Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Summary

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Abstract

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas9 teknolojisine sahip vektörler tarafından üretilen hedeflenmiş DNA mutasyonlarının, fonksiyonel genomik çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Çoğu klonlama stratejisinin gerçekleştirilmesi basit olsa da, genellikle birden fazla adım kullanırlar ve nihai yapıları oluşturmak için birkaç gün sürebilirler. Burada sunulan yöntem, DNA montajına dayanır ve tek bir klonlama reaksiyonunda tamamen işlevsel CRISPR vektörleri üretebilir. Vektör yapımı da bir havuzda toplanabilir, bu da sürecin verimliliğini ve faydasını daha da artırır. Yöntemin bir modifikasyonu, birden fazla gen hedefine sahip CRISPR vektörleri oluşturmak için kullanılır. CRISPR vektörleri daha sonra hedeflenen DNA modifikasyonları ile transgenik materyaller üretmek için domates tüylü köklere dönüştürülür. Tüylü kökler, teknik olarak üretilmesi basit ve büyük ölçekli üretime uygun oldukları için vektör işlevselliğini test etmek için kullanışlı bir sistemdir. Burada sunulan yöntemler, çeşitli CRISPR vektörleri oluşturmak için kullanılabilecekleri ve çok çeşitli bitki türlerinde kullanılabilecekleri için geniş bir uygulama alanına sahip olacaktır.

Introduction

CRISPR ile hedeflenen DNA değişiklikleri oluşturmak için yeteneği / Cas9 işlevsel genomik çalışmalar için büyük bir potansiyele sahiptir. CRISPR / Cas9 sisteminin iki bileşeni vardır; Staphylococcus pyogenes ve hedefli DNA ekibi ^{(s, 1)} Cas9 yönlendiren bir yaklaşık 100 nt kılavuz RNA (gRNA) molekülünden türetilen Cas9 nükleaz. Hedef tanıma, ilk olarak haiz ~ hedefleme vektörleri ^2,3 yüksek kapasiteli bir üretim sağlayan gRNA, 20-nt. Tasarlanmış olabilir Çoğu organizmalar, zaten CRISPR / Cas9 teknolojisi ^4,5 ile olmuştur.

Bitkiler, CaMV 35S promotörü gibi yapısal promotörler, in, genel olarak Cas9 nükleaz ⁶ ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. gRNAs gRNA ilk taban kısıtlayan RNA polimeraz III U6 ya da U3 promoterler kullanılarak ifade edilir ya G, verimli bir transkripsiyon için U3 U6 veya A için. Ancak RNA polimeraz II baloBu kısıtlamaların ücretsiz oters, aynı zamanda ^7,8 kullanılmıştır.

Farklı gRNAs farklı verimlilik ile DNA mutasyonlarının neden, ve bu yüzden ilk olarak tüm fabrika dönüşümleri yatırım veya kapsamlı fenotipik ekranlar kurmadan önce CRISPR vektörleri doğrulamak için önemli olabilir. CRISPR geçici ifadesi zordur mutasyonlar ve bu yaklaşımlar ile pratik fenotipik deneylerinin algılama hale stabil bitkilerde ⁶ ile karşılaştırıldığında, genel olarak, DNA modifikasyon daha düşük bir frekans ile sonuçlanır örneğin agroinfiltration kullanarak, bitkilerde oluşturur. Sözde saçak kökler stabil bitkiler için ay karşı bağımsız kararlı bir şekilde transforme edilmiş bir malzeme çok sayıda hafta içinde oluşturulabilir çünkü uygun, alternatif sistem vardır. CRISPR vektörleri saçak kök ^9,10 DNA mutasyonlarının uyaran çok etkilidir.

DNA montaj yöntemleri etkin bir şekilde overl içeren DNA parçalarını birbirine bağlamakapping ¹¹ sona erer. Bazı DNA düzeneği yöntemlerinin önemli bir avantajı birleştirilmiş ürünler haline ssDNA (yani, oligolar) dahil yeteneğidir. gRNAs yalnızca ~ 20 nt uzunluğunda ve yeni hedefler sentezlenen oligo yapılabilir için, bu DNA montaj yöntemleri CRISPR klonlama için de uygundur. Burada anlatılan protokollerin başarılı soya ^10, kavak ¹² kullanılan ve şu anda domates edilmiş CRISPR vektörlerinin P201 serisi dayanmaktadır. Sunulan klonlama işlemi geçerli klonlama yöntemiyle ¹⁰ üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor. Yani, tam fonksiyonel vektörler tek bir gün içinde tek bir klonlama reaksiyonda oluşturulabilir. Vektör yapımı daha da eller üzerinde zaman ve malzeme maliyetleri azaltarak, paralel olarak birden fazla CRISPR vektörleri oluşturmak için toplanmış olabilir. Ayrıca hedef gen delesyonlu transjenik malzemeler üretmek için etkili bir yöntem olarak, domates saçak kök oluşumu için bir protokol mevcut. Saçak kök geçerlidir için kullanılırCRISPR vektörleri yedik ve daha sonraki deneyler için malzeme sağlamak.

Protocol

1. Kılavuzu RNA Tasarım ve Vektör İnşaat

1. ilgi genleri hedef sekansları tanımlamak. Bu adımda ^13,14 için uygun çevrimiçi CRISPR hedef bulma çeşitli programlar vardır.
   NOT: Burada GN ₂₀ GG hedef motifi kullanmak, ancak diğer tasarımlar kullanılan uygulama veya vektör sistemine bağlı olarak uygun olabilir.
2. Tasarım 60-mer gRNA oligo DNA montaj için gerekli olan 5 ile çevrili hedef motifleri 've 3' 20 nt dizileri GN ₁₉ bölümünü kapsayacak şekilde. Son 60-mer motifi: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
   NOT: Standart desalted primerler iyi çalışır.
3. Montaj için, dört DNA (Şekil 1) hazırlayın. DNA dizileri için ek dosyasına bakın.
   1. 2 saat boyunca 37 ° C'de 1x Tampon 4 kısıtlama enzimi Spe I ile Cas9 ¹⁰ plazmid: p201N 5 ug - 1 Digest. Bir özet Sütun arındırmaküreticinin talimatlarına şeklinizi ona göre. ~ 10 mM Tris-HCI 15 ul içinde süspanse ve UV spektrofotometre ile miktarı belirlenir.
   2. İkinci 2 saat boyunca 25 ° C'de 1x Tampon 3.1 kısıtlama enzimi Swa I ile sindirmek, bir gerçekleştirin. tam sindirim onaylamak için% 0.8 agaroz jel üzerinde ng 200 - 100 kontrol edin.
      NOT: Bir doğru sindirilmiş plazmid 14313 bp tek bir grup var olacaktır. Not: enzim ve defosforilasyon ısı inaktivasyonu gerekli değildir. Sindirilen plazmid, -20 ° C'de saklanabilir.
   3. PCR primerleri Swa I_MtU6F / MtU6R sırasıyla ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR kullanılarak pUC gRNA Shuttle ¹⁰ plazmidden Medicago truncatula (M +), U6 promoteri ve iskele DNA'lar yükseltmek. PCR, aşağıdaki koşullar ile yüksek aslına polimeraz kullanarak: 3 dakika için 95 ° C; 31 döngü (20 saniye 98 ° C, 15 sn için 60 ° C, 30 saniye için 72 ° C); ve 5 dakika için 72 ° C.
      1. PCR pr ~ 3 ul alikotları görselleştirmekbir% 1 agaroz jeli üzerinde oducts amplifikasyon teyit etmek için. MtU6 amplikon 377 bp ve iskele amplikon 106 bp. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, kalan PCR ürünleri Kolon saflaştırmak -20 ° C'de UV spektrofotometrisi ve mağaza tarafından tayin edin.
   4. laboratuvar dereceli su içinde 100 uM gRNA oligos tüm tüp tekrar süspansiyon. 1x Tampon 2.1 500 ul 100 uM oligo 1 ul ekle. İyice karıştırın. Birden fazla oligos havuzu varsa, 1x Tampon 2.1 tüpüne her 100 uM oligo 1 ul ekleyin. Seyreltilmiş oligo -20 ° C'de saklanabilir.
4. ısıtılmış kapak ile, 50 ° C de tutmak için bir termal döngü Program. bir hacme lineer vektör seyreltilmiş gRNA oligo (ler) ve su MtU6 promoteri skafoldun, 12 ng (0.2 pmol), 1 ul (0.2 umol) bir 50 ng (0.2 umol) 100 ng (0.011 umol) birleştirin 5 ul. 2x yüksek sadakat DNA montaj ustası karışımı 5 ul ekleyin iyice karıştırın ve aşağı doğru döndürün. 60 dakika boyunca reaksiyon inkübe50 ° C termal döngü. Daha sonra buz üzerinde reaksiyon yerleştirin.
   Not: Reaksiyon hacimleri düşük DNA verimi karşılamak için artırılabilir.
5. Yeterli E. halinde reaksiyon 2 ul Transform 50 mg L ^-1 kanamisin (Kan ₅₀₎ ile takviye LB standart teknikler ve plaka kullanılarak coli hücreleri. gece boyunca 37 ° C'de kaplanmıştır hücreleri büyütün. -20 ° C'de, kalan DNA düzeneği reaksiyonu kaydedin.
6. primerler StUbi3P218R ve ISceIR kullanılarak PCR ile koloni ekranı. su ile 1 Kalan DNA düzeneği reaksiyonunun bir kısım seyreltilir: 5'tir. no-insert kontrol olarak Cas9 plazmid: pozitif koloni ekranı için kontrol ve dairesel p201N 1 ng olarak 1 ul kullanın.
   1. PCR, aşağıdaki koşullar ile amplifiye; 3 dakika boyunca 95 ° C; 31 döngü (30 saniye için 95 ° C, 30 sn için 58 ° C, 30 saniye için 72 ° C); ve 5 dakika için 72 ° C 'de. bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünleri görselleştirme. Doğru girmeler 725 bp ve vektörler zekâ bir grup olduğundan emin olun(örneğin, kesilmemiş vektör) hout ekler bir 310-bp şeridini sahip olacaktır.
7. 37 ° C'de ₅₀ sıvı kültürler, gece boyunca LB Kan pozitif koloniler büyümek ve üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler saflaştırılması. Sanger sekansı StUbi3P218R astar ile plazmidler ve hata klonlama esnasında katılan emin olmak için MtU6 promotörü, hedef, ve iskele dizilerine kromatogramlar hizalayın.
8. Bir teşhis Eco RV ve Sty I ile plazmid ~ 1 mikrogram sindirerek sindirmek gerçekleştirin % 0.8 agaroz jeli üzerinde görselleştirme. (Bp olarak) parçalarıdır: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, ve 174.
9. Birden fazla gRNAs ile vektörleri oluşturmak için DNA donanımını kullanın.
   1. İki gRNA kasetler ile bir vektör yapılandırmak için, PCR, ilgili her birinden 1 ng primer UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR olan primerler Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR ve ikinci pozisyonlar gRNA ile birinci pozisyon gRNA amplifiye1.8 - plazmidler adımlarla 1.1 inşa edilmiştir. Aşama 1.3.3 PCR koşulları kullanarak. amplifikasyon teyit etmek için bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünlerinin ~ 3 ul alikotları görselleştirmek. Amplıkonlar ~ 500 bp.
   2. Birleştirin ve 200 ul bir tüp içinde un saflaştırılmış PCR ürünleri, yaklaşık olarak eşit miktarda karışımı (tipik olarak 3 - her 4 ul). Montaj için, PCR ürünleri kombine 1 ul, Swa I 50 ng ekleyebilir ve Spe I p201N linearize: Cas9, laboratuvar dereceli su 2.5 ul ve 2x yüksek kalitede DNA montaj ustası karışımı 2.5 ul. 15 dakika boyunca 50 ° C termal döngüleyici içinde inkübe edin.
      Not: DNA montaj kılavuzları 2 için 15 dakika inkübasyon önerir - 3 fragmanları.
   3. Yeterli E. içine 2 ul 1 - Dönüşümü LB Kan ₅₀ koli hücreleri ve plaka. gece boyunca 37 ° C 'de, tabakalanmış hücrelere büyütün. -20 ° C'de, kalan reaksiyon kaydedin.
   4. Aşama 1.6 ile aynı koşullarda primerler StUbi3P218R ve ISceIR PCR ile koloni ekranı. doğru cLones 1200 bp amplikon sahip olacaktır. LB Kan olumlu koloniler ₅₀ sıvı kültürleri bir gecede büyümek ve plazmidler arındırmak.
   5. primerler StUbi3P218R ile Sanger dizisi plazmidler (ilk pozisyon gRNA kapsar) ve p201R (ikinci pozisyon gRNA kapsar). MtU6 promotörü, hedef, ve iskele dizilerine kromatogramlar hizalayın. Teşhis Eco RV ile sindirmek ve Sty I (bp olarak) aşağıdaki parçaları neden olur: 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Koyu renk fragman ikinci gRNA içerir.
10. Agrobacterium suşu ARqua1 ¹⁵ rhizogenes içine tüm kalite kontrol beklentilerinin karşılanması sonrasında, plazmid dönüşümü. ayarları ile 1 mm küvet içinde elektro uyumlu hücre ile elektroporasyona 50 ul plazma preparatı 1 ul ekleyin: 2.4 kV, 25 | iF ve 200 w. SOC ~ 500 ul hücre yeniden elde etmek ve 2 saat boyunca 28 ° C'de çalkalanır. LB Kan ₅₀ ve g Plaka2 gün boyunca 28 ° C 'de sıra. 1.3.3 ile aynı primerler ve PCR koşulları kullanılarak koloni ekranını gerçekleştirin. Pozitif klonlardan gliserol stokları sağlayın.

2. Tüylü Kök Dönüşüm

1. sabit karıştırma ile 15 dakika boyunca% 20 ev tipi ağartıcı içinde domates tohumu sterilize edin. bir laminar akış başlığı içinde, çamaşır suyu kaldırmak ve steril laboratuar dereceli suda 3 kez yıkayın.
2. ½ MS ortamı (2.22 g ^L-1, MS tuzları + Gamborg vitaminleri, 10 g ^L-1 sukroz, 3 g ^L-1 gellan zamkı, pH 5.8) ihtiva eden bir GA-7 kutu içinde levha 30 tohumları. Karanlıkta 2 ~ için gün çimlenme, daha sonra ışığa GA-7 kutularını taşıyın. ışığında ~ 4 gün daha fidan büyür.
3. Dönüşüm gün önce, çizgi dışarı A. Katı LB Kan ₅₀ kültürleri rhizogenes ve gece boyunca 28 ° C'de büyür.
4. dönüşümün Günü, laminer akış kaputu steril malzemeler monte: 12 ml kültür tüpleri, 50 ml konik tüp, ½ MS sıvı (yok gellan gum), 200 uM asetosiringon, filtre kağıdı, petri, forseps ve neşter, pipetler ve pipet uçları. ½ MS 50 ml asetosiringon 25 ul ilave edin ve her kültür tüpü içine ~ 6 mL dökün.
5. A. kazımak için bir bükülmüş 200 ul ucu kullanın ½ MS sıvının 6 ml plaka ve tekrar süspansiyon ile ilgili rhizogenes hücreleri. Vortex tüpü tamamen hücreleri tekrar süspansiyon. Her bir vektör hücrelerin tekrar asılı tutulmasından sonra, 600 nM'lik bir sabit dalga uzunluğunda hücre 1 ml optik yoğunluk (OD) ölçün. OD 0.2 ve 0.4 arasında olmasını sağlayın; sulandırmak veya gerektiği gibi daha fazla hücre ekleyin. Her bir yapı için tekrarlayın.
6. steril bir filtre kağıdı ile bir Petri kabı ½ MS sıvı ~ 2 ml ekleyin. nemlendirilmiş filtre kağıdı üzerinde fide ve yerden tüketim kotiledon. Bir kez tüm kotiledon toplanmıştır, iki kesim uçları ile kotiledon parçaları sonuçlanan kotiledon kapalı distal ~ 1 cm kesti. A. eksplantlar ekle rhizogenes çözeltiler, karıştırın ve 20 dakika boyunca inkübeara sıra invertli.
   Not: yapı için yaklaşık 12 eksplant rutin kullanılan, çok sayıda 80 eksplantlar A. 6 ml aşılanmış olsa rhizogenes çözüm.
7. A. sırasında rhizogenes inkübasyon, Petri için filtre kağıdı eklemek, bir başına yapı dönüştürdü. Ayrıca kuru laminer akış kaputu, ½ MS katı ortam, hiçbir antibiyotik ayarlayın.
8. A. dışarı kotiledon Scoop Kuru filtre kağıdı üzerinde steril forseps ve yer ile rhizogenes çözüm. Bir sonraki dönüşüm ilerlerken kurumasına yok dokuları sağlamak için Petri kapakla kapatın. Filtre kağıdı ve transferi, alt yüzey tarafında yukarı, üzerinde Blot kotiledon MS ortamı ½. ameliyat bandı ile plakaları sarın 2 gün oda sıcaklığında karanlıkta CO-geliştirin.
9. Kadar ko-kültivasyonu, transfer kotiledonlar, alt yüzey tarafında sonra, MS ortamı (300 mg ^L-1 tikarsilin / klavulanik asit Tim ₃₀₀ takviye ½ artık kısmından gelişmesini önlemek içinual A. rhizogenes) ve bitki seçimi için Kan ₅₀ () ve cerrahi bant ile sarın. 16 saat fotoperiyodun oda sıcaklığında floresan ışıkları altında kültürleri korumak.
10. Uzunluğu 2 hafta kökleri en az 2 cm, steril forseps ve bir neşter kullanarak kotiledonlar kesilmiş ve MS Kan ₅₀ Tim ₃₀₀ ortamı ½ aktarılır - ~ 1.5 sonra. Tek bir plaka 10 ila 15 kökleri aktarın. Bir işaretleyici ile kök uçları konumunu işaretlemek cerrahi bant ile sarın ve kültür odasında korumak.
11. Bir hafta sonra, dönüştürülmüş kök seçici ortam üzerinde büyüme görülür. Tercih DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılarak DNA ekstraksiyonu için dönüştürülmüş köklerinin altörneğini hasat. Not: kotiledon ile Tabaklar 2 saklanabilir - kökleri karışık karmaşa içine büyümeye işaret ve izole etmek zordur, bundan sonra 3 haftalık hasat. Sigara hasat kök dokuları süresiz muhafaza edilebilir. birçok analiz izole edilmiş bir DNA örneği üzerinde gerçekleştirilebilirs DNA mutasyon sıklığı ve türünü belirlemek için. Birkaç tür deneylerde elde edilen sonuçlar aşağıda tarif edilmiştir.

Results

DNA, montaj ile CRISPR vektör oluşturulması, tipik olarak, bağımsız klondan On ila yüzlerce oluşturur. PCR ile koloni taraması kolayca doğru klonlar tanımlar ve ve sorun giderme için kullanışlıdır ekler (Şekil 2A) olmadan plazmidler ayırt edebilirsiniz. Tipik olarak, klonların hepsi bir ek içeren ve bir kullanıcı tamamen koloni tarama adımlarını atlamak için tercih edebilir. Teşhis dijestleri (Şekil 2B) ve Sanger dizileme kalite kontrolü için kullanılır....

Discussion

DNA düzeneği, örtüşen DNA dizilerini yeniden birleştirmek için kullanıldığından, bu klonlama yöntemi herhangi bir CRISPR vektör yapısına uygulanabilir. Çoğu CRISPR klonlama şeması, ya gRNA'nın gen sentezini, tip IIS kısıtlama enzimlerini^17,18 ya da örtüşme uzatmalı PCR^19'u kullanır. Bu tekniklerin her birinin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır, ancak genellikle birden fazla uygulamalı klonlama adımı gerektirirler. Burada sunulan klonlama yönteminin birincil avantajı, tüm sürecin tek, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (HiFi DNA montaj karışımı)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	p201H:Cas9 plazmidi (59176) ayrıca bildirilen örtüşmeler ve enzimlerle de uyumludur.
pUC gRNA Mekik	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo temiz ve yoğunlaştırıcı-5 sütun saflaştırma	Zymo Araştırma	D4003
NEB Tampon 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Tampon 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Tampon 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Kolonu (plazmid hazırlığı)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Tuzları + Gamborg Vitaminleri	Fitoteknoloji Laboratuvarları	M404
Phytagel & Trade; (gellan sakızı)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Kutuları	Sigma Aldrich	V8505
Mikro gözenek ve ticaret; cerrahi bant	3M	1535-0
Timentin® (Tikarsilin/Klavulanik asit)	Çeşitli	0029-6571-26
Primerler 5' & #8594; 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTTCGATGA AATTTATGCCTATTATTAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
İskeleF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Plazmid üzerinde ikinci bir bağlanma bölgesi olduğundan Sanger dizilemesi için kullanılamaz
	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Kalın diziler, doğrusallaştırılmış p201N:Cas9 ile 20-nt örtüşmelerini gösterir.