Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

Özet

Burada, anjiyotensin II'nin iyot-125 etiketli bir analogu kullanılarak sıçan beynindeki anjiyotensin II Tip 1 reseptörlerinin lokalizasyonunu kantitatif, dansitometrik, in vitro reseptör otoradyografisi ile tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Bu protokol Ang II reseptörleri reseptör otoradyografik haritlama özgü bir radyo-kullanarak sıçan beyninde Anjiotensin II (Ang II) için reseptör bağlanma şekilleri ile ilgili bilgiler.

Doku numuneleri hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklanır. Bir kriyostat koronal bölümüne doku (beyin) kullanılır ve yüklü slaytlar üzerine bölümleri monte çözdürmeyiniz. Slayt monte doku bölümleri Ang II reseptörlerinin radyolabel ^125I-sı-Ang II içerisinde inkübe edilir. Komşu slaytlar iki kümeye ayrılır: bir alıcı doyurarak radyo-etiketlenmemiş Ang II konsantrasyonu ya da varlığında (MGP) 'spesifik olmayan bağlanmayı' _1, Ang II reseptörü alttipinin ₍₁ r) seçici Ang II reseptör antagonisti ve ₁ R antagonisti AT hiçbir ile 'bağlayıcı toplamı'. _2, Ang II reseptörü alttipinin _(2'de R) doyurucu konsantrasyonu antagonisti (PD123319, 10 uM), aynı zamanda kuluçkalamadan mevcutturtampon üzerinde AT ₁ R alt tipine bağlama ^125l-SI-Ang II sınırlamak için. 22 ° C, MGP slaytlar 10 uM PD123319 ve losartan maruz ° 'de 30 dakikalık bir ön inkübasyon sırasında, slaytlar 10 uM PD123319 maruz' bağları, toplam 'ise. Slaytlar, sonra 'toplam bağlanma için' PD123319 mevcudiyetinde ^125l-sı-Ang II ile inkübe edildi ve analiz tamponu içinde MGP için PD123319 ve losartan, birkaç 'yıkama ", ardından tampon maddesi içinde ve su tuzunu ve non-kaldırmak edilir spesifik olarak bağlanmış radyoligandı. slaytlar uzmanlaşmış bir film ve kaset kullanarak ardından otoradyografi filmine maruz darbe kurutucular kullanılarak kurutulur. Film geliştirilen ve görüntüler, özel bir görüntüleme sistemi ve elektronik tablo kullanarak görsel ve kantitatif dansitometri için bir bilgisayara taranır. slaytlar ek olarak bir dizi histolojik karşılaştırmalar için tionin-boyanır.

reseptör otoradyografi kullanmanın avantajı görselleştirmek yeteneğiAng II, bir doku numunesinin bir bölümü içinde yerinde reseptörler, anatomik bir bitişik histolojik bir referans bölümüne karşılaştırarak doku bölgesini tanımlamak.

Giriş

Kardiyovasküler hastalık 2011'de ¹ ABD'de ölümlerin% 30'undan fazlasını neden ABD'de ölüm ve sakatlık, önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Amerikan Kalp Derneği en son istatistikler üç birden fazla kişi birine sahip olduğunu göstermektedir kardiyovasküler hastalık ya da daha fazla türü. Kardiyovasküler araştırmalar bu hastalığı anlamak karşı adımlar atmaya devam ediyor, ancak kuşaklar yaşlanıyor başlarken çabalarına devam etmesi zorunludur. Renin-anjiyotensin sistemi (RAS), esas (Şekil 1), ^2-8, sempatik sinir sisteminin ateroskleroz, enflamasyon, sistemik vazokonstriksiyon ve aktivasyonunu teşvik ederek ka....

Protokol

Bu çalışma için yapılan tüm hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde Nova Southeastern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi, 8 ^inci Edition (Ulusal Akademiler Press, Washington, DC 2011 ).

Reseptör Otoradyografi 1. hazırlanması Doku Bölümler

1. kurban üzerine, hasat taze beyin dokuları ve alüminyum folyo ve yerinde sarın -20 ° C derin dondurucuda en kısa sürede. 20 ° C derin dondurucu - Doğru şekli korumak kafatası içini taklit eden bir beyin kalıp içinde beyinleri yerleştirmek için, alüminyum folyo ve yerde sarın. 30 dakika sonra, bir yerde yapışmalı dond....

Sonuçlar

Renin-anjiyotensin sisteminin bir metabolik yolun genel görünüşü Şekil 2'de tarif edilen Şekil 1 ve _(R1 Ar ve ₂₎ anjiyotensin II reseptör alt-tipleri üzerindeki doğrudan odak gösterilmektedir. Şekil 3'te bir koronal beyin transferi Şekil Şekil 4'te görüldüğü gibi, daha sonra, önceden belirlenmiş bir ^125I-siang II konsantrasyonu kullanılarak bir alıcı otoradyog.......

Tartışma

Açıklanan protokol, bir kemirgen beyin önce hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklandı koronal bölümlerin bitişik bölümlerinde Radyoligandın bağlanması, toplam "ve" non-spesifik "görselleştirme tanımlar ve hemen hemen her dokuya kolayca uygulanabilir olabilir anatomik reseptörlere veya radyoligand bağlanma sitelerinin diferansiyel miktarları görüntülemek altyapılarını çözmüştür. protokolü kapsamında açıklanan prosedürler basit ve analiz sonuçlarını doğru yorumlamak için kritik öneme sahiptir. 20 um kalınlığ.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
500 ml Plastik Beher	Fisher	02-591-30
24 mm x 60 mm Lamel	Fisher	22-050-25
Otoradyografi Görüntüleme Filmi 24 mm x 30 cm	Carestream-Biomax MR Filmi	891-2560
Bacitracin (Bacillus licheniformis'ten)	Sigma	B-0125
Karton Levha 8 x 11	Hilal İllüstrasyon Panosu #201	201
Coplin Kavanozları	Fisher Scientific	E94
Ticari saç kurutma makineleri	Conair	Model SD6X
Tek Kullanımlık Kültür Tüpleri	Fisher	14-961-26
EDTA (Disodyum tuzu, Dihidrat)	USB Corporation	15-699
Etanol	Fisher	16-100-210
D-19 Developer	Photographers Formulary, Inc. için Formüler Yedeği	01-0036
Buzul Asetik Asit	Fisher	A38 SI-212
Histoprep / OCT	Fisher	SH75-125D
Film Sabitleyici	Kodak	5160320
Photo flo	Kodak	1464502
Losartan	Fisher / Tocris	37-985-0
MCID ve ticaret; Çekirdek 7.0	MCID	N/A
NaCl	Fisher	S271
Soyulabilir kayar saplar	VWR	48440-003
Permount	Fisher	SP15-100
PD123319	Fisher	13-615-0
Premium Şarjlı Slaytlar, İnce Zemin Kenarı	Premiere Mikroskop Slaytları	9308W
125I Ligandlar	Perkin Elmer	NEX- 248
125SI-Ang II	George Washington Üniversitesi	Dr. Speth
	Fisher Scientific	HS15986
Sodyum Dibazik Fosfat Susuz (Na2PO4)	Fisher	RDCS0750500
Sodyum Asetat (Susuz)	Fisher	BP333-500
Tiyonin	Fisher	T409-25
X-Işını Kasası (10 x 12)	Spectronics Corporation	Dört Kare
Ksilen	Fisher	X3P-1GAL

Slide Mailers tarafından radyoiyodilatılmış