DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas9 teknolojisine sahip vektörler tarafından üretilen hedeflenmiş DNA mutasyonlarının, fonksiyonel genomik çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Çoğu klonlama stratejisinin gerçekleştirilmesi basit olsa da, genellikle birden fazla adım kullanırlar ve nihai yapıları oluşturmak için birkaç gün sürebilirler. Burada sunulan yöntem, DNA montajına dayanır ve tek bir klonlama reaksiyonunda tamamen işlevsel CRISPR vektörleri üretebilir. Vektör yapımı da bir havuzda toplanabilir, bu da sürecin verimliliğini ve faydasını daha da artırır. Yöntemin bir modifikasyonu, birden fazla gen hedefine sahip CRISPR vektörleri oluşturmak için kullanılır. CRISPR vektörleri daha sonra hedeflenen DNA modifikasyonları ile transgenik materyaller üretmek için domates tüylü köklere dönüştürülür. Tüylü kökler, teknik olarak üretilmesi basit ve büyük ölçekli üretime uygun oldukları için vektör işlevselliğini test etmek için kullanışlı bir sistemdir. Burada sunulan yöntemler, çeşitli CRISPR vektörleri oluşturmak için kullanılabilecekleri ve çok çeşitli bitki türlerinde kullanılabilecekleri için geniş bir uygulama alanına sahip olacaktır.
Giriş
CRISPR ile hedeflenen DNA değişiklikleri oluşturmak için yeteneği / Cas9 işlevsel genomik çalışmalar için büyük bir potansiyele sahiptir. CRISPR / Cas9 sisteminin iki bileşeni vardır; Staphylococcus pyogenes ve hedefli DNA ekibi (s, 1) Cas9 yönlendiren bir yaklaşık 100 nt kılavuz RNA (gRNA) molekülünden türetilen Cas9 nükleaz. Hedef tanıma, ilk olarak haiz ~ hedefleme vektörleri 2,3 yüksek kapasiteli bir üretim sağlayan gRNA, 20-nt. Tasarlanmış olabilir Çoğu organizmalar, zaten CRISPR / Cas9 teknolojisi 4,5 ile olmuştur.
Bitkiler, CaMV 35S promotörü gibi yapısal promotörler, in, genel olarak Cas9 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kılavuzu RNA Tasarım ve Vektör İnşaat
- ilgi genleri hedef sekansları tanımlamak. Bu adımda 13,14 için uygun çevrimiçi CRISPR hedef bulma çeşitli programlar vardır.
NOT: Burada GN 20 GG hedef motifi kullanmak, ancak diğer tasarımlar kullanılan uygulama veya vektör sistemine bağlı olarak uygun olabilir. - Tasarım 60-mer gRNA oligo DNA montaj için gerekli olan 5 ile çevrili hedef motifleri 've 3' 20 nt dizileri GN 19 bölümünü kapsayacak şekilde. Son 60-mer motifi: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
NOT: Standart desalted primerler iyi çalışır. - M....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
DNA, montaj ile CRISPR vektör oluşturulması, tipik olarak, bağımsız klondan On ila yüzlerce oluşturur. PCR ile koloni taraması kolayca doğru klonlar tanımlar ve ve sorun giderme için kullanışlıdır ekler (Şekil 2A) olmadan plazmidler ayırt edebilirsiniz. Tipik olarak, klonların hepsi bir ek içeren ve bir kullanıcı tamamen koloni tarama adımlarını atlamak için tercih edebilir. Teşhis dijestleri (Şekil 2B) ve Sanger dizileme kalite kontrolü için kullanılır........
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
DNA düzeneği, örtüşen DNA dizilerini yeniden birleştirmek için kullanıldığından, bu klonlama yöntemi herhangi bir CRISPR vektör yapısına uygulanabilir. Çoğu CRISPR klonlama şeması, ya gRNA'nın gen sentezini, tip IIS kısıtlama enzimlerini17,18 ya da örtüşme uzatmalı PCR19'u kullanır. Bu tekniklerin her birinin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır, ancak genellikle birden fazla uygulamalı klonlama adımı gerektirirler. Burada sunulan klonlama yönteminin birincil avantajı, tüm sürecin tek, .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu araştırma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-1025642 (GBM) tarafından desteklenmiştir. Biz ARqua1 gerginlik sağlamak için Maria Harrison teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| NEBuilder® (HiFi DNA montaj karışımı) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | p201H:Cas9 plazmidi (59176) ayrıca bildirilen örtüşmeler ve enzimlerle de uyumludur. |
| pUC gRNA Mekik | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo temiz ve yoğunlaştırıcı-5 sütun saflaştırma | Zymo Araştırma | D4003 | |
| NEB Tampon 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Tampon 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Tampon 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Kolonu (plazmid hazırlığı) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Tuzları + Gamborg Vitaminleri | Fitoteknoloji Laboratuvarları | M404 | |
| Phytagel & Trade; (gellan sakızı) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Kutuları | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Mikro gözenek ve ticaret; cerrahi bant | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Tikarsilin/Klavulanik asit) | Çeşitli | 0029-6571-26 | |
| Primerler 5' & #8594; 3'SwaI_MtU6F | |||
| GATATTAATCTTCGATGA AATTTATGCCTATTATTAT GATCAATGAGG | |||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG | ||
| İskeleF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT | ||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG | Plazmid üzerinde ikinci bir bağlanma bölgesi olduğundan Sanger dizilemesi için kullanılamaz | |
| GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG | |||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Kalın diziler, doğrusallaştırılmış p201N:Cas9 ile 20-nt örtüşmelerini gösterir. |
Kaynaklar
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
