Yöntem makalesi

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

DOI:

10.3791/53840

⸱

22 Mart 2016

 ,  , 
1Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA, The Francis Crick Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hem yerel hem de küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi imza entegrasyonu tercihleri. Burada, ligasyon aracılı PCR (LM-PCR) amplifikasyonu ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanılarak retroviral entegrasyon sitelerin çeşitli kütüphanelerin (1) nesil için ayrıntılı bir protokol, (2) Her virüs- genomik konumunu haritalama sunuyoruz kavşak BEDTools kullanarak ve (3) İstatistiksel alaka için verileri analiz ev sahipliği yapmaktadır. enfekte olmuş hücrelerden özütlendi genomik DNA sınırlama enzimleri ile ya da sonikasyon ile sindirme ile parçalanır. uygun bir DNA son tamir sonra çift şeritli bir DNA bağlayıcılar uçlarına bağlanır ve yarı iç içe PCR virüsü uzun terminal tekrar (LTR) sonu ile bağlanmış bağlayıcı DNA hem de tamamlayıcı primerler kullanılarak gerçekleştirilir. PCR primerleri ayrı adaptör ligasyonu ihtiyacını inkâr NGS sırasında DNA kümeleme için gereken dizileri taşırlar. Kalite kontrol (KK) DNA fragmanı boyutu dağılımına değerlendirmek ve uyum için yapılırNGS önce bir DNA dahil edilmesini er. Dizi çıkış dosyaları LTR içeren okur için filtre edilir ve LTR ve bağlayıcı tanımlayan diziler uzakta kırpılır. Ayıklanmış konakçı hücre dizileri blat kullanarak bir referans genom eşlenir ve referans genom içinde benzersiz bir noktaya minimum% 97 kimlik filtrelenir. Benzersiz entegrasyon siteleri çeşitli genomik özelliklere bitişik nükleotid (nt) sekansı ve dağıtım akrabası için irdelenmektedir. Bu protokol kullanılarak, yüksek bir karmaşıklık entegre edilen kütüphaneler üç günde genomik DNA'dan yapılabilir. entegre edilen analiz duyarlı doku kültürü hücreleri eksojen viral enfeksiyon kapsamına almaktadır, tüm protokol, bu nedenle, yaklaşık bir ila iki hafta içinde yapılabilir. Bu teknolojinin son uygulamalar, HIV ile enfekte olmuş hastalardan alınan entegrasyon sitelerinden uzunlamasına analizi ile ilgilidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

konakçı hücre genomuna viral DNA (vDNA) Entegrasyon retroviral yaşam döngüsünde önemli bir adımdır. Entegrasyon stabil eklenen Provirüsün 1 kurulmasına yol açan iki ayrı katalitik işlemlerini yürütür viral enzim integraz (IN) tarafından gerçekleştirilir. Alt birimlerin bir in multimer 2-4 tarafından bir arada tutulan uçları vDNA ile üst düzey intasome oluşturan, ters transkripsiyon yoluyla üretilen doğrusal vDNA uçlarını meşgul. Yararak İÇİNDE 3'-işleme olarak bilinen bir süreçte dizilerin 3 'aşağı değişmez 5'-CA-3 den vDNA uçları', '3 girintili bırakarak her vDNA terminalinde 5-8 reaktif hidroksil grupları ile sona erer. Intasome sonradan ev sahibi büyük bir montaj parçası ve preintegration kompleksi (PIC) 9-11 olarak bilinen viral proteinler gibi çekirdek içine alınır. hücresel hedef DNA (T-DNA) rastladığında, 3'-hidroksil gro vDNA kullanırUPS zikzaklı bir şekilde T-DNA üst ve alt şeritlerin ayrılması ve eş zamanlı olarak şerit aktarma 12,13 sürecinde T-DNA 5 'fosfat gruplarına vDNA katılır için.

yerel ve küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi entegrasyon sitesi tercihleri. Yerel olarak, uzlaşma entegrasyon siteleri yaklaşık beş vDNA ekleme sitelerinden 14,15 den yukarı bp ve aşağı on dan yayılan zayıf korunmuş palindromic T-DNA dizilerinin oluşmaktadır. Küresel olarak, retrovirüsler özel kromatin açıklamaları 16 hedef. epsilon, Lenti ve spuma yoluyla alfa - yedi farklı retroviral cins vardır. Gammaretroviruses tercihen transkripsiyon başlangıç ​​siteleri (TSSler) ve aktif artırıcı bölgelerine 18-20 entegre ederken HIV-1 içeren lentiviruses, aktif transkripsiyonu genler 17 bünyelerinde entegrasyonu lehine. tam tersine, spumavirus kuvvetle heterochrom karşı önyargılı olduğunuBu tür gen kötü lamina-ilişkili alanlar 21 olarak problemlerle bölgeler. Yerel T-DNA baz tercihleri ​​IN ve T-DNA 13,22,23 arasındaki nukleoprotein temasların özel ağlar tarafından dikte büyük ölçüde vardır. Lentiviruses ve gammaretroviruses için genomik ek açıklamalar entegrasyon göreli IN ve soydaş hücresel faktörlerin 24-27 arasındaki etkileşimler tarafından yönetilen büyük bir kısmı yer almaktadır. Faktör etkileşimleri 25-27,29-32, sırasıyla yerel ve küresel düzeylerde entegrasyonu yeniden hedefleme stratejileri kanıtlanmış IN-host IN-T-DNA etkileşimi ağının 13,22,23,28 özelliklerini değiştiren ve bozan veya yeniden mühendislik.

retroviral entegrasyon siteleri katalog için kullanılan DNA dizi prosedürlerinin gücü geçmiş yıllarda son derece artmıştır. Entegrasyon siteleri Çalışma 33,34 başına benzersiz sitelerin sadece bir avuç elde etmek zahmetli arınma ve manuel klonlama teknikleri kullanılarak öncü çalışmalar ele alındı.Binlerce 17 birkaç yüz artan eksojen doku kültürü hücre enfeksiyonları elde sitelerin sayısı ile, alan dönüştürülmüş insan ve fare taslak genomları bireysel entegrasyon siteleri harita yeteneği ile LTR-konakçı DNA kavşaklarından LM-PCR amplifikasyonu kombinasyonu 18. NGS metodolojisi ile LM-PCR daha yeni kombinasyon kütüphane derinlik fırlayan gönderdi. Kütüphaneler eşsiz dizilerin 19-21,39 milyonlarca verebilir DNA kümeleme kullanımı yoluyla sıralı ise Özellikle, piro, onlarca benzersiz entegrasyon sitelerinden 30,35-38 binlerce sırasına vermiştir. Burada yükselterek ve DNA kümeleme NGS kullanarak retroviral entegrasyon siteleri sıralanması için optimize edilmiş LM-PCR protokol açıklar. yöntem, ve böylece sequen önce ek bir bağdaştırıcı bağlama adımı ihtiyacını engelleyen, büyütülmüş DNA moleküllerine dolayısıyla doğrudan PCR primerleri içine adaptörü dizileri gerekli birleştirir40 dans ediyorum. biyoinformatik analizi boru hattı, genomik özellikleri formüller verilmiştir özgü entegrasyon sitelerinden eşleme LTR-konakçı DNA birleşme için ham dizileme veri çözümlenmesinden, ayrıca genel olarak tarif edilmektedir. Bu alanda 36,38,41-43 önceki metodolojik protokollerden kurulan öncelik doğrultusunda, özel komut biyoinformatik boru hattı belirli adımların tamamlanmasına yardımcı olmak amacıyla geliştirilebilir. yardımcı ve protokol duyarlılığı enfeksiyonun yaklaşık çokluğu 1.0 (İB), hem de bu DNA'nın bir titrasyon serisi enfekte doku kültürü hücreleri, HIV-1 entegrasyon sitesi, yükseltme dizilemesi ve eşleyerek Örnek verilerle gösterilmektedir 6.4 x 10 -5 yaklaşık eşdeğer İçişleri Bakanlığı vermek üzere 15.625: enfekte olmamış hücresel DNA ile seyreltilmiş 1 maksimum seyreltme adımları 5 kat.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüs stokları oluşturmak 1.

Not: Bu protokol ıslak tezgah yönünün bir akış şemasıdır, Şekil 1 'de gösterilen viral hazır üretimi ve doku kültürü hücrelerinin sonraki enfeksiyon detayları genel retrovirüslerin farklı için geçerli olacaktır.. Bazı deneyler için, hedef hücre, endojen virüs reseptörü (ler) i eksprese olabilir, ve bu gibi durumlarda heterolog viral zarf glikoproteinini barındıran pseudotyped retroviral parçacıklar yapılar örn veziküler stomatit virüsü (VSV-G) G glikoprotein olacak enfeksiyon 44,45 için gerekli.

Not: önlemlerin alınması gerekir, HIV-1 ile çalışırken. Belirli kurallar kurumdan kuruma değişir rağmen, tüm virüs tabanlı çalışma (tipik olarak bir doku kültürü kaputu olarak anılacaktır) özel bir operatör kısıtlı biyolojik güvenlik kabini yapılmalıdır. Uygun kişisel koruyucu donanımlarO yüz koruması, galoş, bir çift eldiven tabakası ve bir tam vücut tulum elbise her zaman giyilmelidir içerir. Virüs ile ilgili deneyler kaynaklanan tüm sıvı atık çamaşır suyu (% 10 nihai konsantrasyon) ile inaktive edilmelidir ve katılar dahil olmak üzere tüm atık önce otoklavlanmalıdır.

  1. Bir gün, transfeksiyondan önce,% 10 (h / h) cenin sığır serumu ve% 1 ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), 10 ml plakası 3.3 x 10 6 HEK293T hücreleri (h / h), penisilin / streptomisin (10,000 U / beş 100 mm yemekleri her ml stok).
    Not: desteklenmiş DMEM bu noktadan sonra DMEM-FPS olarak ifade edilir.
  2. Sonraki gün, ticari olarak temin edilebilir transfeksiyon reaktifleri veya kalsiyum fosfat kullanılarak VSV-G sentezleme konstruktunun 1 ug ile zarf-silinmiş tek tur vektörler 10 tam uzunlukta retroviral moleküler klonlar taşıyan plazmidin ug veya 9 ug hücreleri transfekte.
    1. c inkübe% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de arşın (bu durum buradan sonra "doku kültür inkübatörü" olarak anılacaktır). Yaklaşık olarak 48 saat, volümetrik pipet kullanarak virüs içeren hücre ortamı hasat ve yerçekimi akışı ile 0.45 um filtreden geçirilir.
    2. 4 ° C 'de 1 saat süre ile 200,000 x g'de ultrasantrifugasyon sureti ile virüsü konsantre edilir. 20 u ihtiva eden DNaz 500 ul DMEM-FPS virüs pelletini, ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir.
      Not: DNaz adım transfeksiyon prosedüründen devam plazmid DNA'nın yükünü ortadan kaldırarak istenmeyen plazmid dizilerinin kurtarma azaltmaya yardımcı olur.
  3. Üreticinin talimatlarına göre HIV-1 p24 antijen yakalama kiti kullanılarak p24 konsantrasyonu 46 belirleyin.
    Not: Virüs konsantrasyonu da ters transkriptaz aktivite deneyi 47,48 belirlenebilir. Alternatif olarak, fonksiyonel virüs düzeyi canMOI ölçülmesiyle belirlenebilir. Bu en kolay gibi gelişmiş yeşil floresan proteini gibi flüoresan raportör genleri ifade virüslerle ayırma floresans ile aktive edilmiş hücre kullanılarak yapılır. Optimize edilmiş hücre çizgileri gibi enfeksiyon aynı düzeyde desteklemez primer hücreler çalışırken MOI belirlenmesi özellikle faydalı olabilir.

Virüs ile 2. Infect Hücreleri

  1. Plaka 3.0 X 10 5 HEK293T 2.5 ml DMEM-FPS 6 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına hücre ve doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edilir.
    Not: Bu protokol ile geri entegre olarak sitelerinin sayısı kötü kullanılan hücreler ve aktif virüs miktarı sayısı ile doğru orantılıdır.
  2. bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 saat süre ile 500 ul taze DMEM-FPS bir nihai hacim içinde 500 ng / ml değerinde nihai viral p24 konsantrasyonuna sahip hücreleri enfekte, daha sonra 2 ml DMEM-FPS oyuk başına 37 ° C önceden ısıtılmış ekleme ve inkübasyon devam edin.
  3. atEnfeksiyondan 48 saat, ortamını çıkarın ve 2 mi fosfat-tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkamak. 0.5 ml tripsin-EDTA, 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış ve birkaç saniye sonra görsel olarak hücre yer değiştirme için kuyu kontrol ekleyin.
  4. 2 ml önceden ısıtılmış DMEM-FPS ekleyin ve ~ bir hacimsel pipet yardımıyla 10 kez / aşağı pipet yukarı yumuşak hücreleri tekrar süspansiyon. DMEM-FPS önceden ısıtılmış 18 ml içeren 75 cm2'lik doku kültür şişesi çözüm aktarın ve bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe edin.
  5. enfeksiyonun baştan az beş gün sonra, 5 ml PBS ile yıkayın, ortam kaldırarak hücreleri toplamak 2 mi önceden ısıtılmış tripsin-EDTA ekleyin ve pipetleme 5 ml önceden ısıtılmış DMEM-FPS ile yeniden süspanse edin. 2.500 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çözelti santrifüj ve süpernatant atılır.
    Not: yaklaşık 48 saat sonrası enfeksiyon 49,50 olarak bu koşullar platolarda altında bütünleşme, kültür ek 3 gün sufficientl için gerekli olmasına rağmenY, hücre bazlı bir DNA rekombinasyon ya da viral aracılı autointegration sonucu olmamış DNA moleküllerinin seyreltilmesi.
  6. Bir ticari olarak temin edilebilen bir kit (örneğin, 51 bakınız) kullanılarak hücre topağından genomik DNA ekstrakte edin. 10 mM Tris-HCl, 200 ul, pH 8.5 ile birlikte, iyon değişim kolonundan DNA Zehir.
    Not: hücrelerin bir alikotu önce NGS uygun virüs enfeksiyonu sağlamak için enfekte analizi için 48 saat sonra enfeksiyondan (adım 2.3) de paylaştırılır olmalıdır.

Sonikleştirme ile veya Kısıtlama Enzim Digest tarafından 3. Fragman Genomik DNA

Not: neredeyse sekansa bağımsız bir şekilde Sonikasyon fragmanları genomik DNA ve dolayısıyla parçalanma tercih edilen biçimi eklendiğinde, düşük beklenen geri kazanım oranı ile dizilenerek numuneler (örneğin, nispeten düşük MOl'de başlatılan bulaşmış bir hasta hücreleri ya da enfeksiyonları). Ayrıca, sonikasyon biri Parti PCR çiftleri ayırt edilmelerine olanakkritik aynı yerde özel entegrasyonları arasında vasküler entegre edilen sekansı, enfekte olmuş hastalar (aşağıdaki Adım 11) 39,52-54 bölgesindeki provirüs içeren hücrelerinin klonal genişlemesini ayırt.
Not: DNA, LM-PCR sırasında iç viral dizilerinin amplifikasyonu azaltmak için yukarı LTR hemen alt baş ayrılabilir olmalıdır. Yukan U5 dizisine 43 bp'lik alt yatmaktadır ve bu Msel oluşturulan DNA daha sonra ligasyon için uyumlu olan kısıtlama enzimi BgIII birçok HIV-1 suşlarının (Şekil 1B) ile çalışır sona erer. Sonikasyon ile DNA hazırlarken, iç-yarma restriksiyon enzimi bağlayıcı bağlanmasından sonra uygulanmalıdır (- E ve aşağıda 4.3 Adım Şekil 1C bakınız).

  1. sonikasyon için, 120 ul'lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen su içinde genomik DNA, 10 ug karıştırın. (500 bp ortalama mola boyutu parametreleri kullanarak aşağıdaki paragraf iki tur ses dalgalarına maruzmetre: görev döngüsü:% 5; yoğunluk: 3; patlama başına devir: 200; Zaman: 80 sn).
  2. PCR saflaştırma kiti kullanılarak sonikasyona tabi tutulmuş DNA saflaştırılır. DNA DNA sonu tamir kiti ile uçlarını tamir ve PCR saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak. Bir kuyruk Klenow ekzo kullanılarak DNA - enzimi ve bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak bir kuyruklu DNA arındırmak. Kit kullanımı ek ayrıntılar için 51,52 bakın.
  3. kısıtlama endonükleaz sindirimi, bir yanı sıra, üreticiler ve 5'-ta çıkıntılar oluşturur (her biri 100 U) enzimler kokteyline tarafından sağlanan tampon maddesi ile 100 ul bir hacim içinde gece boyunca 37 ° C 'de, genomik DNA, 10 ug kesilmiş bu BglII uyumsuz enzim yukan virüs LTR aşağısına bölen. PCR saflaştırma kiti kullanılarak ertesi gün DNA saflaştınlır.
    Not: restriksiyon enzimleri hiçbiri terminali içinde kesmek gerekir ~ LM-PCR protokolü tarafından yükseltilir viral DNA sonu 30 bp. Bu protokol, özellikle U5 güçlendirirHIV-1 DNA sonu.

4. Tavlama bağlayıcı oligonükleotidlerden ve Parçalanmış genomik DNA ligate

Not: Yukarıdaki bir DNA fragmanları (Bu protokolde kullanılan oligonükleotidlerin sekansları için Tablo 1 'e bakınız) ile uyumlu olan bir çıkıntı ihtiva eden bir asimetrik bağlayıcıyı hazırlayın. Msel-sindirilmiş DNA bağlayıcı uyumlu 5'-TA fazlalığı (Şekil 1) içermelidir ise bağlayıcı, uyumlu T-3 'çıkıntı içermelidir sonikasyona uğratılmış DNA ile birlikte kullanılmak üzere. kısa bir bağlayıcı şerit ek olarak ilgili DNA daha sonra doğru amplifikasyon reaksiyonlarını sınırlamak için, örneğin 3'-amin olmayan bir uzatılabilir kimyasal modifikasyon içermelidir.
Not: paralel olarak birden çok farklı entegrasyon Alanı kitaplıkları hazırlanmasında ve / veya aynı sıralama kaçak çoğullama özgü örnekler, örnek çapraz Kirlenmiş potansiyelinin sınırlandırılması için her bir örnek için özel bağlayıcıları kullanmak tavsiye edilirPCR sırasında tirme. Bu ek olarak yarı iç içe PCR (aşağıda tarif edilmiştir) içinde, her bir örnek için özel bağlayıcı primerlerin kullanımı anlamına gelir. Benzersiz bağlayıcı iplikler ve bağlayıcı primerler benzer bir genel% GC içeriğine ve ilgili çıkıntı pozisyonları muhafaza ederken, Tablo 1 'de listelenen bağlayıcı oligonükleotid dizileri karıştırıcı ile tasarlanabilir.

  1. 90 ° C'de ısıtılarak 10 mM Tris-HCI, pH 8,0-0,1 mM EDTA (her oligonükleotidin 10 uM son konsantrasyon) 35 ul, kısa ve uzun bağlayıcı lifler tavlanması yavaşça 1 ° 'lik adımlarla Oda sıcaklığına soğutulduktan ve dakika başına ° C.
  2. 1.5 uM bağlanmış bağlayıcı, 1 ug parçalanmış DNA ve 50 ul 800 u T4 DNA ligaz içeren genomik DNA, örnek başına en az dört paralel ligasyon reaksiyonları, hazırlayın. 12 ° C de bir gece Arter. Bir PCR saflaştırma kiti ile ertesi gün arındırın.
  3. sonikasyon ile hazırlanan örnekler için, bir sınırlamalara 100 U saflaştınldı ligasyon reaksiyonu sindirmeküreticinin göre alt (HIV-1 için, örneğin, BglII) yukan LTR'den böler gece boyunca önerdiği koşullar altında bu yon enzimi. PCR saflaştırma kiti kullanılarak DNA saflaştırılır.

Yarı iç içe PCR ile 5. yükseltin Viral LTR-Host Genomik DNA Junctions

Not: geri kazanılan ligasyon reaksiyonunun DNA konsantrasyonuna bağlı olarak, uygun bir kütüphane çeşitliliği için en az 4-8 paralel PCR'ler sağlamak için, her iki PCR tur için her bir örnek için hazırlanmalıdır. DNA şablonu konsantrasyonunun spektrofotometri ile nicelenen gerekmektedir. Bu protokol, PCR ilk ve ikinci tur iç içe LTR-spesifik primerler kullanılmıştır, ancak, aynı bağlayıcı-spesifik primer her iki mermi (Tablo 1) kullanılır. İkinci tur LTR-spesifik primer ve DNA kümelenme ve dizileme primeri bağlayıcı siteler için bağlayıcı-spesifik primer kodlamak adaptör dizileri. İç içe LTR-spesifik primer de, WH 6 nt endeksi dizisini kodlayanich aynı sıralama çalışmasında çoklayıcı kütüphaneleri için farklı primerler arasında değiştirilebilir.

  1. Tablo 2'de listelenen tüp başına bileşenler içeren birinci tur PCRlar hazırlayın.
    Not: bağlayıcı-spesifik primer bağlayıcı, terminaline 3 '15-16 bp yukanya doğru yer alan bir son' 53 ° C,% 45 bir GC içeriğine ve onun 3 arasında bir erime sıcaklığına tamamlayıcılık 22 mt barındıran farklı bağlayıcı uzun şeritler (Tablo 1). İlk tur 27 nt LTR astar 59 ° C,% 48 bir GC muhtevasının bir erime sıcaklığına sahiptir ve 3 'ucu, HIV-1 U5 terminalinden 34 bp üst baş bulunmaktadır. HIV-1 LTR tamamlayıcı olan ikincil 26 nt LTR primer bölgesi, 60 ° C,% 50 bir GC içeriğine ve 3 'ucuna bir erime sıcaklığına sahip, viral U5 18 bp üst baş bulunduğu terminus. Oligonükleotid erime sıcaklığı ve GC içeriği bu parametreleri kullanıcıları eğer taklit gerektiğini tavsiye edilirdeğiştirilmiş diziler 21 (diğer retrovirüsler ile kullanım için olan) tasarım, PCR primerleri.
  2. Aşağıdaki PCR parametreleri altında ilk PCR yuvarlak çalıştırın: Bir döngü: 2 dakika süreyle 94 ° C; 30 döngü: 15 saniye boyunca 94 ° C, 30 saniye, 45 saniye boyunca 68 ° C, 55 ° C; Bir çevrim: 10 dakika boyunca 68 ° C.
  3. reaksiyonları bir havuz ve PCR saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılması. . Tablo 3'de belirtilen tüp başına bileşenler içeren ikinci tur PCRlar hazırlayın Adım 5.2'de açıklanan PCR parametreleri kullanılarak PCR ikinci turda çalıştırın. reaksiyonları havuzu ve üreticinin talimatlarına göre bir ticari PCR saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak.
    Not: DNA, kümelenme NGS uyumlu önerilen göstergesi çeşitli diziler 71 mevcuttur.

6. gerçekleştirin QC ve NGS (Tipik Ardışık Tesisi tarafından Tamamlandı)

  1. (QC tahlil # 1) Onayla Adım 5.3 kütüphane DNA konsantrasyonu floro kullanarakmetre 55. Kısaca, 200 ul nükleaz içermeyen su bir son hacim içinde standartları ve deneysel numunelerin hazırlanması. Vorteks tüpler 2-3 saniye, 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe ve florometre örnekleri okuyun.
    Not: Örnekler 15 ul'lik bir minimum hacimde 2 nM kütüphanesi DNA minimum konsantrasyonu içermelidir.
  2. (QC tahlil # 2) bir teyp tabanlı tahlil 56 kullanılarak DNA parçası boyutu dağılımını onaylayın.
    Not: Bir ideal dağıtım uzunluğu yaklaşık 500 bp merkezleme nispeten geniş bir DNA zirvedir. malzemenin önemli bir miktarı, 1 kb daha büyükse, o zaman kümelenme sırasında köprü amplifikasyonu engelleyecektir uzun DNA türleri, ortadan kaldırmak için bir boyut seçim prosedürü bulunması tavsiye edilir. önemli bir pik yaklaşık 100 bp ila 200 belirgindir Bunun tersine, bir primer dimer PCR sırasında meydana gelmiş olabilirler. Bu durumda, prosedür, primer dimerlerin oluşumunu en aza indirmek için optimize edilmelidir.
  3. (QC tahlil # 3) Cokantitatif PCR 57 DNA kütüphaneye adaptörlerin uygun birleşme teyid edildi.
  4. Üreticinin uygulama literatürde aşağıdaki NGS gerçekleştirin. % 10 başak-in yararlanın (a / a) sıralama vadede dengeli bir baz kompozisyonu sağlayarak gerçek zamanlı kalite ölçütleri optimize ΦX174 DNA.
    Not: Entegrasyon sitesi sıralama deneyler genellikle tek uç 150 bp (SE150) ya da eşleştirilmiş-uç 150 bp (PE150) sıralama tabi tutulmaktadır. PE150 Her bir DNA molekülü üzerinde bağlayıcı bağlanma noktasını yakalamak için özellikle yararlıdır (örneğin, konakçı hücre klonal genişleme için kanıt entegrasyon sitesi incelenmesi sırasında).

7. LTR içeren Diziler, Bitki uzak LTR ve bağlayıcı Diziler için Sıralama Verilerini ayrıştırma özelleştirilmiş Python veya PERL komut dosyası kullanın ve Blat Referans Genom için Harita

  1. Sekans okur LTR içeren uzaklıkta konukçu genomik DNA dizisinden bitki LTR ve bağlayıcı dizileri ve tara FAŞTA dosyalarıYeni bir FAŞTA dosyasına bu dizileri ihracat. Harita referans genom hem okur kırpılmış (örneğin insan genomu versiyonları hg19 veya GRCh38) ve çıkış entegrasyon sitesi ile Blat 58 kullanılarak viral genomun, aşağıdaki ayarları kullanarak, ayrı bir .txt dosyası ihraç koordinatları:
    stepSize = 6, minIdentity = 97 ve maxIntron = 0
  2. HIV-1 genomunun ve diğer diziler haritalama (LTR ucu dahili viral DNA genom bölgesi içine entegre olduğunu, yani bir kanıt) autointegrations kaldırmak dosya txt Blat çıkış ayrıştırmak ve dosya txt ayrı çıktı oluşturmak hangi tüm yinelenen entegrasyon siteleri tek ve benzersiz koordinat hit yoğunlaşmış edilmiştir.

8. FAŞTA Dosyalara Bu dönüştürme, Entegrasyonlar Etraftaki 15-Nt aralıkları İçeren .Yatakta Dosyaları oluşturun ve Taban Tercihleri ​​Entegrasyon Siteleri Etraftaki Display Dizi Logolar Construct

  1. üsleri bir aralık için liste .Yatakta dosyaları oluşturunHer entegrasyon sitesi. En az 15 baz (5 yukarı ve aşağı 10) dizi logosu üretimi için önerilmektedir. BEDTools 59 fastaFromBed fonksiyonu ve bu komutu kullanarak bu .Yatakta dosyalarından bir FASTA dosyası oluşturun:
    fastaFromBed -fi / dizin / için / referans / genom / -name -s -bed 15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    Not: değişmeyen viral 5'-CA-3 'dinükleotid entegrasyonu sırasında DNA barındırmak için katıldı ve hücresel DNA LTR terminalinin kavşağı doğrulayarak iyi niyetli entegrasyon siteleri belirlemek için önemli bir başlangıç ​​filtre edilir. Biz ayrıca deney sonuçlarını doğrulamak için bu konak DNA dizisi nüfus dizi logoları derlemek. Retrovirüsler kendi entegrasyon sitelerini 14,15 çevreleyen imza baz tercihlerini görüntülemek üzere, dizi logolar gibi homolog olmayan DNA gibi diğer rekombinasyon mekanizmaları ile karşılaştırıldığında IN-aracılı entegrasyonu ile eşleştirilmiş genomik siteleri ortaya çıktığını doğrulamak için hizmet60,61 katılmadan sona erer.
  2. Kullanım WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) FASTA dosyaları dizi logolar oluşturmak için. Click FAŞTA dosya yüklemek için 'Dosya Seç', ve aşağıdaki ayarları kullanın: Çıktı biçimi PDF (vektör); Logo boy, büyük; İlk pozisyon numarası, -5; Logo aralığı, -5 ila 5; Y ekseni ölçeği, 0.1, Y ekseni tic aralık, 0.5, Renk düzeni, klasik (NA).

9. Örnek Çapraz Kontaminasyon için kontrol edin, Merkez Bankası Çifti Dosyaları .bed oluşturun ve ihtiyaç duyulan Genomik Özellikleri Bağıl Benzersiz Entegrasyon Siteleri Dağılımı Harita

  1. retroviral entegrasyonu T-DNA şerit boyunca kademeli bir şekilde gerçekleştiğinden, genomik özelliklere genomik dağıtım nisbetle doğru eşleme için hedef site çoğaltılması merkez bp'lik yansıtmak için entegrasyon sitelerinden tam koordinatlarını ayarlayın.
    1. Bu nedenle, 5 bp HIV-1 gibi virüs çoğaltma için, i ofset merkezi bp ile .Yatakta dosya oluşturmakartı sarmalına entegrasyonlar haritalama için aşağı iki üsleri ve eksi strand entegrasyonlar haritalama için yukarı iki üsleri tarafından ntegration sitesi.
  2. Merkezi bp iki farklı örnek için ve bu komutu takip ederek dosyaları .bed kesişir BEDTools işlevini kesişir kullanarak farklı kütüphaneleri arasında ortak entegrasyon sitelerin sayısını hesaplamak, örnek çapraz kontaminasyon kontrol etmek için:
    bedtools kesiştiği -a central_basepair_1.bed -b central_basepair_2.bed -f 1.00 -r -s> overlap1v2.txt
  3. Aşağıdaki komutu kullanarak iki kütüphaneler arasında ortak sitelerin tam sayısını ölçmek için çıktı overlap1v2.txt dosyası içinde satır sayısını saymak:
    wc -l overlap1v2.txt
  4. Örneğin http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/da (UCSC Genom Açıklaması Veritabanı entegrasyonu sitesi haritalama için kullanılan referans genomunun sürümü için RefSeq açıklama .Yatakta dosyasını indirinkurumların veri tabanı) 62.
    1. RefSeq Bu komutun aşağıdaki dosya .bed ile numune için oluşturulan merkezi baz çifti .bed dosyayı kesiştiği için BEDTools işlevini kesiştiği kullanarak RefSeq genler giren entegrasyon sitelerin sayısını hesaplayın:
      bedtools kesiştiği -a central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
  5. aşağıdaki komutu kullanarak RefSeq genlerde düşen sitelerin tam sayısını ölçmek için çıktı RefSeq_sample1.bed dosyası içinde satır sayısını saymak:
    wc -l RefSeq_sample1.bed
  6. Yineleyin bir aralık dosyası mevcut .bed olan ilgi başka bir açıklama eşleme entegrasyon siteleri için 9.3 ve 9.4 adımları tekrarlayın. Adım 9.4 belirtildiği gibi UCSC Genom Açıklaması Database ilgi referans genomunun en güncel CpG ada açıklama .Yatakta dosyasını indirin.
    1. Belirli bir di giren entegrasyon sitelerin sayısını hesaplayınduruş BEDTools pencere işlevini kullanarak ve bu komutu takip ederek CpG adalarının (bu örnekte gösterildiği bir 5 kb penceresidir):
      central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed 2500 -w bedtools penceresi
  7. aşağıdaki komutu kullanarak yukarı veya aşağı CpG adalarının 2.5 kb giren sitelerin tam sayısını ölçmek için çıktı CpG_sample1.bed dosyası içinde satır sayısını saymak:
    wc -l CpG_sample1.bed
  8. Tekrarlayın 9.6 ve haritalama entegrasyon siteleri için 9.7 yakındaki TSSler adımlar. genomik birden fazla gen haritalama koordinatları RefSeq.bed dosyasının, alternatif bir sürümünü oluşturmak bu konumda sadece tek bir gen hediye yansıtacak şekilde ayarlandı. Bu entegrasyon sitesi etrafındaki gen yoğunluğu abartılmış önler. BEDTools pencere işlevini kullanarak ve bu komutu takip ederek, her entegrasyon alanını çevreleyen 1 Mb bölgesinde gen yoğunluğunu hesaplamak:
    Bedtools penceresi -w 500000 central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38_NonRedundant.bed -u> GeneDensity_sample1.bed
  9. Bu komutu takip ederek veri kümesindeki tüm entegrasyonları için ortalama gen yoğunluğu hesaplayın:
    awk '(toplamı + = $ 7) END (print "Ortalama =" toplamı / NR)' GeneDensity_sample1.bed

10. istatistiksel Ar Fisher Exact Testi ve İki kuyruklu Wilcoxon Rank Sum Testi İki kuyruklu kullanma Örnekleri arasında entegrasyon Sitesi Dağılımlar karşılaştır

RefSeq genler içinde veya CpG adaları ya da TSSlerin bir pencere içinde entegrasyon sitelerin oranını karşılaştırmak için kullanın Fisher exact testi, ancak entegrasyon siteleri çevreleyen gen yoğunluğu dağılımını karşılaştırmak için Wilcoxon rank sum testini kullanın: Not. R programı http://www.r-project.org/ mevcuttur.
Fisher testi iki uçlu:

  1. cr, Adımlar 9.4 ve 9.7 belirtildiği gibi hesaplanır numaralarını kullanarakgözlenen olaylar bu komutu izleyerek siteleri kalan karşı (bir açıklama içinde veya bir ek açıklama çevreleyen bir pencere içinde entegrasyonları) R her karşılaştırma için matrisler eate:
    (Annotation_of_interest <- Matris (c (SampleA # içinde, SampleA # kalan, SampleB # kalan SampleB # içinde), sat_say = 2, dimnames = liste (c ( 'Merkez', 'Kalan'), c ( 'SampleA' 'SampleB'))))
  2. Aşağıdaki komutu Fisher kesin testi iki kuyruklu tarafından karşılaştırma için p değerini hesaplayın:
    fisher.test (annotation_of_interest alternatif = 'two.sided') $ p.value
    Wilcoxon rank sum testi iki uçlu:
  3. , Her sütun üst hücredeki örnek adını içeren bir sekme ile sınırlandırılmış .txt dosyası oluşturun (Adım 9.9 oluşturulan .Yatakta dosyasından alınan) o kütüphanedeki tüm entegrasyon siteleri için gen yoğunluk değerleri ile aşağıda izledi. Aşağıdaki komutu kullanarak Ar içine bu sekme ile sınırlandırılmış .txt dosyasını almak ve nadoğru dosya dizinine vigating:
    FILENAME <- as.data.frame (read.delim (file.choose (), başlık = T, check.names = FALSE) = DOĞRU Eylül = ' t' doldurun)
  4. Aşağıdaki komutu iki kuyruklu Wilcoxon rank sum testi ile karşılaştırma için p değerini hesaplayın:
    wilcox.test (FILENAME $ eşleştirilmiş SampleA, DOSYAADI $ SampleB, alternatif = 'two.sided' = F, tam = T) $ p.value
    Not: P değerleri program tarafından döndürülür sıfır sonra, sadece R belli bir (çok düşük) sınırın aşağı hesaplanabilir. R bir P = 0 verim kitlesel farklı numuneler için, <2.2 x 10 -308 olarak P değerini tahmin.

11. Entegre Viral DNA'yı içeren hücrelerin klonal genişleme için kanıt Ham Dizileme verileri inceleyin

Not: Küçük bir potansiyel referansı genomunda aynı nt birden fazla entegre ihtiyaç vardır. Alternatif olarak, tek birbütünleşme etkinliği nedeniyle kütüphane hazırlanması ve / veya DNA hazırlama öncesinde hücre çoğaltma PCR kullanımı dizileme veri artık olarak mevcut olabilir. HIV ile enfekte hastalardan genomik DNA'nın Son analizler aynı entegrasyon siteleri 52-54 ihtiva eden DNA dizilerine içinde (sadece öncesinde PCR ortaya çıkabilir) eşsiz sonication kesme noktaları / bağlayıcı bağlantı noktaları belirleyerek bu olanakları ayırt var. klonal genişletilmiş hücrelerin içinde barındırdığı proviruses latent viral rezervuar katkıda ve böylece insan hastalarda entegrasyon siteleri okuyan zaman genişleme düzeylerini karakterize özel ilgi olup olmadığı konusunda bir tartışma şu anda yok.

  1. Adım 8.1 listelenen prosedüre benzer şekilde, bu durumda uzanan üsleri bir aralık listeleyen .Yatakta dosyaları oluşturmak, 25 nt aşağısında her benzersiz entegrasyon sitesinden (yukarı bazlar burada gereksizdir). belirtildiği gibi (bu .Yatakta dosyalarından bir FASTA dosyası oluşturunBEDTools gelen fastaFromBed işlevini kullanarak ve bu komutu takip ederek adım 8.1):
    fastaFromBed -fi / dizin / için / referans / genom / -name -s -bed 25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    Not: klonal büyüme analizi için, her entegrasyon sitesinden nt aşağısında, en az 25 elde etmek için önerilmektedir arama, her özgüllüğünün geliştirilmesi için.
  2. Tercihen özelleştirilmiş komut dosyası kullanarak, her benzersiz entegrasyon sitesinden nt aşağı 25 tam eşleme içeren tüm dizeleri için ham dizi veri FASTA dosyasını aramak, ve yeni bir dosya içine bu dizileri mevduat. ham dizeleri LTR ve bağlayıcı dizileri Trim. dizeleri nt örtüşen en az 20 paylaşıyorsa, ters tamamlayıcı okur kendi read1 çifti read2 dizeleri atayarak sonra LTR ve bağlayıcı dizileri kırparak ve dönüştürerek okur PE dizisi Birleştirme.
  3. Her entegrasyon sitesi bloğunun bağlayıcı bağlantı noktaları tarayın. klonal genişletilmiş "Her entegrasyonu sınıflandırır &# 34; Bağlayıcı bağlantı noktaları ise ≥3 ayrı bp.
    Not: dizisi birleştirme olmadan klonal genişleme analizi için bir protokol 52 tarif edilmiştir okur.
    Not: sonikasyon ile tam aynı yerde genomun Parçalanma klonal genişleme ölçüde küçümsenmesi yol açar ve yöntemler 63,64 tarif edilmiştir Elde edilen deneysel önyargı düzeltmek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablo 4, bir temsili örneğin sonuçları tarafından enfekte olmuş hücrelerin bir kültüründen entegrasyon sitesi geri kazanılması için NGS duyarlılığını göstermek için. Enfekte olmamış hücresel DNA seri ortalama her bir hücre, bir entegrasyon 40 ihtiva eden bir enfeksiyon genomik DNA seyreltmek için kullanıldı. 15.625: Seyreltiler 1 bir maksimum seyreltme beş adımda hazırlanmıştır. titrasyon serisinin Genomik DNA daha sonra sonikasyon ile parçalanmış ya da kısıtl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomik dağılım örnekleri eşleme yoluyla başlangıç ​​virüs enfeksiyonu aşama retroviral entegrasyonu sitelerinin analizi için bir protokol, tarif edilmektedir. Bu protokol, bir retrovirüs ve bir infectable hücre tipine uygulanabilir. Bundan başka, deney boru hattı 6.4 x 10 -5 MOI ile başlatılmış bir enfeksiyon edilene Genomik DNA, eşdeğer seri seyreltmeleri benzersiz entegrasyon sitelerinden tatmin edici bir dizi geri potansiyeline sahip, çok hassastır. hücrelerin sadece küçük bir bölümü, entegre provirüsünü ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Engelman laboratuarında retroviral entegrasyon sitesi sıralama için NGS protokolünü kurmak için kritik meslektaşlarımızla Stephen Hughes ve tavsiye için Henry Levin minnettarız. Bu çalışma AI039394 ve (ANE kadar) AI052014 ve AI060354 (AIDS Araştırma Harvard Üniversitesi Merkezi) ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMGibco11965-084HEK293T hücrelerle uyumlu standart hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır SerumuThermo ScientificSH 30088.03Optimal viral üretim için farklı serum lotlarının ön taramaya tabi tutulması gerekebilir
Penisilin / StreptomisinCorning30-002-ClMediatech'e eklenecek antibiyotikler
21-040-CVHücreleri yıkamak için kullanılır
Tripsin EDTACorning25-053-CIDoku kültürü plakalarından yapışan hücreleri ayırmak için kullanılır
PolyJetSignaGen LaboratuvarlarıSL100688DNA transfeksiyon reaktifi
0.45 &mikro; m FiltrelerThermo Scientific09-740-35BVirüs partikülü içeren hücre kültürü ortamını filtrelemek için kullanılır
Turbo DNaseAmbionAM2239Virüs stoklarından taşınan plazmid DNA'yı parçalamak için kullanılır
HIV-1 p24 Antijen Yakalama TestiABL Inc.5447Virüs üretiminin verimini ölçmek için kullanılır
DNeasy Blood & Doku KitiQiagen69506Hücrelerden genomik DNA'yı saflaştırmak için kullanılır
SonicatorCovarisS2Bu sonikatör modeli ile iki tur görev döngüsü gerçekleştirin,% 5; yoğunluk, 3; patlama başına döngü, 200; süre, 80 sn
Nükleaz İçermeyen SuGeneMateG-3250-125Numune çapraz kontaminasyon olasılığını azaltmak için ticari olarak temin edilebilen su önerilir
QIAQuick PCR Saflaştırması KitQiagen28106Kütüphane yapımı sırasında DNA'yı saflaştırmak için kullanılır
End-It DNA End-Repair KitEpicentreER81050Sonikasyonlu DNA örneklerinin DNA uçlarını onarmak için kullanılır
Klenow Parçası (3'-5' ekzo–)New England Biolabs (NEB)M0212SdATP ile A kuyruğuna onarılmış DNA fragmanları için kullanılır
dATPThermo ScientificR0141Deoksiadenozin trifosfat
MseINEBR0525LGenomik DNA bölünmesi için kısıtlama endonükleazı
BglIINEBR0144LYukarı akış HIV-1 U5 dizisi T4 DNA Ligazının amplifikasyonunu baskılamak için kısıtlama endonükleazı
NEBM0202L/6218Uyumlu DNA uçlarının kovalent birleştirilmesi için enzim
DNA OligonükleotidlerEntegre DNA TeknolojileriözelŞirketin oligoları saflaştırmasını sağlayın. HPLC saflaştırma DNA'lar için yeterlidir < 30 nükleotid; SAYFA daha uzun DNA'ları saflaştırır 
Avantaj 2 Polimeraz KarışımıClontech639202için DNA polimeraz içeren ticari karışım
(100 mM çözeltiler)Thermo ScientificR0181Her biri 2,5 mM'lik ara konsantrasyonlara ulaşmak için buz üzerindeki dört kimyasalı steril su ile seyreltin DNA
konsantrasyonunun
belirlenmesi için dNTP NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000 SpektrofotometreQubit FlorimetreYaşam TeknolojileriQubit® 3.0Entegrasyon sitesi kitaplığını doğrulamak için kullanılan florometre DNA konsantrasyonu
2200 TapeStation SistemiAgilentG2964AAEntegrasyon sitesi kitaplığını doğrulamak için bant tabanlı test DNA boyut dağılımı
MiSeqIlluminaSY-410-1003NGS için kullanılır
DMEM Fosfat Tamponlu salin PCR dNTP'ler

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890(2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464, 232-236 (2010).
  4. Hare, S., Maertens, G. N., Cherepanov, P. 3'-processing and strand transfer catalysed by retroviral integrase in crystallo. EMBO J. 31, 3020-3028 (2012).
  5. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54, 497-504 (1988).
  6. Roth, M. J., Schwartzberg, P. L., Goff, S. P. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: dependence on IN function and terminal DNA sequence. Cell. 58, 47-54 (1989).
  7. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Retroviral integration: structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2525-2529 (1989).
  8. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179, 886-889 (1990).
  9. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3, 469-478 (1989).
  10. Bukrinsky, M. I., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6580-6584 (1992).
  11. Miller, M. D., Farnet, C. M., Bushman, F. D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71, 5382-5390 (1997).
  12. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  13. Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468, 326-329 (2010).
  14. Holman, A. G., Coffin, J. M. Symmetrical base preferences surrounding HIV-1, avian sarcoma/leukosis virus, and murine leukemia virus integration sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 6103-6107 (2005).
  15. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M., Munroe, D. J. Weak palindromic consensus sequences are a common feature found at the integration target sites of many retroviruses. J. Virol. 79, 5211-5214 (2005).
  16. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42, 10209-10225 (2014).
  17. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  18. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  19. LaFave, M. C., et al. MLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42, 4257-4269 (2014).
  20. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J. Virol. 88, 4504-4513 (2014).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523, 366-369 (2015).
  22. Serrao, E., et al. Integrase residues that determine nucleotide preferences at sites of HIV-1 integration: implications for the mechanism of target DNA binding. Nucleic Acids Res. 42, 5164-5176 (2014).
  23. Aiyer, S., et al. Structural and sequencing analysis of local target DNA recognition by MLV integrase. Nucleic Acids Res. 43, 5647-5663 (2015).
  24. Ciuffi, A., et al. A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nat. Med. 11, 1287-1289 (2005).
  25. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12036-12041 (2013).
  26. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J. Virol. 87, 12721-12736 (2013).
  27. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell Rep. 5, 886-894 (2013).
  28. Demeulemeester, J., et al. HIV-1 integrase variants retarget viral integration and are associated with disease progression in a chronic infection cohort. Cell Host Microbe. 16, 651-662 (2014).
  29. Meehan, A. M., et al. LEDGF/p75 proteins with alternative chromatin tethers are functional HIV-1 cofactors. PLoS Pathog. 5, e1000522(2009).
  30. Ferris, A. L., et al. Lens epithelium-derived growth factor fusion proteins redirect HIV-1 DNA integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 3135-3140 (2010).
  31. Gijsbers, R., et al. LEDGF hybrids efficiently retarget lentiviral integration into heterochromatin. Mol. Ther. 18, 552-560 (2010).
  32. Aiyer, S., et al. Altering murine leukemia virus integration through disruption of the integrase and BET protein family interaction. Nucleic Acids Res. 42, 5917-5928 (2014).
  33. Jahner, D., Jaenisch, R. Integration of Moloney leukaemia virus into the germ line of mice: correlation between site of integration and virus activation. Nature. 287, 456-458 (1980).
  34. Stevens, S. W., Griffith, J. D. Human immunodeficiency virus type 1 may preferentially integrate into chromatin occupied by L1Hs repetitive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5557-5561 (1994).
  35. Wang, G. P., Ciuffi, A., Leipzig, J., Berry, C. C., Bushman, F. D. HIV integration site selection: analysis by massively parallel pyrosequencing reveals association with epigenetic modifications. Genome Res. 17, 1186-1194 (2007).
  36. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic Acids Res. 36, e49(2008).
  37. Roth, S. L., Malani, N., Bushman, F. D. Gammaretroviral integration into nucleosomal target DNA in vivo. J. Virol. 85, 7393-7401 (2011).
  38. Ciuffi, A., Barr, S. D. Identification of HIV integration sites in infected host genomic DNA. Methods. 53, 39-46 (2011).
  39. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117, 3113-3122 (2011).
  40. Matreyek, K. A., et al. Host and viral determinants for MxB restriction of HIV-1 infection. Retrovirology. 11, 90(2014).
  41. Ciuffi, A., et al. Methods for integration site distribution analyses in animal cell genomes. Methods. 47, 261-268 (2009).
  42. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39, e72(2011).
  43. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol. Biol. 1185, 321-344 (2014).
  44. Page, K. A., Landau, N. R., Littman, D. R. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64, 5270-5276 (1990).
  45. Emi, N., Friedmann, T., Yee, J. K. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 65, 1202-1207 (1991).
  46. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
  47. Goff, S., Traktman, P., Baltimore, D. Isolation and properties of Moloney murine leukemia virus mutants: use of a rapid assay for release of virion reverse transcriptase. J. Virol. 38, 239-248 (1981).
  48. Willey, R. L., et al. In vitro mutagenesis identifies a region within the envelope gene of the human immunodeficiency virus that is critical for infectivity. J. Virol. 62, 139-147 (1988).
  49. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  50. Brussel, A., Sonigo, P. Analysis of early human immunodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of a new sensitive assay for quantifying integrated provirus. J. Virol. 77, 10119-10124 (2003).
  51. Serrao, E., Ballandras-Colas, A., Cherepanov, P., Maertens, G. N., Engelman, A. N. Key determinants of target DNA recognition by retroviral intasomes. Retrovirology. 12, 39(2015).
  52. Maldarelli, F., et al. HIV latency. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345, 179-183 (2014).
  53. Wagner, T. A., et al. HIV latency. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345, 570-573 (2014).
  54. Cohn, L. B., et al. HIV-1 integration landscape during latent and active infection. Cell. 160, 420-432 (2015).
  55. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the QubitTM RNA HS assay using RNA spike-in. BMC Mol. Biol. 16, 9(2015).
  56. Padmanaban, A., Walker, D. M. Analysis of high molecular weight genomic DNA using the Agilent 2200 TapeStation and genomic DNA ScreenTape. Publication number 5991-1797EN Agilent Technologies. , Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA. (2013).
  57. Kapa library quantification technical guide version v1.14. , KapaBiosystems. Boston, MA. (2014).
  58. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 12, 656-664 (2002).
  59. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  60. Gaur, M., Leavitt, A. D. Mutations in the human immunodeficiency virus type 1 integrase D,D(35)E motif do not eliminate provirus formation. J. Virol. 72, 4678-4685 (1998).
  61. Varadarajan, J., McWilliams, M. J., Hughes, S. H. Treatment with suboptimal doses of raltegravir leads to aberrant HIV-1 integrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 14747-14752 (2013).
  62. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12, 996-1006 (2002).
  63. Berry, C. C., et al. Estimating abundances of retroviral insertion sites from DNA fragment length data. Bioinformatics. 28, 755-762 (2012).
  64. Firouzi, S., et al. Development and validation of a new high-throughput method to investigate the clonality of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites. Genomic Med. 6, 46(2014).
  65. Mitchell, R. S., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2, E234(2004).
  66. Schneider, T. D., Stormo, G. D., Gold, L., Ehrenfeucht, A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. J. Mol. Biol. 188, 415-431 (1986).
  67. Langmead, B. Chapter 11, Unit 11. 17, Aligning sort sequencing reads with Bowtie. Curr. Protoc. Bioinformatics. , (2010).
  68. LaFave, M. C., Varshney, G. K., Burgess, S. M. GeIST: a pipeline for mapping integrated DNA elements. Bioinformatics. 31, 3219-3221 (2015).
  69. Hocum, J. D., et al. VISA - Vector Integration Site Analysis server: a web-based server to rapidly identify retroviral integration sites from next-generation sequencing. BMC Bioinformatics. 16, 212(2015).
  70. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15, 1431-1436 (2009).
  71. TruSeq Library Prep Pooling Guide. Guidelines for pooling TruSeq libraries for Illumina sequencing systems that require balanced index combinations. , Source: https://support.illumina.com/downloads/truseq-library-prep-pooling-guide-15042173.html (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Retroviral Integration SitesLigation mediated PCRNext generation SequencingGenomic DNA MappingRestriction Enzyme DigestionSonication FragmentationDNA End RepairSemi nested PCRBLAT Genome MappingBEDTools Analysis

İlgili makaleler