Method Article

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

DOI:

10.3791/53840

⸱

March 22nd, 2016

 ,  , 
1Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA, The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hem yerel hem de küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi imza entegrasyonu tercihleri. Burada, ligasyon aracılı PCR (LM-PCR) amplifikasyonu ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanılarak retroviral entegrasyon sitelerin çeşitli kütüphanelerin (1) nesil için ayrıntılı bir protokol, (2) Her virüs- genomik konumunu haritalama sunuyoruz kavşak BEDTools kullanarak ve (3) İstatistiksel alaka için verileri analiz ev sahipliği yapmaktadır. enfekte olmuş hücrelerden özütlendi genomik DNA sınırlama enzimleri ile ya da sonikasyon ile sindirme ile parçalanır. uygun bir DNA son tamir sonra çift şeritli bir DNA bağlayıcılar uçlarına bağlanır ve yarı iç içe PCR virüsü uzun terminal tekrar (LTR) sonu ile bağlanmış bağlayıcı DNA hem de tamamlayıcı primerler kullanılarak gerçekleştirilir. PCR primerleri ayrı adaptör ligasyonu ihtiyacını inkâr NGS sırasında DNA kümeleme için gereken dizileri taşırlar. Kalite kontrol (KK) DNA fragmanı boyutu dağılımına değerlendirmek ve uyum için yapılırNGS önce bir DNA dahil edilmesini er. Dizi çıkış dosyaları LTR içeren okur için filtre edilir ve LTR ve bağlayıcı tanımlayan diziler uzakta kırpılır. Ayıklanmış konakçı hücre dizileri blat kullanarak bir referans genom eşlenir ve referans genom içinde benzersiz bir noktaya minimum% 97 kimlik filtrelenir. Benzersiz entegrasyon siteleri çeşitli genomik özelliklere bitişik nükleotid (nt) sekansı ve dağıtım akrabası için irdelenmektedir. Bu protokol kullanılarak, yüksek bir karmaşıklık entegre edilen kütüphaneler üç günde genomik DNA'dan yapılabilir. entegre edilen analiz duyarlı doku kültürü hücreleri eksojen viral enfeksiyon kapsamına almaktadır, tüm protokol, bu nedenle, yaklaşık bir ila iki hafta içinde yapılabilir. Bu teknolojinin son uygulamalar, HIV ile enfekte olmuş hastalardan alınan entegrasyon sitelerinden uzunlamasına analizi ile ilgilidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

konakçı hücre genomuna viral DNA (vDNA) Entegrasyon retroviral yaşam döngüsünde önemli bir adımdır. Entegrasyon stabil eklenen Provirüsün 1 kurulmasına yol açan iki ayrı katalitik işlemlerini yürütür viral enzim integraz (IN) tarafından gerçekleştirilir. Alt birimlerin bir in multimer 2-4 tarafından bir arada tutulan uçları vDNA ile üst düzey intasome oluşturan, ters transkripsiyon yoluyla üretilen doğrusal vDNA uçlarını meşgul. Yararak İÇİNDE 3'-işleme olarak bilinen bir süreçte dizilerin 3 'aşağı değişmez 5'-CA-3 den vDNA uçları', '3 girintili bırakarak her vDNA terminalinde 5-8 reaktif hidroksil grupları ile son....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüs stokları oluşturmak 1.

Not: Bu protokol ıslak tezgah yönünün bir akış şemasıdır, Şekil 1 'de gösterilen viral hazır üretimi ve doku kültürü hücrelerinin sonraki enfeksiyon detayları genel retrovirüslerin farklı için geçerli olacaktır.. Bazı deneyler için, hedef hücre, endojen virüs reseptörü (ler) i eksprese olabilir, ve bu gibi durumlarda heterolog viral zarf glikoproteinini barındıran pseudotyped retroviral parçacıklar yapılar örn veziküler stomatit virüsü (VSV-G) G glikoprotein olacak enfeksiyon 44,45 için gerekli.

Not: önlemlerin alınması gerekir, HIV-1 ile çalı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablo 4, bir temsili örneğin sonuçları tarafından enfekte olmuş hücrelerin bir kültüründen entegrasyon sitesi geri kazanılması için NGS duyarlılığını göstermek için. Enfekte olmamış hücresel DNA seri ortalama her bir hücre, bir entegrasyon 40 ihtiva eden bir enfeksiyon genomik DNA seyreltmek için kullanıldı. 15.625: Seyreltiler 1 bir maksimum seyreltme beş adımda hazırlanmıştır. titrasyon serisinin Genomik DNA daha sonra sonikasyon ile parçalanmış ya da kısıtl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomik dağılım örnekleri eşleme yoluyla başlangıç ​​virüs enfeksiyonu aşama retroviral entegrasyonu sitelerinin analizi için bir protokol, tarif edilmektedir. Bu protokol, bir retrovirüs ve bir infectable hücre tipine uygulanabilir. Bundan başka, deney boru hattı 6.4 x 10 -5 MOI ile başlatılmış bir enfeksiyon edilene Genomik DNA, eşdeğer seri seyreltmeleri benzersiz entegrasyon sitelerinden tatmin edici bir dizi geri potansiyeline sahip, çok hassastır. hücrelerin sadece küçük bir bölümü, entegre provirüsünü .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Engelman laboratuarında retroviral entegrasyon sitesi sıralama için NGS protokolünü kurmak için kritik meslektaşlarımızla Stephen Hughes ve tavsiye için Henry Levin minnettarız. Bu çalışma AI039394 ve (ANE kadar) AI052014 ve AI060354 (AIDS Araştırma Harvard Üniversitesi Merkezi) ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco11965-084HEK293T hücrelerle uyumlu standart hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır SerumuThermo ScientificSH 30088.03Optimal viral üretim için farklı serum lotlarının ön taramaya tabi tutulması gerekebilir
Penisilin / StreptomisinCorning30-002-ClMediatech'e eklenecek antibiyotikler
21-040-CVHücreleri yıkamak için kullanılır
Tripsin EDTACorning25-053-CIDoku kültürü plakalarından yapışan hücreleri ayırmak için kullanılır
PolyJetSignaGen LaboratuvarlarıSL100688DNA transfeksiyon reaktifi
0.45 &mikro; m FiltrelerThermo Scientific09-740-35BVirüs partikülü içeren hücre kültürü ortamını filtrelemek için kullanılır
Turbo DNaseAmbionAM2239Virüs stoklarından taşınan plazmid DNA'yı parçalamak için kullanılır
HIV-1 p24 Antijen Yakalama TestiABL Inc.5447Virüs üretiminin verimini ölçmek için kullanılır
DNeasy Blood & Doku KitiQiagen69506Hücrelerden genomik DNA'yı saflaştırmak için kullanılır
SonicatorCovarisS2Bu sonikatör modeli ile iki tur görev döngüsü gerçekleştirin,% 5; yoğunluk, 3; patlama başına döngü, 200; süre, 80 sn
Nükleaz İçermeyen SuGeneMateG-3250-125Numune çapraz kontaminasyon olasılığını azaltmak için ticari olarak temin edilebilen su önerilir
QIAQuick PCR Saflaştırması KitQiagen28106Kütüphane yapımı sırasında DNA'yı saflaştırmak için kullanılır
End-It DNA End-Repair KitEpicentreER81050Sonikasyonlu DNA örneklerinin DNA uçlarını onarmak için kullanılır
Klenow Parçası (3'-5' ekzo–)New England Biolabs (NEB)M0212SdATP ile A kuyruğuna onarılmış DNA fragmanları için kullanılır
dATPThermo ScientificR0141Deoksiadenozin trifosfat
MseINEBR0525LGenomik DNA bölünmesi için kısıtlama endonükleazı
BglIINEBR0144LYukarı akış HIV-1 U5 dizisi T4 DNA Ligazının amplifikasyonunu baskılamak için kısıtlama endonükleazı
NEBM0202L/6218Uyumlu DNA uçlarının kovalent birleştirilmesi için enzim
DNA OligonükleotidlerEntegre DNA TeknolojileriözelŞirketin oligoları saflaştırmasını sağlayın. HPLC saflaştırma DNA'lar için yeterlidir < 30 nükleotid; SAYFA daha uzun DNA'ları saflaştırır 
Avantaj 2 Polimeraz KarışımıClontech639202için DNA polimeraz içeren ticari karışım
(100 mM çözeltiler)Thermo ScientificR0181Her biri 2,5 mM'lik ara konsantrasyonlara ulaşmak için buz üzerindeki dört kimyasalı steril su ile seyreltin DNA
konsantrasyonunun
belirlenmesi için dNTP NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000 SpektrofotometreQubit FlorimetreYaşam TeknolojileriQubit® 3.0Entegrasyon sitesi kitaplığını doğrulamak için kullanılan florometre DNA konsantrasyonu
2200 TapeStation SistemiAgilentG2964AAEntegrasyon sitesi kitaplığını doğrulamak için bant tabanlı test DNA boyut dağılımı
MiSeqIlluminaSY-410-1003NGS için kullanılır
DMEM Fosfat Tamponlu salin PCR dNTP'ler

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890(2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retroviral Integration SitesLigation mediated PCRNext generation SequencingGenomic DNA MappingRestriction Enzyme DigestionSonication FragmentationDNA End RepairSemi nested PCRBLAT Genome MappingBEDTools Analysis

Related Articles