Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

12.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53837

⸱

8 Nisan 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

Bu makalede

Özet

İmmünohistokimya, dokulardaki protein lokalizasyonunu ve ekspresyonunu değerlendirmek için güçlü bir laboratuvar tekniğidir. Kantitasyon için mevcut yarı otomatik yöntemler öznelliği ortaya çıkarır ve çoğu zaman tekrarlanamaz sonuçlar yaratır. Burada, multispektral görüntüleme kullanılarak çoğullanmış immünohistokimya ve protein ekspresyonunun objektif kantitasyonu ve ko-lokalizasyonu için yöntemler tanımlanmıştır.

Özet

İmmünohistokimya, dokulardaki protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir klinik ve araştırma laboratuvarı tespit tekniğidir. İmmünohistokimya kullanılarak ekspresyon skorlaması için birçok yarı kantitatif sistem geliştirilmiştir, ancak doğal öznellik sonuçların tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu sınırlar. Ayrıca, nükleer transkripsiyon faktörleri gibi uzamsal olarak örtüşen biyobelirteçlerin araştırılması mevcut immünohistokimya teknikleri ile zordur. Çoğullanmış immünohistokimya ve multispektral görüntülemenin yüksek verimli yöntemlerini kullanarak çoklu proteinlerin eşzamanlı olarak araştırılması için bir sistem geliştirdik ve optimize ettik. Çoğullanmış immünohistokimya, primer antikorların yaban turpu peroksidaz veya alkalen fosfataza konjuge edilmiş sekonder antikorlarla ardışık olarak uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İlgilenilen her bir proteini tespit etmek için farklı kromojenler kullanılır. Lekeli slaytlar otomatik bir slayt tarayıcıya yüklenir ve otomatik görüntü alımı için bir protokol oluşturulur. Bir spektral kitaplık, her birinde tek bir kromojen bulunan bir dizi slaytın boyanmasıyla oluşturulur. Temsili lekeli görüntülerin bir alt kümesi multispektral görüntüleme yazılımına aktarılır ve görüntülerdeki doku bölmeleri tanımlanarak doku tipini ayırt etmek için bir algoritma oluşturulur. Hücre altı bölmeler, hematoksilen karşı boyası kullanılarak ve içsel algoritma ayarlanarak bölümlere ayrılır. Pozitifliği ve protein kolokalizasyonunu belirlemek için eşikleme uygulanır. Son algoritma daha sonra tüm doku setine uygulanır. Elde edilen veriler, kullanıcının doku tipine (örn. epitel ve stroma) ve hücre altı bölmeye (çekirdeğe karşı sitoplazmaya karşı plazma zarı) dayalı olarak protein ekspresyonunu değerlendirmesine olanak tanır. Ko-lokalizasyon analizi, çift pozitif, çift negatif ve tek pozitif hücre tiplerinin araştırılmasına izin verir. Multispektral görüntülemeyi çoğullanmış immünohistokimya ve otomatik görüntü elde etme ile birleştirmek, dokulardaki biyobelirteçlerin araştırılması için objektif, yüksek verimli bir yöntemdir.

Giriş

İmmünohistokimya (IHC) doku içinde proteinin tespit edilmesi için standart bir laboratuar tekniğidir ve IHC hala yaygın olarak araştırma ve teşhis patoloji hem de kullanılır. İHK boyama değerlendirme sonuçlarının yorumlanması içine potansiyel önyargı tanıtan genellikle yarı-kantitatif olduğunu. Birçok yarı nicel yaklaşımlar son tanıya 1-4 içine boyanma yoğunluğu ve boyama ölçüde hem dahil olan geliştirilmiştir. Diğer sistemler daha iyi ifade 5. lokalize etmek için puanlama yoğunluğu ve hücre içi konumunu içerir. Birden fazla izleyiciler ortalama puanları Ortaklığın genellikle tek izleyici önyargı 6 etkilerini en aza indirmek için kullanılmaktadır. Bu çabalara rağmen, analiz öznellik hala 7 boyanma ölçüde değerlendirirken, özellikle kalır. İnsan girişten Protokol standardizasyon ve minimize öznellik doğru, tekrarlanabilir İHK sonuçlar yaratmak için her şeyden önemlidir.

içerik "> dokular içinde protein ifadesini belirlemek için İHK yanı sıra diğer seçenek vardır. Böyle immunoblotting gibi diğer teknikler, protein ifadesini araştırmak için altın standart olarak görülüyor ise araştırma ayarı içinde, immünhistokimya geleneksel, protein lokalizasyonu 8 incelemek için bir araç olarak görülmüştür . belirlenmesi doku veya hücre bölmesi özgü ifade doku slaytlar üzerinde floresan antikor kullanımı makul bir uzlaşma vardır. hücre parçalanması veya lazer yakalama mikrodiseksiyon 9,10 olarak gelişmiş teknikler içeren olmadan zordur, ama nedeniyle NADPH arka plan otofloresansı, lipofuscins, retiküler lifler, kollajen, elastin ve 11 doğru niceleme zorlaştırabilir.

Otomatik hesaplama patoloji platformları patoloji boyaması 12-15 daha objektif kantitatif için umut verici yönü vardır. Doku mikrodizinlerinde ile çok bantlı görüntüleme birleştirenbüyük örnek boyutlarda protein ekspresyonu yüksek verimli analizini kolaylaştırır. Kategorik biçimi 16 yerine, sürekli bir veri dönerken esas içsel hatalar ve analizi için gerekli zamanı hem de azaltarak, bu teknikler ile, protein, eş-lokalizasyonu, boyama heterojenliği ve doku ve hücre içi lokalizasyonu analizi mümkündür. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, çok bantlı görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz ile çoklanmış immünohistokimyasal gerçekleştirmek için yararını ve metodolojisini göstermekti.

Bu protokol, dört optimize monoklonal antikorlar ile tek bir doku bölüm slayt kılavuzu, multipleks immünohistokimyasal için yazılmıştır. bir temsili olarak, çekirdek anti-tavşan östrojen reseptörü alfa (ÖRa) ve androjen reseptörü (AR) zara-bağlı anti-fare CD147 ve membrana bağlı anti-fare E-kaderin ile çoklanır. tercih edilen herhangi bir antikorun substitut edilebilirBurada listelenen antikorlar için ed, ancak antikorların her kombinasyonu ayrı optimizasyon gerektirir. Tüm antikorlar için ön işleme tabi tutulması aynı olmalıdır. AR ve CD147 antikorlar, bir kokteyl olarak ayrı ayrı ve optimize edilmelidir. Her antikor, biyotin-bir polimer sistemi ve 4 benzersiz kromojenler biri kullanılarak tespit edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: protokolü, burada daha önce tarif edilen 12,17,18 boyama ve doku mikrodizisi (TMA) analizini tarif eder. 4 um kalınlığında TMA bölümü, standart bir mikrotom kullanılarak parafin bloğu elde edilmiştir.

NOT: 4 kromojenlerin ve karşıt için spektral kütüphane görüntü kantitatif için oluşturulmalıdır. Bunu yapmak için, her bir antikor için optimize protokol bir slayt başına antikor, eksi son counterstain ile çalıştırılmalıdır. Beşinci slayt spektral kütüphane oluşturmak için gerekli 5 görüntüleri oluşturmak için hematoksilen ile boyanmış olmalıdır.

1. Multiplex İmmunohistokimya

  1. 20 dakika boyunca 60 ° C'lik bir fırında kayar. Bir kimyasal davlumbaz kullanarak,% 100 ksilen slayt batırmayın. ksilen 2 değişiklikler için tekrarlayın. 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde slayt bırakın. Taze% 100 etanol ile tekrarlayın.
  2. 3 dakika boyunca% 95 etanol içinde slayt bırakın. Taze tekrarlayın% 95 etanol. 3 dakika boyunca% 70 etanol içinde slayt bırakın. 3 dakika için damıtılmış su içinde slayt bırakın. taze damıtılmış su ile tekrarlayın. Tap slayt dikey slayt suyu tahliye etmek. 5 dakika için hazır kullanım endojen peroksidaz engelleyici 200 ul uygulanır.
  3. slayt peroksidaz engelleyici boşaltın ve (7.0 daha az pH) 45 ml hazır kullanıma alma tampon batırmayın. bir düdüklü tencere koyun slayt konteyner ve başlangıç ​​programı 4 dakika boyunca 124 ° C'ye kadar ayarlayın. düdüklü tencere 20 dakika soğumasını bekleyin. açmadan önce.
  4. alma tampon kabını çıkarın ve ek 10 dakika soğumasını bekleyin. 10 dakika için damıtılmış su içinde slayt durulayın. slayt suyu boşaltın ve dikkatli hidrofobik bir bariyer kalem ile slayt doku tasvir.
  5. Nemli gazlı bez içeren kapak (kuluçka bölme) ile düz bir hazne için fosfat tampon salin (PBS) .Transfer sürgünün 200 ul ekle.
  6. 1x 1 litre hazırlamak 50 m seyreltilerek Tween-20 (TBST) ile tuzlu su Tris tamponlu20x Tris L% 1 Tween-20 ve 950 ml damıtılmış su ihtiva eden tamponlu tuz.
  7. slayt PBS boşaltın ve 1x TBST 200 ul geçerlidir. 2 dakika kuluçkalayın. slayt TBST boşaltın ve kuluçka odasına slayt dönün. Ready-to-üniversal proteini blok yakın odasının 200 ul uygulayın ve 7 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Protein bloğu boşaltın ve kuluçka odasına slayt dönün. Anti-ÖRa antikoru 1 seyreltin: 400 antikoru seyreltici 239,4 ul antikor 0.6 ul ekleyerek. slayt seyreltilmiş antikor ve yakın odasının 200 ul uygulayın.
  9. 2 saat için oda sıcaklığında slayt inkübe edin. slayt antikor boşaltın ve TBST içinde 5 dakika için daldırma ile, ardından TBST ile yıkayın.
  10. slayt TBST boşaltın ve kuluçka odasına slayt dönün. Hazır kullanımlı keçi anti-tavşan yaban turpu peroksidaz polimer ve kapalı bölmenin 200 ul uygulanır. 30 dakika boyunca inkübe edin. oda sıcaklığında. 5 dakika boyunca TBST kabın içinde TBST ve yer slayt ile durulayın slayt.
  11. 250 ul DAB substrat tamponuna DAB kromojeninin 8 ul ekleyerek ve iyi karıştırılarak kromojen kahverengi yaban turpu peroksidaz-3,3'-diaminobenzidin (HRP-DAB) hazırlayın.
  12. kuluçka odasına slayt, dönüş slayt TBST boşaltın ve 6 dakika süreyle kahverengi HRP-DAB kromojeninin 200 ul geçerlidir. İyice damıtılmış su bir kap içinde damıtılmış su ve yer slayt slayt yıkayın.
  13. ikinci tampon reaktif 150 ul birinci yıkama reaktif 50 ul birleştirerek denatüre çözüm karıştırın. slayt kapalı suyu boşaltın ve 3 dakika boyunca slayt seyreltilmiş denatüre çözümü uygulayın. oda sıcaklığında. Süzün ve TBST ile reaktif denatüre yıkayın. 5 dakika boyunca TBST slayt daldırın.
  14. Anti-AR antikoru 4.2 ul ve antikor seyreltici 203 ul anti-CD147 antikor 2.8 ul seyreltilmesi ile AR / CD147 antikor kokteyli hazırlanır. , Slayt TBST boşaltın kuluçka odasına slayt dönmek ve AR / CD147 c 200 ul uygulamakslayta ocktail. Yakın odası ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. 5 dakika boyunca TBST içinde durulayın TBST ile slayt ve batırmayın.
  15. TBST, kuluçka odasına geri dönüş slayt boşaltın ve hazır-to-use keçi anti-tavşan alkalin fosfataz polimerin 200 ul geçerlidir. Yakın odası ve 30 dakika inkübe slayt. oda sıcaklığında. 5 dakika boyunca TBST içinde durulayın TBST ile slayt ve batırmayın.
  16. 250 ul kırmızı kromojen tampon kırmızı kromojeninin 3.2 ul ekleyerek kromojen kırmızı alkalin fosfataz hazırlayın ve iyice karıştırın.
  17. slayt TBST boşaltın ve kuluçka odasına slayt dönün. Slayt yakın bölmeye seyreltildi kırmızı alkalin fosfataz kromojen 200 ul uygulayın ve 7 dakika boyunca inkübe edin.
  18. kromojen boşaltın ve iyice distile su ile slayt durulayın. 5 dakika için damıtılmış su içinde, bir kap içinde slayt yerleştirin. , Slayt suyu boşaltın TBST ile yıkayın ve kuluçka odasına geri dönün. slayt ve Clos'a 200 ul keçi anti-fare-HRP polimer uygulanırE odası. 30 dakika boyunca inkübe edin. oda sıcaklığında.
  19. slayt polimeri boşaltın ve TBST ile yıkayın. 5 dakika boyunca TBST Place slayt. tampon 250 ul stabilize edici reaktif 3.2 ul ekleyerek mor HRP-bağlı kromojen 200 ul hazırlayın ve iyice karıştırın. mor kromojeninin 3.2 ul ekleyin ve sonra, iyi hidrojen peroksit reaktif 3.2 ul karıştırın ve iyice karıştırın.
  20. slayt TBST boşaltın ve slayt ve 7 dakika inkübe hazırlanan mor kromojeninin 200 ul geçerlidir. oda sıcaklığında. 5 dakika boyunca distile su bir kap içinde saf su ve yer kaydırağı ile durulayın slayt.
  21. ikinci tampon reaktif 150 ul birinci yıkama reaktif 50 ul karıştırılarak denatüre çözüm karıştırın. slayt kapalı suyu boşaltın ve 3 dakika boyunca slayt seyreltilmiş denatüre çözümü uygulayın. oda sıcaklığında.
  22. TBST ile ayıraç kapalı denatüre durulayın. 5 dakika süreyle TBST içinde kapta slayt yerleştirin. Anti-e-kaderin antikor sulandırmakAntikor seyreltici ul 218.9 1.1 ul antikor eklenerek 200: 1. kuluçka odasına slayt, dönüş slayt TBST boşaltın ve slayt E-kaderin 200 ul geçerlidir. Yakın odası ve 30 dakika kuluçkalayın. oda sıcaklığında.
  23. 5 dakika boyunca TBST kabın içinde TBST ve yer slayt ile durulayın slayt. kuluçka odasına slayt dönmek, slayt TBST boşaltın ve 200 ul keçi anti-fare HRP polimer uygulayın. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. 5 dakika boyunca TBST kabın içinde TBST ve yer slayt ile durulayın slayt.
  24. Siyah 250 ul tampon kromojeninin 8 ul ekleyerek kromojen HRP-bağlantılı hazırlayın. slayt ve 2 dakika için geliştirmek kromojen 200 ul uygulanır. Damıtılmış su ile iyice yıkayın ve bir slayt damıtılmış su konteyner içinde bırakın.
  25. distile su 200 ul 40 ul hematoksilin ekleyerek hematoksilin sulandırmak. slayt suyu boşaltın ve 30 saniye boyunca slayt seyreltilmiş hematoksilen 200 ul geçerlidir. durulama slaytİyice 2 dakika için akan musluk suyu., daha sonra, 30 saniye için damıtılmış su içinde durulanır. 15-30 dakika süreyle, 60 ° C fırına yerleştirilmiştir kayar.
  26. 30 saniye taze hazırlanmış% 100 ksilen slayt daldırın aşırı ksilen silin ve kalıcı montaj medya bir damla ekleyin. Bir numaralı 1.5 lamel ile lamel.

2. Otomatik Görüntü Alma ve Analiz

  1. otomatik slayt tarayıcı üzerine lekeli slaytlar yükleyin. TTB çekirdek çapı, ayrılık ve sayısına bağlı, üreticinin kılavuzuna göre otomatik tarama protokolü oluşturun.
  2. Açık multispektral görüntüleme yazılımı bireysel kromojenlerin ve hematoksilen lekeli slayt ile boyanmış kontrol slaytlar bir spektral kütüphane kurmaya. Bir kontrol slayt alınan bir görüntü küpü açın ve optik o kromojen tanımlamak için dört beş olumlu boyanan alanları seçin. Tam bir spektral kütüphane representi kadar diğer kontrol slaytlar görüntü küpleri ile tekrarlayınTüm kromojenleri ng oluşturulan ve daha sonra spektral kütüphane tasarruf edilir.
  3. multispektral görüntüleme yazılımı içinde yeni bir projeye başlamak. Seç "Multispektral (.im3)" örnek biçimi için görüntü formatı seçeneği ve "Aydınlık" için. "Skor", "fenotiplendirme" "Özellikler Find", "Segment Dokusu" ve "İhracat": Birincisi, istenen seçenekleri seçerek projeyi yapılandırın. Bu noktada, resim çözünürlüğü istenirse analiz süresini hızlandırmak için değiştirilebilir.

3. Doku Segmentasyon

  1. Önceden oluşturulan spektral kütüphane İthalat ve analize dahil edilecek tüm kromojenleri seçin.
  2. Açık görüntü küpleri "Görüntü Aç Cube" seçeneğini seçerek belirlenen eğitim verilerine dahil edilecek. Eğitim doğruluğunu sağlamak için, görüntülerin toplam sayısının en az% 18 oranında seçmek analiz edilecek. segmentasyon doğruluğunu artırmak için tüm hastalık durumlarını temsil görüntüleri seçin. Görüntülerin bu kısmı is görüntülerinin eğitim seti çağırdı.
  3. göz damlası aracı seçerek ve beyaz bir görüntüdeki bir alanı seçerek belirlenen eğitim beyaz dengesi görüntüler.
  4. Doku segmentasyonu geçmek için "Advance" düğmesini seçin. Doku tiplerini seçmek için "Doku Kategoriler" paneli kullanın (yani "doku" ve "non-doku") analiz edilecek. Daha doğru bir protein doku lokalizasyonu için, birden fazla doku kategoriler (yani. "Epitel", "stroma" ve "non-doku") kullanılabilir.
  5. algoritması oluşturma ve eğitim görüntülerin içindeki hücrelerin grupları etrafında çizerek doku kategorilerini tanımlayan başlayın. bir doku kategorisinde bittiğinde, diğer doku kategorileri için tekrarlayın. Bu doku kategorisi Çeşidi karakteristik görüntülerin içindeki hücrelerin gruplarını seçmek için emin olun.
  6. görüntülerinin eğitim seti içindeki tüm görüntüler için bu işlemi tekrarlayın.
  7. Seçin parçaları (kromojenleri) trai dahil edilecek"Doku segmenter" için ning. aydınlık immünohistokimya görüntü analizi yaparken, tüm bileşenler, normal olarak eğitim dahildir. Bu aşama sırasında önyargı önlemek için ayarlanmış eğitim bol negatif boyama görüntüleri içerir.
  8. Doku segmentleştiriciyi eğitimi için uygun bir "Desen Ölçeği" seçiniz. 20X büyütme altında, bir büyük model ölçeği genellikle uygundur. yüksek büyütme altında ince bir mimariye sahip dokular ile çalışırken, daha küçük bir model ölçeği daha uygundur.
  9. Doku segmentleştiriciyi eğitim başlatmak için "Tren Doku segmenter" düğmesini seçin. Düzgün sınıflandırılır eğitim bölgeleri içindeki piksellerin oranını yansıtan bir pop-up kutusu görüntüleyen doğruluğunu gözlemleyin.
    NOT: Yazılım sürekli elle durdurulana kadar algoritmanın doğruluğunu geliştirmek için çalışır. Biz daha önce% 97 eğitim doğruluk 12 görüntüler sonuçların% 18 o eğitimi göstermiştir.
  10. Doku segmenter eğitimli sonra, uygun bir segment çözünürlüğü seçin. Segment çözünürlüğü daha az zaman ve para cezası çözünürlük daha fazla zaman gerektiren gerektiren kaba çözünürlükte segment görüntüleri için gerekli süreye karşılık gelir.
  11. Segment "Segment Görüntüleri" tıklayarak görüntülerin tüm eğitim seti. Yazılım yeterli zaman tüm eğitim görüntüleri algoritması uygulamak için izin verir. Bittiğinde, mevcut eğitim algoritması ile herhangi Yanlış sınıflandırılmış doku bulmak için ayarlanmış eğitim gözden geçirin.
  12. ince ayar yapmak için doku segmentasyon işlemi, eklemek, düzenlemek veya doku eğitim bölgeleri kaldırın. piksel başka bir bir doku kategorisinde kenarlarında uzatmak durumunda "süs kenarları" seçeneğini kullanın. piksel küçük gruplar Sınıflandırılmamış ise, asgari bölüm boyutu eşiği ayarlayın.
  13. düzenlemeler, seçme "Segment Görüntüler" tamamlandığında, bu doku segmentasyonu için yeni bir algoritma oluşturmak için doku segmentleştiriciyi yeniden eğitecek. Bir önceki algoritmaotomatik olarak kaydedilir ve gerekirse iade edilebilir.
  14. Ne zaman emin doku segmentasyon algoritması sonuçları, "Advance" düğmesini seçerek hücre segmentasyon ilerlemek.

4. Hücre Segmentasyon

  1. Seç hücre içi bölmeleri hücre segmentasyon dahil edilecek. "Çekirdekler" zaten "Sitoplazma" ya da "Membran" seçmek için seçili olduğundan emin olun.
    Not: bir zar-özgü protein işaret, E-kadherin gibi IHC dahil edildiğinde "Membran" segmentasyon yalnızca seçilmelidir.
  2. "Çekirdekler" sekmesine içinde, çeşitli seçenekler vardır. Nükleer segmentasyon için uygun ayarları seçerek başlayın (adım 4.3). bireysel ya da tüm doku kategorileri segmentasyon dahil edilecektir seçin.
  3. Nükleer segmentasyon için bir yaklaşım seçin
    1. İyi elde edilmesi için basit bir yöntem için counterstain "piksel-esaslı (eşik)" yaklaşımı seçmekgörüntü işleme ayarları hakkında çok bilmeden sonuçları.
      NOT: Bu genellikle iyi bir ilk seçim yapar. bir yaklaşım, "Pixel Tabanlı (Eşik)" seçerken, güvenilir bir nükleer karşı-leke olduğunda tutarlı nükleer karşıt eksikliği varsa "Tabanlı Object" kullanılması gerektiğini ise, daha uygundur.
    2. güvenilir bir nükleer counterstain olduğunda "Pixel Tabanlı (Eşik)" yaklaşımı seçin.
      NOT: Bu yaklaşım tamamen piksel tabanlı olduğunu. Bu yaklaşım, aynı zamanda, bir IHC leke pozitif leke doku kategori içindeki bütün pikseller tespit gibi basit bir eşik değeri ile memnun diğer görüntü analiz ihtiyaçları için kullanılabilir.
    3. Nükleer counterstain nükleer nesnelerin tutarlı ve özel boyama sağlamaması halinde Nesne Tabanlı yaklaşım seçin ve daha gelişmiş morfometri-temelli yaklaşımlar çekirdekleri tespit etmek için ihtiyaç vardır.
    4. "Nucl" Nükleer segmentasyonu için Bileşenleri "seçinKulak Boyut "ve" Temizlik-up "kullanıcı daha çekirdekler segmentasyon ayarlarını tanımlamak istiyorsa.
  4. sitoplazma şekil parametreleri seçin
    1. sitoplazma segmentasyon geçmek için "Advance" düğmesini seçin.
      NOT: Seçim için sitoplazma segmentasyon içinde çeşitli seçenekler vardır. "Çekirdeğe iç mesafe" olarak adlandırılan bir seçenek piksel tabanlı. Bu çekirdeğin dış ve sitoplazma içi arasındaki mesafe yansıtır. Bu değeri artırmak nükleer sinyal sitoplazma bölmeye üzerine çarpılar olasılığını azaltır.
    2. Sonraki seçeneğini, "dış mesafe çekirdeğine".
      Not: Bu aynı zamanda, piksel tabanlı. çekirdeğin dış mesafeden çekirdeğinin dış ve hücre dışı arasındaki mesafe yansıtır. Bu değeri ya da istenirse membran sinyallerini hariç tutmak için büyük veya küçük yeterli ayarlanabilir.
    3. Sonraki seçeneğini "minimum boyutu".
      NOT: Minimum boyut, PIXEtemelli l analize dahil edilecek asgari sitoplazma örneklem büyüklüğü yansıtır. sitoplazma boyutu tür hücreler sıkı birlikte paketlenmiştir olduğu gibi belirli bir hücrede küçükse, bu sitoplazma segmentasyon analize dahil edilmiştir.
    4. Bir sonraki seçenek, "İlköğretim", "İkincil" ile "Bileşeni" seçin ve ikincil seçenekleri olarak "üçüncül" seçeneğini seçin.
      NOT: Burada biri belirli bir sitoplazma işaretleyici seçebilirsiniz. Belirli bir sitoplazmik IHC markör kullanılmış ise nükleer segmentasyon benzer bir şekilde, bu bileşen, bir asgari eşik değerini bularak sitoplazma tanımlamak için kullanılabilir. Bu sitoplazma tanımlanmasında yardımcı ama kabul edilebilir doğruluk için gerekli değildir.
    5. Üç sekmeli seçeneklerin son taşıma "Membran" dir. Burada kullanıcı bir protein işaretleyici ile membran yuvasını tanımlar. , "Primary" Seç "İkincil" ve / veya kullanılan her zar özel bir belirteç için "Tersiyer". Ayarlayın "Tam Ölçekli OD "asgari eşik veya hücre zarlarının her işaretleyici için olumlu bulmak için.
    6. "Membran" sekmesi altında devam eden ve seçeneği "Maksimum Hücre Boyutu" seçeneğini seçin.
      NOT: Bu hücrelerin en büyük boyutunu belirtir piksel membran değerine mesafe vardır. 12 değeri 20X büyütmede çekilen görüntüler için normalde uygundur.
    7. tüm seçenekleri seçtikten sonra, "Segment Image" veya "Segment All" seçeneğini seçin. Görüntülere ayarları uygula ve "bireysel" ya da "Galeri" modunda onları gözlemlemek.
      NOT: Gerekirse ayarları ve eşikleri ayarlayın ve görüntülerinin eğitim seti hücre segmentasyon sonuçlarından memnun kadar yeniden segmenti.

Hücrelerin 5. fenotipleme

Not: Doğru hücre parçalara ayırma, doğru hücre fenotiplendirilmesini elde edilmesi için gerekli olan ve fenotipleme özelliği öğretilebilir mesafesindedir.

  1. Kullan "Ekle &# 34; düğmesi "Fenotipleri" listesine fenotipleri ekleyin. Kullanıcılar fenotip için bir renk seçebilirsiniz.
  2. Bir hücreye bir fenotip atamak için "Düzenle fenotipleri" üzerine tıklayın. fenotip belirledikten sonra taşımak için kullanıcı sağlayan bir açılır menü getirmek için belirli bir hücreyi tıklayın. devam etmek için, her bir fenotipi en az beş (5) hücreleri tanımlamak. Her bir fenotip 25 ya da daha fazla hücre seçimi en iyi sonuçları elde etmek için gereklidir.

6. Puanlama İHK ve Co-Yerelleştirme

  1. Adım "Skor İHK veya IF" geçmek için "Advance" i seçin. gol "Doku Kategori" seçiniz.
    NOT: Sadece bir doku kategori, belirli bir analiz sırasında atılır, ancak başka bir doku kategorisinde skorlama sonuçları isteniyorsa, analiz daha sonra farklı ayarlarla tekrar edilebilir.
  2. istenen "Puanlama" türünü seçin.
    NOT: Pozitiflik ilgi bileşeni için (olumlu ve olumsuz) iki depo oluştururÇift pozitifliği co-lokalizasyon analizi için kullanıldı ise. Diğer seçenekler 4-bin, 10 bin ve 50 bin seçim marker için analiz içerir.
  3. analizi puanlama kullanılacak hücrenin "Bölme" seçiniz.
  4. Primer nükleer bileşen için asgari eşik bulma benzer şekilde, "Görünümü Bileşen Verileri" seçin ve ilgi bileşen (ler) için pozitif hücreler için boyama uygun optik yoğunluk minimum eşikleri bulmak için eğitim görüntüleri üzerine imleci.
  5. yoğun lekeli hücrelerin hariç tutulacak ise, uygun bir seviyeye eşik max indirin. Aksi takdirde, analiz için bir eşik maksimum seçmek için otomatik düğmesini kullanın.
  6. eşikleme değerlerini doğrulamak için puan görüntüleri eğitim seçin.
    NOT: Belirli bir çöp kutusu içinde hücrelerin yüzdesi iade edilecektir ve görsel denetim veya manuel sayımı ile mukayese edilebilir. Tamamlandığında, "İhracat" aşamasına geçmek için "Advance" i seçin.

7. Algoritma ve Toplu Analizi uygulamak

  1. Eğitim kümesi için veri ihraç ederek doku segmentasyonu, hücre segmentasyonu ve puanlama değerleri yoluyla oluşturulan algoritma test edin. ihracat dizini için yeni bir klasör oluşturmak için yönergeleri izleyin. Seç resimler ve tablolar oluşturulmuş ve analize dahil edilecek. "Herkes için Export" seçerek analiz gerçekleştirin.
  2. Tablolar sekmesi ayrılmış metin dosyaları ihraç edilmektedir ve çoğu veri analiz programları açılabilir.
  3. Analiz tamamlandığında, ayarların doğruluğunu değerlendirmek için yüksek ve düşük lekelenme hem görüntüler için hücre parçalama ve puanlama verilerini görüntülemek.
  4. ayarlarla memnun olduğunuzda, toplu analizi yoluyla görüntüleri tüm dizi görüntülerinin eğitim setinden oluşturulan algoritma uygulanır. "Toplu Analizi" sekmesine tıklayın ve açılan algoritmanın etkin bir projeden kopyalanmış olacaktır.
  5. Yeni ihracat dizini seçin ve hangi görüntü ve tabl seçines analize dahil edilecektir. girdi dosyaları seçeneği altında, seçme "Resim Ekle" ve tüm görüntüleri toplu analize dahil edilecek seçin.
  6. "Çalıştır" seçeneğini seçerek analiz gerçekleştirin. Eğitim setinin analizi ile olduğu gibi, bu adımı belirli ayarları ve analize dahil görüntülerin sayısına bağlı olarak, bir zaman değişken miktarda gerektirir.
  7. Tamamlandığında, "Değerlendirme / Merge" sekmesine ilerlemek. istenirse toplu analizi ihracat dizin ve toplu dizin varsayılan değiştirilebilir. Seç "Tüm Dahil" ve analiz için özet verileri ile veri sayfaları oluşturmak için "Birleştirme" seçeneğini seçin.

İhraç Verilerin 8. Analiz

  1. veri analizi yazılımı ihraç tabloları açın ve kaldırmak veya bu tür her bir bileşen için minimum ve maksimum değerler olarak analiz alakasız veri sütunları gizlemek. Analizlerde kullanılan birincil veri ortalama optik yoğunluk C olanHer bir bileşen için olumn.
  2. İnceleme ihraç segmentasyon Haritaları ve ham görüntüleri analiz dışında edilecek olan numune veya TMA çekirdekleri belirlemek için. Doku yüzde değerleri dışlama kriterleri için en sık kullanılan <% 5 keyfi bir kesme ile, bir örnek dahil edilmelidir belirlerken ya da yardımcı olur.
  3. alakasız veri veya örnekleri içeren satırlar veri analiz dışında olması çıkarın.
  4. Hastalık durumunda değişiklik ya da hastalık 12,18-21 bir klinik-patolojik özellikleri ile ilişkisini araştırmak protein ölçümü verileri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 'de, bir eğitim olmayan doku bölümünde birlikte, stromal ve epitelyal kısımlarına kademeli görüntüleri prostat dokuları üzerinde gerçekleştirilir. Epitelyal membran markör E-kadherin kullanarak, hücre parçalara ayırma, Şekil 2'de gösterilen çekirdek, sitoplazma ve membran kısımları, ayrı yapıldı.

Bir deneyde, Şekil 3'te gösterildiği gibi, AR ve ÖRa, E-kadhe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protein ifade değerlendirmek için geleneksel immunohistokimyasal kullanımı analizi 22,23 öznel, yarı nicel yöntemler ile sınırlıdır. Peşin platformları biyobelirtecin ifade ve lokalizasyon yüksek verimlilik analizi için yaratılmıştır. doku ve hücre içi bölmeleri hem Detaylı segmentasyon kullanıcıları diğer ilgi işaretleri ile biyobelirteç ifade, yerelleştirme ve ko-lokalizasyon çalışma sağlar. Daha önceki çalışmalarda, aynı hücresel bölme 18,20,21 lokalize proteinler incelemek için kullanılan, özel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Yazarlar kendi imkanları ve hizmetlerin kullanımı için, Patoloji ve Laboratuar Tıp UW Bakanlığı tarafından desteklenen bir parçası ve UWCCC hibe P30 CA014520 olarak, Patoloji laboratuvarında Wisconsin çeviriyle ilgili araştırma Girişimleri Üniversitesi teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KsilenFisher ChemicalX3F1GALNFPA derecesi: Sağlık – 2, Yangın – 3, Reaktivite – 0
Etil Alkol-200 kanıtıFisher Scientific4355223NFPA derecesi: Sağlık – 0, Ateş – 3, Reaktivite – 0
Tris BaseFisher ScientificBP152-500NFPA derecesi: Sağlık – 2, Ateş – 0 , Reaktivite – 0
Tris Hidroksimetil aminometan HClFisher ScientificBP153-1NFPA derecesi: Sağlık – 2, Ateş – 0 , Reaktivite – 0
Tween 20Chem-Impex1512NFPA derecesi: Sağlık – 0, Ateş – 1 , Reaktivite – 0
Fosfat tamponlu salinFisher ScientificBP2944-100NFPA değerlendirmesi: Sağlık – 1, Ateş – 0 , Tepkime – 0
PeroksidalıBiocare MedicalPX968Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Ciltte tahrişe ve göz hasarına neden olabilir.
Östrojen Reseptörü alfaThermo Fisher Scientific-LabvisionRM9101Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
Androjen ReseptörüSCBTsc-816Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
CD147BiyotasarımP87535MTehlikeli olarak sınıflandırılmamış
E-cadherinDakoM3612Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
Renoir Red Andibody SeyrelticiBiocare TıbbiPD904Tris bazlı antikorlarla çalışmak üzere özel olarak tasarlanmıştır
DeCloaking Chamber Biocare MedicalModel DC2002Düdüklü tencere kullanmak için normal önlemleri alın
Bariyer kalemi-Immuno Edge Vector LabsH-4000
Denatüre Etme Kiti-Elüsyon adımıBiocare MedicalDNS001HTehlikeli olarak sınıflandırılmamıştır
Mach 2 Keçi anti-Tavşan HRP PolimerBiocare MedicalRHRP520Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
Mach 2 Keçi anti-Tavşan AP PolimerBiocare MedicalRALP525Tehlikeli olarak sınıflandırılmamış
Mach 2 Keçi anti-Fare HRP PolimerBiocare MedicalM3M530Tehlikeli
Betazoid DAB Kromojen KitiBiocare MedicalBDB20041. DAB'ın şüpheli bir kanserojen olduğu bilinmektedir.
2. DAB bileşenlerini güçlü ışığa veya doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın.
3. Uygun kişisel koruyucu ekipman ve giysi giyin.
4. DAB ciltte hassaslaşmaya neden olabilir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının.
5. İmha ile ilgili tüm federal, eyalet ve yerel çevreyi gözlemleyin
Çözgü Kırmızı Kromojen KitiBiocare MedicalWR806Aşındırıcı. Ciltte tahrişe veya göz hasarına neden olabilecek asit.
Vina Green Chromogen KitBiocare MedicalBRR807Yutulması halinde zararlı
Bajoran Purple Chromogen KitBiocare MedicalBJP807Yanıcı sıvı. Isıdan, alevden ve kıvılcımlardan uzak tutun. Yutulması veya emilmesi yoluyla zararlıdır. Cilt veya gözlerle temasından kaçının ve solumaktan kaçının.
Kedi HematoksilenBiyobakım MedikalCATHEMor   çözüm     ile; bir   hafif & nbsp; asetik & nbsp; asit & nbsp; (sirke) &nbşk; koku.   Mayıs   be
  tahriş edici & nbsp; ile   cilt & nbsp; veya   Göz.   Kaçının   İLETİŞİM & nbsp;   ile; cilt & nbsp; ve   Göz.   Kaçının   Yenmesi.
XYL Montaj OrtamıRichard Allen8312-4NFPA derecesi: Sağlık – 2, Yangın – 3 , Reaktivite – 0
1.5 LamellerFisher Marka22266858Keskin kenarlar
Kuluçka (Nem)HazneeskiBirden fazla satıcı mevcut
Konveksiyonlu FırınStabil- ThermC-4008-Q
Arka Plan Punisher Engelleme ReaktifiBiocare MedicalBP974Bu ürün tehlikeli olarak sınıflandırılmamıştır.
inForm yazılımıPerkinElmerCLS135781El yazmalarında kullanılan birincil multispektral görüntüleme yazılımı
Nuance yazılımıPerkinElmerNuance EXEl yazması içinde spektral kütüphaneler yapmak için kullanılan yazılım
Vectra mikroskobu ve slayt tarayıcıPerkinElmerVECTRAIM3 görüntü küplerini elde etmek için otomatik slayt tarayıcı ve mikroskop
olarak sınıflandırılmamıştır Eski

Kaynaklar

  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  3. Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
  4. McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
  5. Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
  6. Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
  7. Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
  8. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
  9. Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
  10. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  11. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  12. Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
  13. Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
  14. Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42(2012).
  17. Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102(2014).
  18. Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
  19. Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).
  20. Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
  21. Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
  22. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
  23. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  24. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  25. Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Multiplex İmmünohistokimyaProtein Ekspresyon KantifikasyonuProtein Ko-lokalizasyon AnaliziDoku Segmentasyon AlgoritmasıSpektral Kütüphane OluşturmaKromojen Tespit YöntemleriOtomatik GörüntülemeSubselüler Kompartman AnaliziBiyobelirteç Araştırma Dokuları
Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.