.4 atlayın) ve adım 1.4.4.5 ile devam edin.
      4. Her bir slayt, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca peroksidaz lH biyotinlenmiş 50 ul, 50 ul avidin çözeltisi (bu yöntem ayrıca şu şekilde avidin / biyotin, ABC kompleksi formülasyonu da adlandırılır) önceden inkübe edilir ve akabinde diğer bir 45 dakika boyunca bölümlere ekleyin. PBS ile 5 dakika süreyle 2 kez yıkayın.
      5. boyama (5 ile 10 dakika arası) daha yoğun hale gelene kadar, peroksidaz substrat çözeltisi bölümleri inkübe edin. damıtılmış ile 5 dakika yıkayınH2O
      6. Oda sıcaklığında 10 dakika için damıtılmış H2O ile 5 ve 5 dakika boyunca, H2O yıkama: counterstaining için hematoksilin ile leke 1 seyreltilmiştir.
      7. 5 dakika boyunca 2 dakika, ve ksilen için% 96 etanol ve% 100 etanol içinde 3 kez 2 kez her bölümleri kurutmak. lamelleri ve susuz montaj madde ile bölümleri mühür. parlak alan mikroskobu altında bölümleri değerlendirin.
    5. TÜNEL testi ile apoptozu belirlemek ve üreticinin talimatları uygulayın:
      1. 450 ul etiket çözeltisi içine 50 ul enzim çözeltisi ekleyin. Daha sonra histolojik bölümlerde 50 ul TÜNEL tepkime karışımıyla ve karanlık bir nemli bir atmosferde 37 ° C'de 60 dakika inkübe edilir. 5 dakika boyunca PBS ile bölümleri 3 kez yıkayın ve floresan counterstaining DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) dahil olmak üzere, orta montaj monte edilir.
      2. 100 kat Magnificant bir floresan mikroskobu altında bölümünü değerlendirmek iyon. Floresein ölçümü için 488 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu kullanmak 515-565 nm (yeşil lazer) ile tespit edilmesi; DAPI yaklaşık 360 nm'de heyecanlandıran ve DNA (mavi lazer) bağlı iken yaklaşık 460 nm'de yayar.
      3. DAPI ve Floresein bindirmeleri ölçmek:
        figure-protocol-6

figure-protocol-7
Şekil 3:. Yağ yastığı bölümlerde adiposit özelliklerini incelenmesi parlak alan mikroskobu ile yüksek yağlı diyet (YYD) veya normal diyet (ND) ile tedavi edilen erkek farelerin perigonadal yağ yastığı Bölüm resimlerini (a); ImageJ 1.48v ile miktarı ölçülür, bölge (d) ve aa 2 (E) her adiposit hücre sayısı eşik siyah ve (b), beyaz ve adiposit boyutu (Cı uzunluk) olarak ayarlanır.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

stok konsantrasyonu seyreltme
apoptoz Yarık kaspaz-3 (Asp175) (5A1E) Tavşan mAb 1: 2000
Çoğalma Saflaştırılmış fare anti-insan Ki-67 klon B56 (RUO) 01:50
hipoksi HIF-1 a antikor 1: 100
FITC MAb1 1: 100

Tablo 4: bölümlerin immünohistolojik boyama için kullanılan ilgili seyreltme antikorlar.

Antikor seyreltme
biyotinlenmiş antifare IgG (H + L) 1: 200
biyotinile edilmiş anti-fare IgG (H + L) 1: 200
HRP tavşan anti-FITC konjugatları 1: 100

Tablo 5: Immünohistolojik boyama için kullanılan seyreltme ile ikincil antikorlar.

Adiposit Homoestaz Vitro Analizi 2. Hipoksi etkilenerek

  1. fareler Kurban ve deri altı yağ dokusu çıkarın.
    1. CO 2 boğulma ve sonraki servikal dislokasyon ile fareler kurban.
    2. Şekil 4'te gösterildiği gibi. Farelerin uzuvları aşağı pin üst bacak, bel ve zayıf cildi ayırın ve Şekil 4'te olduğu gibi iğne ile aşağı pin. Sonra dibinde posterior bulunduğu deri altı yağ dokusu, kaldırmak Şekil 4'te gösterildiği gibi, (kasık lenf düğümleri Çevre arka ayakları, sayısı: deri altı yağ yastığıOklarla gösterilen s; Sağ: okla gösterilen kasık lenf nodu).

figure-protocol-8
Şekil 4: deri altı yağ yastıkları yer. deri altı yağ yastığı resmi; sol oklar deri altı yağ yastığı gösterir ve sağ ok kasık lenf düğümü gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Yalıtmak adipoz kaynaklı kök hücreler (ADSC) önceden 20 nitelendirdi.
  2. Tohum ADSC Eagle Modifiye edilmiş Dulbecco 4000 hücre / cm2 orta Ham F-12,% 10, normal dana serumu,% 1 penisilin / streptomisin,% 0.5 amfoterisin B, 16 uM biyotin, 18 uM pantotenik asit ve 100 uM askorbik asit ile takviye edilmiş ve 70 80 izdiham kültür büyümekKültür 4 ila 6 gün sonra ulaşılır%.
  3. Adipogenic Farklılaşma neden olur.
    1. tripsin işlemiyle yüzeyinden yapışık ADSC çıkarın.
      1. (Hücre yüzeyi ayrılana kadar), orta çıkarın PBS ile yıkayın ve% 0.025 tripsin solüsyonu ilave 2 dakika boyunca (37 ° C'ye ön-ısıtılmış). Hemen orta eklemek ve hücreleri yıkayın.
    2. Bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
      1. Neubauer odasının orta alanda cam kapağını takın. hücre süspansiyonu 1:10 seyreltilir ve hücre süspansiyonu seyreltildi 10 ul odası yükleyin. köşelerinde bulunan 4 kareler, 16 küçük kareler oluşan her hücre sayımı. ml başına, hücre sayısını hesaplayın:
        figure-protocol-9
    3. (4 ila 6 gün sonra ulaştı) 12-yuvalı kültür plakaları içinde (alanına 2.2'de tarif edildiği gibi) ve yaklaşık 70 ila 80% konfluansa kültürünün yetiştirilmesi Tohum ADSC.
    4. adipoge indükleyin5 ug / ml insülin, 1 uM deksametazon ve kültürler 5 uM 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) ilave edilerek NIC farklılaşma. 2 günde orta yenileyin. Hücreler tamamen 7 gün sonra ayırt edilecektir.
  4. adipogenic farklılaşma, olgun adipositlerin trigliserid lekeleri Oil Red O ile lekeyi analiz etmektir.
    Not: İş davlumbaz altında yapılmalıdır!
    1. , Orta çıkarın PBS ile hafifçe adipositler yıkama ve 2 ml% 10 formalin ile 60 dakika boyunca hücrelerin tespit.
    2. Yağ Kırmızı O boya solüsyonu hazırlamak damıtılmış 2 parçaları ile kırmızı bir yağ O stok çözeltisi (100 mi% 99 izopropanol, 300 mg kırmızı renkli bir yağ O toz) H2O 3 kısım karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübasyona. 0.2 mikron enjeksiyon filtresi aracılığıyla Oil Red O çalışma çözüm Filtre.
      Not: Çalışma çözeltisi 2 st için stabildir.
    3. Yağ Kırmızı O boyamasıyla için, formalin kaldırma H 2 adiposit yıkama O, 5 dakika için 2 ml% 60 izopropanol ile inkübe izopropanol çıkarın ve 5 dakika boyunca 2 mi, Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisi ekleyin. Su temizlenene kadar musluk suyuyla hücreleri durulayın. ) Noktası 1.4.4.5 olarak hematoksilen ile counterstain.
    4. 100 kat büyütme ile bir faz kontrast mikroskop altında plakaları değerlendirin. adipositlerin lipidler kırmızı görünecektir ve çekirdekler mavi görünecektir.
  5. İsteğe bağlı adım: shRNA ile transfeksiyon ile ilgi gen sustur.
    1. orta değiştirmek ve serum serbest orta ekleyin.
    2. adipositlerin transfeksiyonu için, lipofeksiyon kullanımı. Üreticinin talimatlarını izleyin ve 12 gözlü doku plakaları başına 1 ug shRNA kullanın. lipid-DNA kompleksi ilave edildikten sonra 37 ° C'de 48 saat boyunca adipositleri inkübe edin.
  6. hipoksiye maruz adipositlerin analiz etmek, hipoksik koşullar altında hücreleri korumak için bir hipoksik çalışma istasyonu veya hipoksik inkübatör kullanın. Çalışmanın bağlı olarak, hipoksi c0.5, 1 ya da% 2 oksijen ould.
    1. FITC etiketli Annexin V ve sitometri analizleri daha sonraki akışı ile apoptozu analiz edin.
      1. Bir ilave yumuşak hücre kazıyıcı ile adipositleri toplayın PBS ile yıkayın ve 100 ul Annexin V-bağlama tamponu, 1 x 10 6 hücre ekleme (10 mM Hepes / NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCI, 2.5 mM CaCl2). Üretici tarafından tavsiye Annexin V-FITC miktarını ekleyin ve 15 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin.
      2. Ölçme flow sitometri için, Annexin V bağlayıcı tampon ul 200 ekleyebilir ve nükleer karşıt 1 uM. Yeşil ve mor kanal floresan belirleme. Annexin V + / nükleer karşı-+ hücreleri sekonder nekrotik ve Annexin V + / Nükleer karşıt olarak tanımlanmıştır - hücreleri apoptotik hücre olarak tanımlanmıştır (Şekil 5).
    2. Kantitatif hipoksik koşullar altında homeostazisini belirlemek için adiposit RNA düzeyini analiz edin.
      1. Eklemek1 ml tek fazlı her oyuğa guanidin izotiyosiyanat ve fenol solüsyonu ve 1.3.5.2 kadar) [Chomczynski ve Sacchi 17 tarafından tek adımlı bir yöntem (adım 1.3.2) kullanılarak] RNA izole ve adımları 1.3.2.1 olarak devam) .

figure-protocol-10
Şekil 5: flow sitometri Adiposit apoptoz analizi. V-FITC ve adipositlerin TO-PRO-3 boyama Annexin. FACS Dot arsa sunumları tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Sonuçlar

Bu örneği kullanılarak, in vivo ve in vitro adiposit homeostazı belirleme göstermek Fra-2 fl / FL vahşi tür littermates göre Fabp4-CreERT fareleri. Bizim protokol artan adiposit apoptosis ile belirtildiği gibi hipoksi artarak HIF ifade adiposit disfonksiyonu ile ilişkilidir nasıl tanımlar.

yüksek yağlı diyet Artan adiposit büyüklüğü ve alanı (YYD) uygulanan fareler

Aşırı beslenme, diğer faktörlerin yanı sıra, lipid damlacıkları aşırı enerji depolama kaynaklanan adiposit hipertrofisi ile sonuçlanır. adiposit boyutu ve alan hipertrofisi bir göstergesidir. Normal yağ yastığı Bölümleri (ND; Şekil 6a) ve yüksek yağlı diyet (YYD Şekil 6b) 6 hafta sonra adiposit büyüklüğü ve bölgenin fareler yanı sıra sayımsal açıkça göstermektedir adiposit hipertrofisiHFD tedavi edilen farelerde (Şekil 6c, d) artmış adiposit boyutu ile gösterilir YYD, s.

Yetişkin adipoz dokusu (AT) artan hipoksi Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT fareler artmış HIF-1α seviyesi ve adiposit apoptosise neden olur

AT hipoksi in vivo durumunu belirlemek için, Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT farenin 12 haftalıkken Fra-2 silme işleminden sonra 6 hafta analiz ve vahşi tip littermates ile karşılaştırılmıştır. Pimonidazol intraperitonal etkili hipoksi belirteci olarak farelere tatbik edilir; o toksik olmayan ve AT içine dağıtmak yapabiliyor. In vivo AT hipoksik adipositler immünohistokimyasal antikor boyama (Şekil 7a) tarafından tanımlanır. Bundan başka, farelerin AT artan hipoksik durumu artan HIF-1α pozitif ADIP eşlikHIF-1α ifade seviyeleri ve hedef genlerin 9 miktarının ile teyit edilir immünohistokimyasal boyama Şekil 7B), gösterildiği gibi ocytes. Buna ek olarak, Fra-2 bölümlerin arasında, TÜNEL lekelemesi fl / fl Fabp4-CreERT fare ve kontrol litermatlarının (Şekil 7c) adiposit apoptoz hipoksi ve HIF-1α ifade ile korele artış gösterir.

hipoksi nedenli adiposit apoptoz yoluyla primer adipositler HIF-1α ifade artışı

Başka bir yerde, 20 tarif edilen şekilde in vitro adiposit apoptoz analiz etmek için deri altı yağ pedleri elde adipositler kullanımı. Beklendiği gibi, adipositlerde HIF-1α sentezleme hipoksi (Şekil 8a) 24 saat sonra artmıştır. ayrıca HIF-1α faaliyetleri, HIF hedef RNA düzeylerinin analiz etmekBu Inos (uyarılabilir nitrik oksit sintaz) genler qPCR nicelendirilir. 8b hipoksik koşullar altında HIF-1α artmış ekspresyonu Inos mRNA düzeyleri artan yol açar göstermektedir. Daha önce adipositlerde HIF-1α ekspresyonunda artış adiposit apoptoz ile ilişkilidir artmış in vivo (Şekil 8) 'de gösterilen bu yana, apoptoz da hipoksik koşullar altında Annexin V boyama ile in vitro kültürlerinde ölçülür. İn vivo veriler (Şekil 7) ile uyumlu olarak, artmış bir HIF-1α seviyesi hipoksik koşullar neden olduğu artan adiposit apoptoz ile (Şekil 8b) eşlik eder. Ayrıca, bu hipoksik kaynaklı apoptosisi kanıtlamak için, HIF-bağlıdır; HIF-1α HIF-2α yabani tip veya Fra-2 eksik farelerde elde edilen adipositler RNA müdahalesi ile susturulur. Annexin gösterildiği gibi artan adiposit apoptoz HIF-1α veya HIF-2a susturma tarafından restore Hipoksi sensörü HIF-α adiposit apoptoz düzenleyen kanıtlayan Şekil 8b V boyama.

figure-results-1
Şekil 6: Yüksek yağlı diyet (HFD) farelerde adiposit boyutu ve alan artışı normal diyet (ND) ile beslenen erkek doğal tipte farelerin perigonadal yağ yastığı alınan kesitlerin (A, B), H & E boyama, (a) ya da yüksek. -FAT diyet (HFD), (b) 6 hafta. Barlar 500 mikron temsil etmektedir. (C, d) (b) 6 hafta boyunca ND: (a) ya da YYD ile beslenen doğal tipte farelerin perigonadal yağ pedi adiposit boyutu (c) ve alan (d) sayımsal. n = 10. Veri ± SEM ortalama değerler olarak gösterilmektedir. İstatistiksel analiz Student t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *** P <0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT fareler yetişkin adipositlerde artmış HIF-1α düzeyi ve apoptosis: Şekil 7. Hipoksi (a) ve HIF-1α erkek Fra-2 fl / fl Fabp4-creERT fare ve kontrol litermatlarının erkek, 6 hafta sonra tamoksifen enjeksiyon AT (b) boyama. Büyütme 20X, 40X yerleştirin. Siyah oklar hipoksik alanları ve HIF-1α pozitif hücreler göstermektedir. (C), TÜNEL lekelemesi Fra-2 fl / FL tamoksifen enjeksiyondan 6 hafta sonra Fabp4-CreERT fare ve kontrol litermatlarının. Büyütme 20X, 40X yerleştirin. Siyah oklar TUNEL pozitif hücreler gösterir. Bu rakam Luther et modifiye edilmişark. 9. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 8:. Hipoksi ile birincil adipositlerde artmış HIF-1α ekspresyonu ve adiposit apoptoz hipoksik odalarına yerleştirilir primer adipositler HIF-1α ve HIFs hedef Inos mRNA seviyelerinin, (a) Gerçek zamanlı PCR analizi, belirtilen zaman noktalarında analiz edilmiştir. Izole edilen primer adipositlerde Annexin V FACS lekelenmesi ile apoptozun (b) Niceleme Fra-2 fl / FL SH kontrol veya HIF-1α HIF-2a karşı SH plazmid ile transfekte edilmiş ve hipoksi altına Fabp4-CreERT fareleri ya da vahşi-tipli kontrollerden 24 saat boyunca (% 1 O 2). Bu rakam, Luther ve diğ modifiye edilmiştir. 9. Veri SD İstatistiksel analizler Student t-testi kullanılarak yapıldı ± ortalama değerler olarak gösterilmektedir. * P <0.05 ve ** p <0.01 anlamlı olarak kabul edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Adipositler nedeniyle aşırı enerji depolama tarafından uyarılan adiposit hiperplazisi ve hipertrofisi, ifşa, büyüklüğü, sayısı ve alanı ile fenotipik karakterize aşırı beslenme 5. Yağ asidi düzensizliklerine ve sonraki metabolik sendromların neden bu olaylar aynı zamanda "sağlıklı" yağ genleşme olarak adlandırılır korunmuş metabolizması ile artmış yağ kitlesinin devletler vardır. Örneğin, Kusminski ve ark., 21 büyük yağ genişleme ile fareler bu yağ genleşme mutlaka metabolik sendromlar bağlantılı ve adipositlerin özelliklerini değerlendirmek için dikkatli bir şekilde kararlı olması gerekir değil düşündüren, metabolik sağlıklı kalmasını gösterdi. adipoz dokusu (AT), vücut metabolizmasının düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. AT dislipidemi, ateroskleroz, hiperinsülinemi ve hiperglisemi 3 etkileyebilecek en büyük endokrin organdır. homeostasis ve moleküler m AT değerlendirilmesiBunu düzenleyen echanisms metabolik sistemi bozuklukları daha iyi anlaşılmasını izin verebilir. Bu nedenle, adiposit farklılaşması düzenleyen mekanizmaların açıklığa kavuşturulması, adiposit büyüklüğü ve yağ yastığı kütlesi obezite bozuklukları için yeni tedavi tedavi geliştirmek için yardımcı olacaktır. In vivo ve in vitro yöntemler kullanarak, adiposit farklılaşması ve aktivitesi Gıda ve gen ekspresyonu etkilerin rolünü tespit etmek mümkündür. Bizim protokol glukoz ve insülin metabolik yanıtı 22-24 analiz kadar önemlidir tarafından önerilen adiposit farklılaşması, çoğalması ve apoptoz arasındaki dengeyi belirleyen, AT homeostazı belirlemek.

İfade profil birincil adipositlerdeki adipogenesis, lipojenez, lipoliz, yağ asidi alımı, hipoksi, apoptoz ve çoğalması yer alan genlerin analizleri ve visseral AT adiposit homeostazında ve bunların olası işlev bozukluğu üzerine genel bir bakış elde etmek için yüksek verimli bir yöntemdir.Ilginç adaylardır western blot veya immünohistolojik boyama ile protein seviyesinde analiz edilmelidir. Simetrik olmayan siyanin boyalar kullanarak gerçek zamanlı PCR sistemi ile optimum sonuçlar elde etmek için, 1'den 10 ng arasında değişen cDNA konsantrasyonları ve 50 900 nM arasında değişen optimum astar konsantrasyonları spesifik olmayan amplifikasyon en aza indirmek için test edilmelidir. kritik bileşenleri primerler şunlardır; Her bir çalışma için, erime eğrileri katı özgüllük sağlamak ve primer dimerlerin oluşumunu hariç tutmak için kontrol edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, bunun yerine cDNA'nın H2O ile bir negatif kontrol kullanımı tavsiye edilmektedir. Ayrıca, ticari olarak temin edilebilen simetrik olmayan siyanin boyalar (örneğin, ROX) pasif bir referans boya içeren bir iç referans bir sinyal sağlamak için ana karışımı olarak temin edilmiştir. cDNA sinyali hali-kuyu sinyal dalgalanmaları düzeltmek için ROX sinyallerine veri analizi sırasında normalize edilir. Başka bir nokta, bir goo kurmak için dikkate alınması gerekend qPCR sistemi temizlik geninin seçimdir. Her durum için, birden fazla temizlik genler kullanılır, örneğin, HPRT β-aktin, GAPDH, β-2-Mg veya HSP90.

Hipoksik koşullar ile stabilize HIF proteinler ana sadece adipositler yaşamda kalmasını saptamak düzenleyiciler, aynı zamanda, örneğin glukoz, insülin tolerans ve lipid metabolizması 11,25,26 gibi metabolik değişiklikler vardır. yağ yastığı hipoksik alanlarını tespit etmek için, HIF-1α immünohistokimyasal olarak bölümlerde AT belirlenir. HIF proteinleri hızlı bir şekilde normoksik koşullar altında 5 ila 10 dakika içinde bozulmuş olması nedeniyle, prosedür ve histolojik analiz için yağ yastığı sabitleme sıkı geçen süre önlemek için kontrol edilmelidir. Bu nedenle, sadece HIF boyamasıyla hipoksi sağlamak için, pimonidazol AT hipoksik alanlarının belirlenmesi için kullanılır. Zaten kemik 27'de görüldüğü gibi pimonidazol, dokulara dağıtmak mümkünVe etkin bir şekilde daha da spesifik antikor 28 bağlanarak histolojik bölümlerde tespit edilir, özellikle hipoksik hücrelerde tiol içeren proteinlere bağlanarak hipoksik alanları işaretleyin. Bununla birlikte, diğer belirteçler ve yöntemler hipoksi yol analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, hidroksillenmiş prolinlerin tanır ve proteozomal HIF aracılık etmek için poli-dağılmasını teşvik normoksi altında prolin artıkları hidroksilasyonunu neden prolil hidroksilaz (PHD) enzim, yanı sıra, von Hippel-Lindau (VHL) protein, katılımı bozulma, yolu 29,30 tam bir bakış açısından analiz edilmesi gerekir. Ayrıca, HIFs her yerde tespiti de 31,32 değiştirebilir olabilir protein istikrar ve parçalanmasını belirleyecek.

Ayrıca, TÜNEL lekelemesi ile Ki67 çoğalmayı ve apoptozis histolojik kesitlerin boyamasıyla in vivo olarak belirlenir. Ki67 ve a ile proliferasyon miktarının belirlenmesiAkışkan sitometri analizi ile TÜNEL ya Annexin V boyama ile poptosis da 33 üzerinden gerçekleştirilir. Proliferasyon elbette bu Ki67 pozitif hücrelerin ölçümüyle bahsedilmeyen adiposit hücre döngüsü, analizi gibi teknikler ile ölçülebilir. FACS apoptosis hücre ölümü süreci karşı nekroz düzeylerini belirleyecek Annexin V ve TOP-PR-3 analizleri ile Dahası, TUNEL tarafından apoptoz çalışması tamamlanabilir. Apoptoz AT homeostazı için önemli olan hücre ölümü programının için temel süreçtir. Nitekim, adiposit apoptoz düzensizliği obeziteye katkıda süreçlerde daha önce karıştığı ve 34 Lipodistrofi edilmiştir. Ayrıca, 2011 yılında, Keuper ve ark. Adiposit apoptozis yağ dokusu iltihabı bağlı. Makrofajlar da makrofajlar çekmek preadipositlerin ve adipositler, apoptoza neden olduğunu göstermiştir. makrofaj işe iltihabı, hangi Contr hızlandırırglikoz ve insülin toleransı 35 gibi metabolik sendromlar ibutes. Ancak, adiposit apoptoz kötü okudu fenomen kaynaklı adiposit apoptoz kilo azalmasına neden olabilir hipotezi rağmen, halen devam etmektedir.

Mevcut protokol, in vivo çoğalması, apoptoz ve hipoksi gibi farklı fenomen incelemek için immünohistokimyasal yaklaşımlar kullanır. Bu nedenle, doku kritik bir adımdır% 4 formaldehit ile tespit edildi. Genişletilmiş bir doku tespit süresi antikor olmayan erişilebilir hale epitoplara, değişmesine yol açar. Bunun aksine, kısa bir sabitleme süresi reaktiflere epitop duyarlılığını arttırır. tespitin tavsiye en uygun zaman 24 saattir. Ayrıca, bölümlerin kalınlığının ayrıca epitoplara bağlanan antikorlar etkiler; Optimal kalınlığı 2 um ile 5 arasında bir. 5 um daha kalın kesitler artan bağlama sitelere yalancı pozitif sonuç verecektir. Bunun aksine, sections ince 2'den mikron daha az bağlayıcı siteleri içeren ve olumlu alanlarda iyi tanımlanmış değildir. Bundan başka kritik faktörler epitoplara spesifik bağlanma kalitesini etkileyen antikorun kendisi, kuluçkalama süresi, konsantrasyon ve eşit bir ısı vardır. Bu nedenle, bir antikor konsantrasyon ve inkübasyon zamanı doğrulamak her durum için gereklidir.

Etüdün tamamlanması için, farklı tedaviler, uyarılması ya da ko-kültürler ile uzatılabilir bir in vitro adiposit farklılaşma protokolünü sağlar. Nitro adiposit kültürlerinde kullanılarak, adiposit farklılaşması ve işlevleri kusurları tespit etmek mümkündür. tüm primer hücreler için olduğu gibi, ADSCs ve adipositlerin sağlıklı davranış ve görünüm oldukça önemlidir, güvenilir sonuçlar elde etmek. ayrıntı, sitoplazmik vakuolleşmeye ve / veya dekolmanı birincil yetersiz orta, mikrobiyal kontaminasyonu veya yaşlanmayı gösteren bozulma belirtileri vardırHücreler. Diğer protokoller 36 tarafından tarif edildiği gibi, kemik iliğinden izole mezenkimal kök hücre kullanmak da mümkündür, oysa bu protokol, yağ yastığı dokusundan izole adipositlerin kullanıyor. En son adiposit farklılaşması çok erken aşamada ortaya çıkan ek farklılaşma sorunları yansıtıyor olabilir stromal progenitör hücreler içerir, bu mevcut protokolde cevapsız olabilir. Ayrıca, ADSCs hızla (bir hafta içinde 10 kereden daha fazla) genişletilebilir ve bazı pasajlar sonra uzun süreli kültür ADSCs hala mezenkimal pluripotensini 37,38 saklayın. ADSCs kullanmanın bir diğer avantajı ADSCs basit ve minimal invaziv bir yöntemdir liposuction ile hastalardan hasat edilebilir çünkü kolayca, insana geçiş olabilir.

AT endokrin şekilde birkaç diğer organları etkiler gibi protokol adipokinlerin şekilde genişletilmelidir. leptin, adiponektin, tümör nekroz faktör-α (TNF) a olarak Adipokinler,adipositler tarafından salgılanan nd resistin yağ metabolizması, enerji homeostazisini ve insülin duyarlılığını 39 kontrol ederek metabolik hastalıkların etkilediği bilinmektedir. Bu nedenle, serum ve adiposit secretome analizleri yapılmalıdır. IL-6 gibi, AT fonksiyon bozukluğu, adipokinlerin ve pro-inflamatuar sitokinlerin, durumunda, örneğin karaciğer ve pankreas ve kas fonksiyonunun 4 gibi organların bozulması neden olur. sistemik organ işlev bozukluğu bertaraf etmek için, hayvan modelleri ya da hücre kültürleri uyarılması ve alımını glikoza tepki açısından test edilebilir.

Burada AT ve in vivo adipositlerin temel durumunu analiz etmek için bir protokol sağlar ve in vitro adiposit homeostazı ve işlevsellik moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak için.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarların gibi yazının redaksiyon için veri ve Dr. B. Grötsch hazırlamak için Dr. J. Luther ve K. Ubieta teşekkür ederim. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RNAlater çözeltisiAmbionAM7021RNA stabilizasyon çözeltisi
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiUygulamalı Biyosistemler4368813
SYBR Select Master Mix4472908
Saflaştırılmış Fare Anti-İnsan Ki-67BD Biosciences550609Klonu B56 (RUO)
Saflaştırılmış Fare Anti-İnsan Ki-67 Klonu B56 (RUO)550609Proliferasyon belirteci
FITC Annexin VBioLegend640906
Bölünmüş Kaspaz-3 Tavşan mAbHücre sinyali9664SKlon 5A1E
Bölünmüş Kaspaz-3 (Asp175) (5A1E) Tavşan mAb9664Apoptoz belirteci
Lipofektamin2000 Reaktif Invitrogen11668-027
TO-PRO-3 İyodürT3605Nükleer karşı boya, Monomerik siyanin nükleik asit boyası, Uyarma ve frasl; Emisyon: 642⁄ 661 deniz mili
Mayer' s hemalumMerck109249hematoksilen
pegGOLD TriFastPeqlab30-2030TRIzol, guanidin izotiyosiyanat ve fenolün tek fazlı çözeltisi
Percellys Seramik Kiti 1.4  mm91-PCS-CK14seramik boncuk içeren tüpler (1,4 mm)
Precellys 2491-PCS24homojenizatör
HIF-1 alfa AntikoruPiercePA1-16601
HIF-1 alfa Antikoru, 16H4L13700505Hipoksi marker
In Situ Hücre Ölümü Tespit Kiti, FloreseinRoche11 684 795 001TdT aracılı dUTP-biotin nick end etiketleme (TUNEL) 
EozinSigma318906
DNaz I Çözeltisi (1  birim/&mikro; l)Thermo ScientificEN0525
biyotinile anti fare IgG (H + L)Vektör LaboratuvarlarıBA-9200
biyotinile anti fare IgG (H + L)BA-1000
Vectastain ABC KitiPK-4000
VECTASHIELD DAPIH-1200
ile Montaj Ortamı

Kaynaklar

  1. Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
  2. Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482(2012).
  3. Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
  4. Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008(2013).
  5. Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
  6. Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1(2015).
  7. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
  8. Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
  9. Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
  10. Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
  11. Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
  12. Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
  13. Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
  14. Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
  15. Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
  16. Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
  17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
  18. Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
  19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  20. Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
  21. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
  22. Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747(2013).
  23. Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
  24. de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
  25. Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
  26. Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
  27. Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
  28. Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
  29. Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
  30. Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
  31. Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
  32. Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
  33. Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
  34. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375(2015).
  35. Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
  36. Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
  37. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
  38. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
  39. Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Adiposit DiferansiyasyonuAdiposit ApoptozuHipoksi MaruziyetiHistolojik AnalizGen Ekspresyon ProfillemePimonizol BoyamaHIF-1 AlfaRNA İnterferansıAdipoz DokusuMetabolik Sendrom
Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.