Method Article

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

DOI:

10.3791/53837

⸱

April 8th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünohistokimya, dokulardaki protein lokalizasyonunu ve ekspresyonunu değerlendirmek için güçlü bir laboratuvar tekniğidir. Kantitasyon için mevcut yarı otomatik yöntemler öznelliği ortaya çıkarır ve çoğu zaman tekrarlanamaz sonuçlar yaratır. Burada, multispektral görüntüleme kullanılarak çoğullanmış immünohistokimya ve protein ekspresyonunun objektif kantitasyonu ve ko-lokalizasyonu için yöntemler tanımlanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünohistokimya, dokulardaki protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir klinik ve araştırma laboratuvarı tespit tekniğidir. İmmünohistokimya kullanılarak ekspresyon skorlaması için birçok yarı kantitatif sistem geliştirilmiştir, ancak doğal öznellik sonuçların tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu sınırlar. Ayrıca, nükleer transkripsiyon faktörleri gibi uzamsal olarak örtüşen biyobelirteçlerin araştırılması mevcut immünohistokimya teknikleri ile zordur. Çoğullanmış immünohistokimya ve multispektral görüntülemenin yüksek verimli yöntemlerini kullanarak çoklu proteinlerin eşzamanlı olarak araştırılması için bir sistem geliştirdik ve optimize ettik. Çoğullanmış immünohistokimya, primer antikorların yaban turpu peroksidaz veya alkalen fosfataza konjuge edilmiş sekonder antikorlarla ardışık olarak uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İlgilenilen her bir proteini tespit etmek için farklı kromojenler kullanılır. Lekeli slaytlar otomatik bir slayt tarayıcıya yüklenir ve otomatik görüntü alımı için bir protokol oluşturulur. Bir spektral kitaplık, her birinde tek bir kromojen bulunan bir dizi slaytın boyanmasıyla oluşturulur. Temsili lekeli görüntülerin bir alt kümesi multispektral görüntüleme yazılımına aktarılır ve görüntülerdeki doku bölmeleri tanımlanarak doku tipini ayırt etmek için bir algoritma oluşturulur. Hücre altı bölmeler, hematoksilen karşı boyası kullanılarak ve içsel algoritma ayarlanarak bölümlere ayrılır. Pozitifliği ve protein kolokalizasyonunu belirlemek için eşikleme uygulanır. Son algoritma daha sonra tüm doku setine uygulanır. Elde edilen veriler, kullanıcının doku tipine (örn. epitel ve stroma) ve hücre altı bölmeye (çekirdeğe karşı sitoplazmaya karşı plazma zarı) dayalı olarak protein ekspresyonunu değerlendirmesine olanak tanır. Ko-lokalizasyon analizi, çift pozitif, çift negatif ve tek pozitif hücre tiplerinin araştırılmasına izin verir. Multispektral görüntülemeyi çoğullanmış immünohistokimya ve otomatik görüntü elde etme ile birleştirmek, dokulardaki biyobelirteçlerin araştırılması için objektif, yüksek verimli bir yöntemdir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünohistokimya (IHC) doku içinde proteinin tespit edilmesi için standart bir laboratuar tekniğidir ve IHC hala yaygın olarak araştırma ve teşhis patoloji hem de kullanılır. İHK boyama değerlendirme sonuçlarının yorumlanması içine potansiyel önyargı tanıtan genellikle yarı-kantitatif olduğunu. Birçok yarı nicel yaklaşımlar son tanıya 1-4 içine boyanma yoğunluğu ve boyama ölçüde hem dahil olan geliştirilmiştir. Diğer sistemler daha iyi ifade 5. lokalize etmek için puanlama yoğunluğu ve hücre içi konumunu içerir. Birden fazla izleyiciler ortalama puanları Ortaklığın genellikle tek izleyici önyargı 6 etkilerini en aza indirmek içi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: protokolü, burada daha önce tarif edilen 12,17,18 boyama ve doku mikrodizisi (TMA) analizini tarif eder. 4 um kalınlığında TMA bölümü, standart bir mikrotom kullanılarak parafin bloğu elde edilmiştir.

NOT: 4 kromojenlerin ve karşıt için spektral kütüphane görüntü kantitatif için oluşturulmalıdır. Bunu yapmak için, her bir antikor için optimize protokol bir slayt başına antikor, eksi son counterstain ile çalıştırılmalıdır. Beşinci slayt spektral kütüphane oluşturmak için gerekli 5 görüntüleri oluşturmak için hematoksilen ile boyanmış olmalıdır.

1. Multiplex İmmunohistokimya

  1. 20 dakika boyunca 60 ° C'lik bir fırında kayar. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 'de, bir eğitim olmayan doku bölümünde birlikte, stromal ve epitelyal kısımlarına kademeli görüntüleri prostat dokuları üzerinde gerçekleştirilir. Epitelyal membran markör E-kadherin kullanarak, hücre parçalara ayırma, Şekil 2'de gösterilen çekirdek, sitoplazma ve membran kısımları, ayrı yapıldı.

Bir deneyde, Şekil 3'te gösterildiği gibi, AR ve ÖRa, E-kadherin ve CD147.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein ifade değerlendirmek için geleneksel immunohistokimyasal kullanımı analizi 22,23 öznel, yarı nicel yöntemler ile sınırlıdır. Peşin platformları biyobelirtecin ifade ve lokalizasyon yüksek verimlilik analizi için yaratılmıştır. doku ve hücre içi bölmeleri hem Detaylı segmentasyon kullanıcıları diğer ilgi işaretleri ile biyobelirteç ifade, yerelleştirme ve ko-lokalizasyon çalışma sağlar. Daha önceki çalışmalarda, aynı hücresel bölme 18,20,21 lokalize proteinler incelemek için kullanılan, özel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar kendi imkanları ve hizmetlerin kullanımı için, Patoloji ve Laboratuar Tıp UW Bakanlığı tarafından desteklenen bir parçası ve UWCCC hibe P30 CA014520 olarak, Patoloji laboratuvarında Wisconsin çeviriyle ilgili araştırma Girişimleri Üniversitesi teşekkür ederim.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KsilenFisher ChemicalX3F1GALNFPA derecesi: Sağlık – 2, Yangın – 3, Reaktivite – 0
Etil Alkol-200 kanıtıFisher Scientific4355223NFPA derecesi: Sağlık – 0, Ateş – 3, Reaktivite – 0
Tris BaseFisher ScientificBP152-500NFPA derecesi: Sağlık – 2, Ateş – 0 , Reaktivite – 0
Tris Hidroksimetil aminometan HClFisher ScientificBP153-1NFPA derecesi: Sağlık – 2, Ateş – 0 , Reaktivite – 0
Tween 20Chem-Impex1512NFPA derecesi: Sağlık – 0, Ateş – 1 , Reaktivite – 0
Fosfat tamponlu salinFisher ScientificBP2944-100NFPA değerlendirmesi: Sağlık – 1, Ateş – 0 , Tepkime – 0
PeroksidalıBiocare MedicalPX968Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Ciltte tahrişe ve göz hasarına neden olabilir.
Östrojen Reseptörü alfaThermo Fisher Scientific-LabvisionRM9101Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
Androjen ReseptörüSCBTsc-816Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
CD147BiyotasarımP87535MTehlikeli olarak sınıflandırılmamış
E-cadherinDakoM3612Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
Renoir Red Andibody SeyrelticiBiocare TıbbiPD904Tris bazlı antikorlarla çalışmak üzere özel olarak tasarlanmıştır
DeCloaking Chamber Biocare MedicalModel DC2002Düdüklü tencere kullanmak için normal önlemleri alın
Bariyer kalemi-Immuno Edge Vector LabsH-4000
Denatüre Etme Kiti-Elüsyon adımıBiocare MedicalDNS001HTehlikeli olarak sınıflandırılmamıştır
Mach 2 Keçi anti-Tavşan HRP PolimerBiocare MedicalRHRP520Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
Mach 2 Keçi anti-Tavşan AP PolimerBiocare MedicalRALP525Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
Mach 2 Keçi anti-Fare HRP PolimerBiocare MedicalM3M530Tehlikeli
Betazoid DAB Kromojen KitiBiocare MedicalBDB20041. DAB'ın şüpheli bir kanserojen olduğu bilinmektedir.
2. DAB bileşenlerini güçlü ışığa veya doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın.
3. Uygun kişisel koruyucu ekipman ve giysi giyin.
4. DAB ciltte hassaslaşmaya neden olabilir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının.
5. İmha ile ilgili tüm federal, eyalet ve yerel çevreyi gözlemleyin
Çözgü Kırmızı Kromojen KitiBiocare MedicalWR806Aşındırıcı. Ciltte tahrişe veya göz hasarına neden olabilecek asit.
Vina Green Chromogen KitBiocare MedicalBRR807Yutulması halinde zararlı
Bajoran Purple Chromogen KitBiocare MedicalBJP807Yanıcı sıvı. Isıdan, alevden ve kıvılcımlardan uzak tutun. Yutulması veya emilmesi yoluyla zararlıdır. Cilt veya gözlerle temasından kaçının ve solumaktan kaçının.
Kedi HematoksilenBiyobakım MedikalCATHEMor   çözüm     ile; bir   hafif & nbsp; asetik & nbsp; asit & nbsp; (sirke) &nbşk; koku.   Mayıs   be
  tahriş edici & nbsp; ile   cilt & nbsp; veya   Göz.   Kaçının   İLETİŞİM & nbsp;   ile; cilt & nbsp; ve   Göz.   Kaçının   Yenmesi.
XYL Montaj OrtamıRichard Allen8312-4NFPA derecesi: Sağlık – 2, Yangın – 3 , Reaktivite – 0
1.5 LamellerFisher Marka22266858Keskin kenarlar
Kuluçka (Nem)HazneeskiBirden fazla satıcı mevcut
Konveksiyonlu FırınStabil- ThermC-4008-Q
Arka Plan Punisher Engelleme ReaktifiBiocare MedicalBP974Bu ürün tehlikeli olarak sınıflandırılmamıştır.
inForm yazılımıPerkinElmerCLS135781El yazmalarında kullanılan birincil multispektral görüntüleme yazılımı
Nuance yazılımıPerkinElmerNuance EXEl yazması içinde spektral kütüphaneler yapmak için kullanılan yazılım
Vectra mikroskobu ve slayt tarayıcıPerkinElmerVECTRAIM3 görüntü küplerini elde etmek için otomatik slayt tarayıcı ve mikroskop
olarak sınıflandırılmamıştır Eski

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed ImmunohistochemistryMultispectral ImagingProtein Expression QuantitationProtein Co localization AnalysisTissue Segmentation AlgorithmSpectral Library CreationChromogen Detection MethodsAutomated Image AcquisitionSubcellular Compartment AnalysisBiomarker Investigation Tissues

Related Articles