Method Article

Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, anjiyotensin II'nin iyot-125 etiketli bir analogu kullanılarak sıçan beynindeki anjiyotensin II Tip 1 reseptörlerinin lokalizasyonunu kantitatif, dansitometrik, in vitro reseptör otoradyografisi ile tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol Ang II reseptörleri reseptör otoradyografik haritlama özgü bir radyo-kullanarak sıçan beyninde Anjiotensin II (Ang II) için reseptör bağlanma şekilleri ile ilgili bilgiler.

Doku numuneleri hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklanır. Bir kriyostat koronal bölümüne doku (beyin) kullanılır ve yüklü slaytlar üzerine bölümleri monte çözdürmeyiniz. Slayt monte doku bölümleri Ang II reseptörlerinin radyolabel 125I-sı-Ang II içerisinde inkübe edilir. Komşu slaytlar iki kümeye ayrılır: bir alıcı doyurarak radyo-etiketlenmemiş Ang II konsantrasyonu ya da varlığında (MGP) 'spesifik olmayan bağlanmayı' 1, Ang II reseptörü alttipinin (1 r) seçici Ang II reseptör antagonisti ve 1 R antagonisti AT hiçbir ile 'bağlayıcı toplamı'. 2, Ang II reseptörü alttipinin (2'de R) doyurucu konsantrasyonu antagonisti (PD123319, 10 uM), aynı zamanda kuluçkalamadan mevcutturtampon üzerinde AT 1 R alt tipine bağlama 125l-SI-Ang II sınırlamak için. 22 ° C, MGP slaytlar 10 uM PD123319 ve losartan maruz ° 'de 30 dakikalık bir ön inkübasyon sırasında, slaytlar 10 uM PD123319 maruz' bağları, toplam 'ise. Slaytlar, sonra 'toplam bağlanma için' PD123319 mevcudiyetinde 125l-sı-Ang II ile inkübe edildi ve analiz tamponu içinde MGP için PD123319 ve losartan, birkaç 'yıkama ", ardından tampon maddesi içinde ve su tuzunu ve non-kaldırmak edilir spesifik olarak bağlanmış radyoligandı. slaytlar uzmanlaşmış bir film ve kaset kullanarak ardından otoradyografi filmine maruz darbe kurutucular kullanılarak kurutulur. Film geliştirilen ve görüntüler, özel bir görüntüleme sistemi ve elektronik tablo kullanarak görsel ve kantitatif dansitometri için bir bilgisayara taranır. slaytlar ek olarak bir dizi histolojik karşılaştırmalar için tionin-boyanır.

reseptör otoradyografi kullanmanın avantajı görselleştirmek yeteneğiAng II, bir doku numunesinin bir bölümü içinde yerinde reseptörler, anatomik bir bitişik histolojik bir referans bölümüne karşılaştırarak doku bölgesini tanımlamak.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyovasküler hastalık 2011'de 1 ABD'de ölümlerin% 30'undan fazlasını neden ABD'de ölüm ve sakatlık, önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Amerikan Kalp Derneği en son istatistikler üç birden fazla kişi birine sahip olduğunu göstermektedir kardiyovasküler hastalık ya da daha fazla türü. Kardiyovasküler araştırmalar bu hastalığı anlamak karşı adımlar atmaya devam ediyor, ancak kuşaklar yaşlanıyor başlarken çabalarına devam etmesi zorunludur. Renin-anjiyotensin sistemi (RAS), esas (Şekil 1), 2-8, sempatik sinir sisteminin ateroskleroz, enflamasyon, sistemik vazokonstriksiyon ve aktivasyonunu teşvik ederek kalp-damar sistemi regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır.

RAS tansiyon azalan böbrek jukstaglomerüler hücreleri yanıt olarak kan dolaşımına renin salgılayan aktive bir hormonal sistem, sympat arttıinfographie stimülasyon veya makula densa sodyum akışını azalmıştır. Renin anjiyotensin I (Ang I) 'in (karaciğerde sentezlenir) anjiyotensinojen metabolizması için önemlidir. Ang sonra anjiyotensin II (AngII), RAS ana efektör peptit oluşturmak için, birincil akciğer ve böbrekte, vasküler endotel hücrelerinin luminal tarafta, anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) tarafından ectoenzyme metabolize edilir. Ang II İki reseptör alt tipi aktive edebilen olduğu; (1 AT R) tip 1 reseptör ve (2 R AT) tip 2 reseptör, kardiyovasküler sistem düzenleyen hem de sıvı ve elektrolit homeostazisini korumak ve şimdi bilişsel işlev ve nörodejeneratif hastalığı etkilediği düşünülmektedir 8,9 işler. Yerel, beyin özel RAS bağımsız Ang II sentezlenmesi için bildirilmektedir. Beyinde, ön-madde proteini anjiyotensinojen bir renin-benzeri enzim 3 Ang I dönüştürülür astroglial 10 sentezlenir, muhtemelen prorenin prorenin reseptörüne bağlanan11, ve daha sonra, bol beyindeki 12 nöronların hücre dışı yüzeyi üzerinde eksprese edilir anjiyotensin dönüştürücü enzim ile Ang II ile dönüştürüldü. Ang II oluşturulan bu intrabrain 1 beyin ve kan yoluyla bulaşan Ang II izole edilmiştir 2 reseptörlerinde agonistidir.

AT 1 R, önemli bir fizyolojik rol oynarken, daha iyi öncelikle kalp-damar sistemi ve böbrekler (Şekil 2) etkileyen, vücutta, patofizyoloji etkileri bilinmektedir. Ang II AT 1 R bağlandığında, bu vazokonstriksiyona neden olur; kan akışına direnci arttırarak ve kan basıncını yükselterek. Ayrıca, artan sodyum ve su retansiyonu giden, aldosteron ve vazopresinin sentez ve salgılanmasını teşvik eder. Bu etkiler, iskemik beyin tahribatı ve bilişsel bozuklukları uyarabilir ve Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ile bağlantılı olduğu ve diabetes, son zamanlarda tespit ediliyor yanı sıra, öğrenme ve hafıza 13-15 etkileyecek. Böbrekte jukstaglomerüler hücreler üzerinde 1 R AT ki RAS bir geribesleme döngüsü renin salgısı yoktur inhibe olduğunu. İlginçtir, AT 2 R genellikle 1 R AT, diğerleri 16-20 arasında vazodilatasyon, nörit büyümesini, aksonal rejenerasyon, anti-çoğalmasını ve cerebroprotection neden eylemi karşı düzenler. AT 2R, aynı zamanda, anti-hipertansiyon ve en son, anti-kanser ilaçları 21 için bir hedef olarak tanımlanmıştır. çeşitli dokularda içinde Ang II reseptörlerinin lokalizasyonu ve yoğunluğunu belirleme ve nasıl RAS belirli hastalıklarda oynadığı rolü ortaya çıkarmak yarayacak nicel dansitometrik reseptör otoradyografisim kullanarak çeşitli tedaviler ve hastalık durumlarında tarafından etkilenmektedir.

Reseptör otoradyografi anjiyotensin I varlığını göstermek için etkili bir yöntem olarak 30 yıldan uzun bir süredir kullanılmaktadırI reseptörleri beyinde RAS diğer bileşenleri ve deneysel koşullara 22-34 çeşitli altında sıçan, fare, kobay, köpek ve insan ve diğer dokular. Beyin içinde Ang II reseptörlerini bulma önemi bir beyinde Ang II eylemleri fonksiyonel nöroanatomisini uygulayabilirsiniz olduğunu, örneğin, hipotalamus (PVN) paraventriküler çekirdeğinde AT 1 R varlığı Ang bir fonksiyonu göstermektedir beyindeki II vasopresin, oksitosin veya kortikotropin salan hormon (CRH) serbest ya da sempatik sinir sisteminin aktivasyonu uyarmak için. Bu nedenle, en 1 R bloke eden ilaçlar, beyin RAS aktivitesi ile ilişkili bu PVN aracılı bazı etkileri azaltabilir. Work in progress 1 R antagonistleri AT kullanımı CRH Travma Sonrası Stres Bozukluğu (TSSB) bağlı salınımını azaltmak ve TSSB belirtileri iyileştirmek düşündürmektedir (Hurt ve ark., Yayımlanmak üzere gönderilen). PVn, subfornicalOrgan (SFO), ve amigdala homeostasis, iştah / susuzluk, uyku, hafıza, duygusal tepki düzenleyen bilinir ve bu gösteri çalışmanın hedef alanlardır. Bu bölgeler, mikroskop lamları üzerinde beyin koronal kesitler toplanması ve Ang II reseptörleri için spesifik radyo-ligand ile birlikte spesifik inhibitörleri olan bölümleri muamele edilmesiyle incelendi. Bu çalışmada, önerilen satıcılar ile birlikte tüm maddeleri ve reaktif maddeler listelenmiş iyot-125 daha sonra mono- 125 I olarak saflaştırılan bir Ang II reseptör antagonisti, sarkosin 1, izolösin 8 Ang II (SI Ang II), radyolabel kullanılmıştır edilir Daha önce tarif edildiği gibi 35, HPLC yöntemleri kullanılarak -Si Ang II. Bu yüksek bir spesifik aktivitesi radyo-ligand kullanımı X-ışını filmine radyo-etiketli bölümleri maruz kaldıktan sonra, düşük, orta ve yüksek reseptör yoğunluğu alanlarının görülmesine olanak verir. İyot-125, belirli bir miktarda bilinen miktarlarda içeren beyin macun standartlarına filmi kalibre tarafındanBir alanda bağlanmış Ang II reseptörünün belirlenebilir. Deneysel çalışmalarda, deneysel konularda beyinlerinde bağlanması Ang II reseptör kontrol grubunun beyinlerinde olduğu mukayese edilebilir. Bu Ang II eylemleri genetik durum, fenotipik anormallik, hastalık durumunun veya ilaç tedavisine yanıt değişmiş olup olmadığını gösterebilir. Bu bilgi daha sonra RAS düzensizliklerine bağlı hastalıkların tedavisi için terapiler geliştirilmesi için uygulanabilir. Düşük anatomik çözünürlükte ancak siteler reseptör bağlanma tespit Alternatif teknikler, ayrışma sabiti olarak radyoligand bağlanma afinitesini belirlemek için bir konsantrasyon aralığı üzerinde radyo-ligand ile kuluçkalanır doku homojenatlarında türetilen doku zar müstahzarları kullanan analizler (KD bağlayıcı Çevrede doku) ve maksimum bağlanma kapasitesi (B Max).

Burada açıklanan protokol 5 büyük işbirliği içine bölünebilirmponents: Reseptör Otoradyografi için Doku Bölümler hazırlanması; Reseptör Otoradyografi; Film Pozlama ve Gelişimi; Histoloji; VE DENSİTOMETRİK Görüntü Analizi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için yapılan tüm hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde Nova Southeastern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi, 8 inci Edition (Ulusal Akademiler Press, Washington, DC 2011 ).

Reseptör Otoradyografi 1. hazırlanması Doku Bölümler

  1. kurban üzerine, hasat taze beyin dokuları ve alüminyum folyo ve yerinde sarın -20 ° C derin dondurucuda en kısa sürede. 20 ° C derin dondurucu - Doğru şekli korumak kafatası içini taklit eden bir beyin kalıp içinde beyinleri yerleştirmek için, alüminyum folyo ve yerde sarın. 30 dakika sonra, bir yerde yapışmalı dondurucu saklama torbasında doku ve uzun süreli depolama için -80 ° C derin dondurucuda taşıyın.
    1. -80 -10 ° C ve -18 ° C maksimum minimum ayarlanmış bir kriostada C derin dondurucuda ve transferi ° önlemek için çözülme ilgi taze dondurulmuş doku örneği elde edin.
    2. doku üzerine numune, sadece ortam içine numunenin çok küçük bir kısmını gömme bir glikol ve reçine-tabanlı gömme ortamı ile monte yerleştirin. beyin için, beyin koronal planda kesit etkinleştirmek için dikey olarak monte edilir.
  2. Doku cryostat içinde mikrotom üzerine monte ve sıkıca yerinde sıkın yerleştirin. dorso-ventral eksen dik yaygın olarak kullanılan beyin atlasları olduğunu aynı antero-Postero koordinatlarda olan beynin sol ve sağ tarafını sağlamak ve.
  3. İstenen kalınlıkta kesme başlar (20 um tavsiye edilir) ve slayt alanı daha büyük bir yüzey alanına sahip bir dikey yönde mikroskop lamı üzerine bölümleri monte eritin. Slaytlar ilk seti (Şekil 3) 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 ve 1-5 etiketli, yani beş sıralı setleri Slaytlarınıza bölümleri toplayın.
  4. bölümleri ile slaytlar bir dizi doldurduktan sonra, en fazla 1 saat boyunca kuru hava slaytlar, sonra sli yer izin-20 ° C'de bir plastik slayt kendi kendine kapanan dondurucu saklama torbasında kutu ve mağaza des.

2. Alıcı Otoradyografi

UYARI: Radyoaktivite. radyoaktivite işlemek için koruyucu kıyafetleri kullanın. Bertaraf kurulması bağımlı olduğunu, ve düzgün (yarım-life 60 gün) çürümeye ya da sertifikalı firma tarafından alınmayı kurallara uymak zorundadır.

  1. (Şekil 5) -20 ° C dondurucu ilgi "-2" "-1" ve slaytlar çıkarın ve slayt kulpları içine monte edin. Birlikte 'non-spesifik' tedavisi için "-1" slaytlar ve toplam 'tedavi için "-2" slaytlar monte edin. Bağlama kavanoz yalnızca 10 içerir, bakiyeleri (Tablo 1) 'Spesifik olmayan "kavanoz 2R antagonisti, PD123319, bir 10 uM nihai konsantrasyonlar içerir ve deney ortamı tamponunda, 1R antagonisti, (AM5) bir losartan AM5 mikron PD123319.
  2. slayt tersçeneler, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca AM5 35-40 ml dolu ön inkübasyon Coplin kavanoz içine slaytlar ve ilgili inhibitörleri yer. 4 dakika aralıklarla öncesi inkübasyon banyosu içerisinde müteakip setleri başlatın.
  3. Hemen oda 60-90 dakika boyunca 10 AM5 ml artı ilgili inhibitörleri ile (Şekil 4'te hesaplanan) 125I-sı-Ang II önceden tespit edilmiş bir konsantrasyonunu ihtiva eden inkübasyon kayıcı postaları ön inkübasyon çözeltisinden slaytlar aktarmak sıcaklık. Yeterli radyoligand varsa, 10 slaytlar modifiye slayt kulpları (arka arkaya) yerleştirilir ve Coplin kavanozlarda 125 I-SI-Ang II ile inkübe edilebilir.
  4. Talep (gerekirse), benek, yavaşça, iki ayrı kaplar içinde damıtılmış su, 400 ml 1-2 saniye boyunca döndürülerek yıkayın kayıcı kılıf içine geri çekilir.
  5. Tam 1 dakika her (Şekil 4 gibi için AM5 35-40 ml içeren dört Coplin kavanoz içine sırayla slaytlar aktarın/ Strong> ').
  6. Son 1 dakika durulama sonra, yavaşça buzla soğutulmuş damıtılmış su dört değişiklikler 1-2 saniye için bölümler girdap.
  7. -Darbe kurumaya soğuk hava ile slaytlar (Dikkat: sıcak hava radyoaktif bileşik uçucu hale) 4 dakika (Şekil 5) için farklı açılardan kurmak dört saç kurutma makinesi kullanarak, tüm bölümleri kuruyana kadar, daha sonra bir kağıt havlu üzerine koyun.
  8. Dağı dokular çift taraflı bant kullanarak X-ışını filmine apozisyon bir karton üzerine yukarı bakacak şekilde kayar.
  9. En az bir Dağı, her karton üzerine 125 İyot kalibrasyon standart slayt (Şekil 6).
    Not: Kalibrasyon standartları iyice beyin kesitleri ile aynı kalınlıkta kesildi ve mikroskop üzerine çözülme monte kriyostat olan 1 mL'lik bir tüberkülin şırınga içinde santrifüjleme ile sıkıştırılmış bir fenol halkası ihtiva eden bir bileşik, bağlanmış 125 iyot ile karıştırılmış, beyin macun oluşur slaytlar. Alternatif olarak, 125I kalibrasyon standartları20 um kalınlığında kesitler plastik reçine ticari olarak elde edilebilir. Bu standartlarda plastik reçine kısmen böyle% 40 ~ bir doku denklik kalibrasyon hesaba gerektiğini radyasyondan filmi korur.

3. Film Pozlama ve Kalkınma

  1. bir kayış-arka X-ışını kaset ve otoradyografi film ile bir karanlık oda geçin. Kaseti açın ve içindeki slaytlar (Şekil 6) ile karton yerleştirin.
    1. Işıkları kapatın ve Karanlıkodanızda açın. Dikkatle, X-Ray film kutusunu açmak bir filmi çıkarın ve kaset slaytlar üstünde (sağ alt köşede tırtıklı kenar) filmi parlak tarafı yukarı yerleştirin. Dikkatle kaseti kapatın ve hafif (Şekil 6) dışarı mühürlemek için kilit çubuklarını bükün. -20 ° C'de birkaç gün ila birkaç hafta için slaytlar Açığa.
  2. karanlık odada, kaseti açın ve filmin gelişen proc devamess.
    1. ardışık tepsilerine slaytlar yerleştirin; 2 dakika için geliştirici, 5 dakika için% 5 buzlu asetik 30 saniye için asit ve fixer içeren su. filmler 20 dakika akan su ile bir tepsiye yerleştirilir, daha sonra en fazla 10 saniye boyunca Photoflo yerleştirilir ve kapattı.
      Düşük bağlama ile alanlardan ölçülebilir sinyalleri elde etmek için yeterince uzun, ama çok uzun zaman yüksek bağlayıcı olduğu bölgelerde filmini doyurmak için: maruziyet süresi ampirik olarak belirlenir ve farklı pozlama süreleri ile birden filmleri içerebilir: Not. kabul edilebilir riskler elde edildikten sonra, bir sonraki adıma geçin.

4. Histoloji

  1. Tionin leke ve boyama reaktifleri (Tablo 2, Şekil 7) hazırlayın.
    1. Slayt rafa "-3" slaytlar yerleştirin ve 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile başlayarak sıralı transferi, daha sonra 10 dakika boyunca tionin leke çözeltisi Deion halinde üç dip ardındanözelleşmiş suları ve deiyonize su içinde bir 30 saniye yıkama.
    2. aşağıdaki gibi su takiben, etanol yıkar içine slayt raf yerleştirin; 1 dakika her biri için,% 100 iki etanol yıkaması, ardından% 50,% 70, ve 30 saniye süreyle% 90. Son olarak, 3 dakika boyunca iksilen içine kayar ızgarayı daha sonra 5 dakika için bir ikinci ksilen çözeltisine aktarılmaz.
  2. Son iksilen banyosundan her seferinde bir slayt çıkarın ve organik çözücü montaj orta bir reçine ile sürgünün üst kenarını kapsayan ve slayt üzerine 24 mm x 60 mm'lik bir örtücü cam yerleştirin. ~ 48 saat slaytlar için yeterince kurumasını bekleyin ve sonra 2.400 dpi gri bilgisayara tarayın.

5. Densitometrik Görüntü Analizi

  1. sol alt köşesinde tırtıklı kenarı aşağı filmin parlak tarafı yerleştirin ve görüntüleme sistemi bilgisayarda herhangi bir bozulma olmadan film yoğunluğu bilgisini iletebilen özel bir tarayıcı kullanarak tarayın.
  2. özel görüntüleme sys açtem ve kullanmak kalibrasyon çubukları filmin görüntüleri (- 12 Şekil 9) gelecekteki dansitometrik analizi için kalibrasyon standartları oluşturmak.
  3. Bir şablon kurulması veya ampirik ilgi alanları özetleyen biri tarafından ilgi ölçüsü alanları. Veriler, kontrol ya da vahşi tip (bölümü) ve bölge ya da toplandı ve film göre ayrılır. (Şekil 9) ölçümlerde yoğunluğu (fmol / g), tarama alanı ve toplam hedef alanı da kapsayacak şekilde emin olun.
    1. Ilgi bölgesi vurgulayarak parametreleri (Şekil 10) arasında düştüğü temin ederek tarama alanı çubukları ayarlayın.
    2. Bir e-tabloya İhracat verileri (Tablo 4). , Yoğunluk çarpı toplam hedef alan çarpın o belirli bir alanın bağlama değerini elde etmek için tarama alanının bölün. Bu ölçülen tüm değerlere tamamlandıktan sonra, seçici bağlantı p vermek üzere toplam oluşturulan spesifik olmayan substratkızıyorum. Ortalamalar, aynı zamanda bu değerleri için gerçekleştirilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Renin-anjiyotensin sisteminin bir metabolik yolun genel görünüşü Şekil 2'de tarif edilen Şekil 1 ve (R1 Ar ve 2) anjiyotensin II reseptör alt-tipleri üzerindeki doğrudan odak gösterilmektedir. Şekil 3'te bir koronal beyin transferi Şekil Şekil 4'te görüldüğü gibi, daha sonra, önceden belirlenmiş bir 125I-siang II konsantrasyonu kullanılarak bir alıcı otoradyografi prosedü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokol, bir kemirgen beyin önce hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklandı koronal bölümlerin bitişik bölümlerinde Radyoligandın bağlanması, toplam "ve" non-spesifik "görselleştirme tanımlar ve hemen hemen her dokuya kolayca uygulanabilir olabilir anatomik reseptörlere veya radyoligand bağlanma sitelerinin diferansiyel miktarları görüntülemek altyapılarını çözmüştür. protokolü kapsamında açıklanan prosedürler basit ve analiz sonuçlarını doğru yorumlamak için kritik öneme sahiptir. 20 um kalınlığ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Robert Speth, anjiyotensin II reseptörlerine karşı antikorları ticari bir satıcıya lisansladı ve söz konusu antikorların satışından telif ücreti alıyor. Diğer yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH Grant HL-113905 tarafından desteklenmiştir

.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 ml Plastik BeherFisher02-591-30
24 mm x 60 mm LamelFisher22-050-25
Otoradyografi Görüntüleme Filmi 24 mm x 30 cmCarestream-Biomax MR Filmi891-2560
Bacitracin (Bacillus licheniformis'ten)SigmaB-0125
Karton Levha 8 x 11Hilal İllüstrasyon Panosu #201201
Coplin KavanozlarıFisher ScientificE94
Ticari saç kurutma makineleriConairModel SD6X
Tek Kullanımlık Kültür TüpleriFisher14-961-26
EDTA (Disodyum tuzu, Dihidrat)USB Corporation15-699
EtanolFisher16-100-210 
D-19 DeveloperPhotographers Formulary, Inc. için Formüler Yedeği  01-0036
Buzul Asetik AsitFisherA38 SI-212
Histoprep / OCTFisherSH75-125D
Film SabitleyiciKodak5160320
Photo floKodak1464502
LosartanFisher / Tocris37-985-0
MCID ve ticaret; Çekirdek 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
Soyulabilir kayar saplarVWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
Premium Şarjlı Slaytlar, İnce Zemin KenarıPremiere Mikroskop Slaytları9308W
125I LigandlarPerkin ElmerNEX- 248
125SI-Ang II George Washington ÜniversitesiDr. Speth
Fisher ScientificHS15986
Sodyum Dibazik Fosfat Susuz (Na2PO4)FisherRDCS0750500
Sodyum Asetat (Susuz)FisherBP333-500
Tiyonin FisherT409-25
X-Işını Kasası (10 x 12)Spectronics CorporationDört Kare
KsilenFisher X3P-1GAL
Slide Mailers tarafından radyoiyodilatılmış

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004(2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635(2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31(2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234(2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor AutoradiographyAngiotensin II ReceptorsBrain Tissue SectioningRadioligand Binding AssayNon Specific BindingTotal BindingCryostat SectioningAutoradiography Film ExposureThionin Histological StainingDensitometry Analysis

Related Articles