Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

15.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53846

⸱

25 Mart 2016

 , 
1Immunity, Microenvironment, Virus, Cancer Research Center in Lyon

Bu makalede

Özet

Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresi türüdür. Nötrofillerin insan kanından yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile izolasyonu ve insan promiyelositik (HL60) hücrelerinin granülositik yol boyunca farklılaşması burada açıklanmaktadır; lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü test etmek.

Özet

Nötrofiller, en bol bulunan (%40 ila %75) beyaz kan hücresi türüdür ve iltihap bölgesine doğru göç eden ilk enflamatuar hücreler arasındadır. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminde kilit oyunculardır ve kanser biyolojisinde önemli roller oynarlar. Nötrofiller, malign transformasyon, tümör progresyonu, anjiyogenez ve antitümör bağışıklığının modülasyonunda anahtar mediatörler olarak önerilmiştir; çözünür faktörlerin salınması veya tümör hücreleri ile etkileşimleri yoluyla. Nötrofillerin spesifik fonksiyonlarını karakterize etmek için, nötrofillerin insan kanından in vitro izolasyonu için hızlı ve güvenilir bir yöntem rağbet görmektedir. Burada, nötrofillerin yanı sıra mononükleer hücreleri kandan izole etmek için bir yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gösterilmiştir. Prosedür, kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı konan hastalardan elde edilen seyreltilmiş kanın üzerine Ficoll gibi yoğunluk gradyan solüsyonunun dikkatlice katmanlanması, ardından santrifüjleme, mononükleer tabakanın izolasyonu, nötrofillerin eritrositlerden dekstran ile ayrılması ve ardından rezidüel eritrositlerin parçalanmasından oluşur. Bu yöntemin nötrofilleri %90 saflıkta izole ≥ gösterilmiştir. Tümör mikroçevresini taklit etmek için, Matrigel gibi bazal membran matrisi kullanılarak 3 boyutlu (3D) deneyler yapıldı. Nötrofillerin in vitro kısa yarı ömrü göz önüne alındığında, taze insan nötrofilleri ile 3D deneyler yapılamaz. Bu nedenle promiyelositik HL60 hücreleri, dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) farklılaşma indükleyicileri kullanılarak granülositik yol boyunca farklılaşır. Deneylerimizin amacı, nötrofillerin lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü incelemektir. Bununla birlikte, bu yöntemler, nötrofillerin veya nötrofil benzeri hücrelerin farklı durumlarda çok çeşitli hücre tipleri ile etkileşimlerini incelemek için genelleştirilebilir.

Giriş

Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, tümör mikro içindeki hücrelerin önemli bir kısmını oluşturmaktadır ve hastalar ve kanser 1 hayvan modellerinde tümör kanser ile ilişkilidir. Son zamanlarda, daha yaygın kronik immün yanıtları kemoterapiler 2 tümör ilerlemesi, metastaz ve direnç teşvik kritik bir rol oynayan takdir haline gelmiştir. Makrofajlar ile doğrudan kemoterapi 3,4 tümör hücresi yanıtı düzenleyen gösterilmiştir önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, anti-kanser tedavisine, tümör yanıtı düzenleyen nötrofillerin, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde anahtar oyuncular rolü bilinmemektedir. Bu protokollerin amacı KLL hastanın kan örneklerinden nötrofil ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem kullanmak ve anti-lenfoma ajanlara lenfoma hücrelerinin duyarlılığını düzenleyen rollerini araştırmak için granülositik yol boyunca HL60 hücreleri ayırt etmek vardır.

Nötrofiller mikroorganizmaları 6 işgalci karşı ilk savunma hattı olarak kan 5 ve hareket doğuştan gelen bağışıklık sisteminin en bol hücresel bileşenidir. Nötrofiller, çeşitli patolojik şartlarda 7 değişken efektör fonksiyonlara ek olarak etkili bir doğuştan gelen bağışıklık yanıtları artan önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gibi diğer kan hücreleri, nötrofillerin izole etmek için, hızlı ve güvenilir bir yöntem olup, in vitro çalışmalar için gereklidir. Nötrofil izolasyonu için, bu yöntem kullanılarak, in vivo ve ex vivo nötrofil aracılığıyla oluşturulan imünolojik fonksiyonları üzerinde daha fazla araştırma kolaylaştıracaktır.

Nötrofillerin saf popülasyonlarının elde etme yeteneği immünolojik hastalıkların 8 hastaların araştırılması için önemli bir ilk adımdır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi hücrelerin yüksek verim elde edildiği bir yere bir tekniktir. methoD ara vermeden 35 dakika boyunca 300 g'de santrifüje edilerek ve ardından seyreltilmiş insan kanı ihtiva eden bir tüpün alt yoğunluk gradyan çözeltisi ilave edilmesini kapsar. mononükleer hücrelerin halka arayüzü görünür ve nötrofiller eski aşağıda bulunur. Bu yöntem, çok daha 9 pahalı nötrofil izolasyon kiti gibi diğer mevcut yöntemlere göre önemli avantajlara sahip. Buna ek olarak, insan nötrofillerinden için spesifik bir yüzey işaretleyici yönelik antikorlar kullanılarak ticari kitler insan kanından nötrofilleri izole hücre aktivasyonunun veya farklılaşmasının riskini arttırır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kısa bir süre içinde, nötrofillerin izolasyonu sağlar. Aynı aşamada içinde, tek çekirdekli hücreler, ayrılmış ve geri kazanılır. Saf hücrelerin yüksek verimi fonksiyonel bütünlüğü elde etmek için elde edildiği bir temel teknik.

Tümör microenv taklit etmek içinironment 3D deneyler gerçekleştirilmiştir. In vitro nötrofil kısa yarı ömürlü göz önüne alındığında, yeni insan nötrofil 3D deneyler kesin değildir. Bu nedenle, promiyelositik (HL60) hücreleri farklılaşma uyarıcılar dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) kullanılarak, nötrofil benzeri hücrelere farklılaşmaları için indüklenir. Farklılaşmış HL60 hücreleri (HL60 fark) kullanarak, farklı donörlerden izolasyon nötrofillerin farklı tepkiler sahip önleyecektir.

In vitro 3D kültür modelleri, in vitro 2D modelleri arasında ve in vivo modellerde bir ara evresini temsil eder. 2B kültüründe hücreler bu sentetik yüzey üzerinde denatüre edilir biriken proteinlere doğal olmayan hücre ekleri oluşturan plastik yüzeye yayılır. Bunun aksine, hücre ve hücre dışı matrisin sentezlenmesi için 3D kültürü da doğal hücre-hücre ek hücreler, bağlı oldukları doğal malzeme vardır.Bu nedenle, özellikle de, kanser hücreleri ve diğer hücre tipleri arasında 3D ko-kültür modelleri, tümör büyümesi, anjiyogenez ve metastazın katkıları gösteren için yararlı olmuştur. Bunun bir sonucu olarak, 3D kültürleri, hücre kültürü, in vivo 10 mevcut fizyolojik koşulları taklit etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Primer lösemik hücreler ile 1. Nötrofil İzolasyon ve Co-kültür

NOT: Prosedürler bilgilendirilmiş onam imzalanması tüm hastalarda Lyon Hastane Etik kurul onayı altında gerçekleştirilmiştir.

  1. Birincil lösemik hücreler ve nötrofillerin izolasyonu
    1. Kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı hastaların EDTA (kan mililitrede 1.8 mg EDTA) periferik kan tüpleri toplamak.
    2. Bir steril 50 ml tüp kan her biri 15 ml ilave edilir ve 15 ml RPMI seyreltin (seyreltme 1: 1), daha sonra dikkatli bir şekilde yavaş yavaş fazlar karıştırılmadan tüpün dibine yoğunluk gradyan çözeltisi 15 ml ilave ediniz. yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlanması için oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
    3. Oda sıcaklığında ve frensiz 35 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj. Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru gösterildiği gibi kan dört farklı aşamadan ayırmak gerekir: trombosit ve plazma, mononükleer hücreleri (white halkası), yoğunluk gradyan çözümü, granülositler ve eritrositler.
    4. Yeni 50 ml tüp plastik Pasteur pipeti ve transferi ile birincil lösemik hücreleri temsil beyaz halka toplayın.
      1. PBS ile tüp içinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml'ye kadar (kalsiyum ve magnezyum içerir) doldurun.
      2. 5 PBS daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml'ye kadar PBS ilave mL pelletini.
      3. tam RPMI ortamı ile pelletini (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM glutamin, 100 U ile takviye / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin), hücre canlılığı sayacını kullanarak sayım için.
    5. Aspire Üst fazlar granülosit eritrosit faz ayrılıp 25 ml'ye kadar PBS ekleyin toplam 50 ml% 0.9 NaClup içinde% 3 dekstran ekleyin. boruları 10 kez karıştırın ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca muhafaza edin.
    6. Üst RBC-fakir nötrofil katman toplayıntemiz ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri d. PBS sonra toplam 50 ml kadar kırmızı hücre parçalama tampon ekleyin ml 5 ile her pelletini.
    7. RT daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüj 15 dakika süreyle karanlıkta tüpler tutun. PBS ile pelet (toplam 50 ml'ye kadar PBS ekleyin), daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüj yıkayın.
    8. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi kullanılarak izolasyon saflığını belirlemek için 5 ml'lik plastik tüplere 50 ul PBS-FBS (% 4), her hücre türü için 3 x 10 5 tutun.
  2. İzole hücre popülasyonlarının Morfolojik Görüntüle'ye analiz
    1. Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 4 Nötrofiller ve 150 ul tam RPMI ortamında 3 x 10 4 mononükleer hücreleri yeniden süspanse edin. Bu t sağlanması, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirinO santrifüj iyi dengelenmiş.
    2. santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odalarında çıkarın oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 750 x g'de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın.
    3. Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin.
  3. FACS İzole Hücrelerin Saflık test
    1. APC konjüge anti-insan CD19 antikoru (5 ul / 10 6 hücre) ile izole edilmiş, birincil lösemi hücreleri etiketlemek. Tablo 1 (5 ul / 10 6 hücre) listelenen anti-insan antikorlarının karışımı ile saflaştırılmış nötrofilleri etiketleyin. 4 O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri
    2. 500 ul PBS-FBS (% 4), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri hücreleri yıkayın.
    3. 200 ul PBS-FBS (% 4), her pelletini.
    4. , SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP FSC-A (488 nM): 488 nm lazer: Aşağıdaki optik yapılandırmayı kullanarak bir akış sitometresinde analiz ), PE (BP 575/26); 633 nm lazer: APC (BP 660/20), APC-Cy7 (BP 780/60). Renk karşılanmasını sağlamak.
  4. Otolog Nötrofiller ile İlköğretim lösemik hücrelerinin Coculture
    1. Tohum, birincil lösemi hücrelerinin tek başına ya da tam RPMI ortamı içinde oranı 1:10 otolog nötrofiller 2 x 10 5 hücre / ml olmuştur. Bunu yapmak için, seyreltilmesi hücre süspansiyonları, hücre sayıları ayarlayın ve 2 x 10 6 hücre / mL nötrofil birincil lösemi hücre 2 x 10 5 hücre / ml ekleyin. dikkatlice karıştırın.
    2. hücrelere Bruton tirozin kinaz (Btk) inhibitörü (İbrutinib) 25 uM ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 24 saat süreyle inkübe edilir.
  5. Hücre Hasat ve FACS analizi
    1. collECT, FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'da tüpler 5 ml'lik plastik tüplere hücreleri. daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj 1 ml PBS-FBS (% 4) ile granül yıkayın.
    2. ticari kit kullanılarak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe hücreleri süspanse Annexin V ve PI peletler. (FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI 610: 488 nm lazer: Şekil 2A yolluk stratejisi kullanarak bir akış sitometresinde ve aşağıdaki optik yapılandırmasına analiz / 20 BP). Renk karşılanmasını sağlamak.

Granulositik Pathway ve 3D Model RL Lenfoma B Hücreleri ile Bunların kokültürü boyunca HL60 Hücre 2. Farklılaşma

  1. Nötrofil benzeri Hücreleri içine insan promiyelositik (HL60) Hücre Farklılaşma
    1. / Ml daha sonra değişimi etkilemek için 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave 3 x 10 5 hücre HL60 hücre sayısını ayarlar. Her 3 x 10 5 Tohum de 48 oyuklu plaka başına HL60 hücreleri daha sonra% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat süre ile inkübe edilir.
    2. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g hücreleri ve santrifüj toplar. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri.
    3. Sonra bu çözeltiye, 3 x 10 5 hücre / HL60 hücre sayısını ayarlamak ve 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave edilerek kendi değişimini etkileme tam RPMI ortamı içinde hücre süspansiyonu seyreltin. Oyuk başına 48 oyuklu plaka içerisinde her biri 3 x 10 5 HL60 hücreleri, tohum ve% 5 CO2 ile 37 ° C sıcaklıkta bir 48 saat daha inkübe edilir.
  2. HL60 farklılaşma Analizi (HL60 fark)
    1. hücreleri toplamak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin.
    2. flow sitometri ile hücre-yüzey belirteçleri ifade değişikliklerini analiz etmek. Her 3 x 10 5 koyun ayrışmamış (hücre kültüründen) HL60 hücrelerinin ve FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'da tüpler 5 ml'lik plastik tüplere, 3 x 10 5 HL60 fark hücreleri.
    3. 50 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin. AF700 veya APC konjüge anti-insan CD38 (5 ul / 10 6 hücre) konjüge edilmiş bir anti-insan CD11b hücreleri etiketleyin. 4 O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri
    4. daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj 500 ul PBS-FBS (% 4) ile yıkayınız. 200 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin.
    5. 488 nm lazer: Şekil 3A yolluk stratejisi ve aşağıdaki optik yapılandırma kullanarak akış sitometresinde analiz FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm lazer: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (BP 730/45).
    6. HL60 fark morfolojik değişiklikleri test etmek için, mikroskobik inceleme için cam slaytlar üzerine hücreleri hareketsiz.
      1. Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 tekrar süspansiyon 4 farklılaşmamış HL60 hücrelerinin 150 ul komple RPMI ortamı içinde 3 x 10 4 HL60 fark. santrifüj dengeli olmasını sağlamak, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirin.
      2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 rpm'de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları çıkarın. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın.
      3. Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin.
  3. 3 boyutlu (3D) Kültür
    NOT: Bu deneyde kullanılan malzemeler soğuk ve deney buz üzerinde gerçekleşiyor emin olun.
    1. Tek başına veya HL60 fark ile karıştırılır ya her 5 x 10 4 RL hücreleri tekrar süspansiyon Oranı RL: HL60 fark 1:10 yaklaşık 2 ila 3 mm açıklığı genişletmek amacıyla steril makasla kesme, 1 ml bir pipet kullanarak 300 ul bazal membran matris ile karıştırılması. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının.
    2. 24 oyuklu bir plaka içerisinde de / hücre süspansiyonu her biri 300 ul tohumu. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının. Daha sonra her bir RPMI ortamı doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 7 gün süre ile inkübe ml 1 ekleyin% 5 CO2 ile 37 ° C' de 30 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. iki günde orta değiştirin. günde 5 10 nM vinkristin ekleyin.
  4. FACS analizi
    1. 7 günlük bir kültürden sonra ortam aspire ve iki kez 1 ml buz gibi soğuk PBS ile her bir yıkama. 3 ml / buz gibi soğuk PBS-EDTA (5 mM) da ekleyin. 200 ul pipet ucu alt kullanılarak kazıyarak Kuyunun dibinden jel ayırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde hafifçe plakayı sallayın.
    2. steril 15 ml tüp içine hücre süspansiyonu aktarın ve ic yavaşça tüpler sallayın30 dakika daha örn. homojen hücre süspansiyonu görünüm için kontrol edin. (Bu durumda değilse, o zaman daha uzun süre hücreleri sallamak ya da daha fazla PBS-EDTA ekleyin).
    3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin tüpler. PBS ile peletler daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yıkayın.
    4. PBS-FBS (% 4) ile yeniden süspanse edin ve PE-Cy7 ve APC konjüge anti-insan CD38 antikoru (5 ul / 10 6 hücre) bağlı anti-insan CD19 antikoru ile etiket. 4 O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe
    5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g sonra 500 ul PBS-FBS (% 4) santrifüj tüplerine ile yıkayınız. ticari kit kullanılarak Annexin V ve PI ile hücreleri tekrar süspansiyon.
    6. Şekil 4A yolluk strateji kullanarak akış sitometresinde analiz ve aşağıdaki optik yapılandırma: 488 nm lazer: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm lazer: APC (BP 660/20). Renk karşılanmasını sağlamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

, Beyaz bir halka tek-çekirdekli hücreleri temsil eder, trombositler ve plazma. Burada tarif edilen yoğunluk gradyan ayırma yöntemi CLL hasta kanından izole primer lösemik hücreler ve uyarılmamış nötrofiller Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru (yoğunluk gradyanlı santrifüj işlemi sonrasında elde edilen farklı kan katmanları temsil içerir yoğunluk gradyan çözeltisi, granülositler ve eritrositler). Şekil 1B ve 1C, sırasıyla nötrofil (çok loblu çekirdek hücre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

yoğunluk gradyanlı santrifüj yaklaşımı kullanarak yüksek saflıkta insan kanından nötrofıller izolasyonu için ve aynı kademe tek çekirdekli hücreler içinde, burada etkili, basit, hızlı ve ucuz bir protokol açıklanan, aynı zamanda ayrılmakta ve geri kazanılmaktadır. izole edilmiş hücre popülasyonları ≥90% saftır.

Çeşitli yöntemler insan kanından nötrofil izolasyonu için kullanılabilir. Bu süreksiz gradyanlar 11,12 kullanarak veya nötrofiller immüno-manyetik bu daha sonra CD16- bağla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RPMI 1640 Gibco Invitrogen21875-034
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco Invitrogen10270-106
Fosfat tamponlu salin (PBS kalsiyum ve magnezyum içerir)Gibco Invitrogen14040-091
N-asetil-L-alanil-L-glutamin (L-Glutamin)Yaşam teknolojileri25030-024
Penisilin streptomisin (Pen Strep)Yaşam teknolojileri15140-122
Bruton tirozin kinaz (Btk) inhibitörü (Ibrutinib) CliniSciencesA3001
Vincristine EG labo
BD Matrigel bazal membran matrisi  BD Biosciences354234Deney gününden önce gece boyunca (O>N) gece boyunca (C'ye koyun
. Kırmızı hücre lizis tamponu BD Biosciences555899
Ficoll (Pancoll)PAN BiotechP04-60500
Dekstran Sigma-AldrichD8906
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Retinoik asitSigma-AldrichR2625
Sığır serum albümini (BSA)Sigma-AldrichA7906
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Sodyum klorür (NaCl)EuromedexS3014
Ek V-FLOUS boyama kiti ve nbsp;Roche11  988  549  001
Kiti RAL 555 Modifiye Giemsa boyama kitiCosmos BiyomedikalCB361550-0000
LSRII akış sitometrisiBD Biosciences
SitosantrifüjThermo Scientific
Leica DMR-XA mikroskobuLeica Microsystems
Cellometer Otomatik T4 Hücre Canlılık SayacıNexcelom  Bioscience

Kaynaklar

  1. Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
  4. DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
  6. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
  7. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
  8. Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
  9. Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
  10. Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
  11. Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
  12. Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
  13. Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606(2012).
  14. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
  15. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586(2013).
  16. Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
  17. Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
  18. Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
  19. Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
  20. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
  21. Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940(2014).
  22. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
  23. Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
  24. Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
  25. Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
  26. Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yo unluk Gradyan Santrif jlemeAk Sitometrisi Analizi3B Ko k lt r ModelleriHL60 DiferansiyasyonuDekstran SedimantasyonuEritrosit LiziziCD15 CD16 Mark rleriMatrigel Matrisi
Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.