Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Özet

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Özet

Vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC'ler) sarkoplazmik retikulumunda (SR) kararlı durum kalsiyum (Ca²⁺) seviyelerinin korunması, genel sağlıkları için hayati önem taşır. Hücre içi Ca²⁺ içeriğinin önemli bir kısmı VSMC'lerdeki SR depolarında bulunur. Plazma zarı-SR bağlantıları yoluyla çevredeki hücre dışı boşlukla yakın ilişkisi olan tek hücre içi organel olan SR'nin, Ca²⁺ geçici olaylarındaki herhangi bir düzensizliğe veya hücrenin yaşadığı strese ilk yanıt hattını oluşturduğu düşünülebilir. Pek çok işlevi arasında, en önemlilerinden biri, aşağı akışta hücre çapında daha fazla reaksiyonu indüklemek için hücre boyunca Ca²⁺ tarafından düzenlenen sinyallerin iletilmesindeki rolüdür. Bu bağlamda sitoplazmik Ca^{2 +} göstergelerinin daha yaygın kullanımı, intraluminal SR Ca^{2 +} deposunda henüz tam olarak karakterize edilmemiş olan oldukça dinamik değişikliklerin araştırılması için genel olarak yetersizdir. Burada, luminal SR Ca^{2 +} 'nın doğrudan ve net ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu araç, hücrenin normal işlevi ve sağlığı üzerinde daha sonra önemli etkileri olan SR Ca^{2 +} 'daki nüanslı değişikliklerin araştırılması için kullanışlıdır. Özellikle SR Ca²⁺ içeriğindeki dalgalanmalar, hücrenin yaşadığı hastalık veya stres durumlarına hücresel tepkilerle ilgili önemli miktarda bilgi sağlayabilir. Bu yöntemde, SR hedefli bir Ca²⁺ göstergesinin değiştirilmiş bir versiyonu olan D1SR, ajanların kültürlenmiş sıçan aort düz kas hücrelerine (SMC'ler) girmesine yanıt olarak Ca²⁺ dalgalanmalarını tespit etmek için kullanılır. D1SR indikatörü ile inkübasyonun ardından, konfokal floresan mikroskobu ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı görüntüleme, kontrol koşulları altında intraluminal SR Ca²⁺ seviyelerindeki değişiklikleri doğrudan gözlemlemek için ve hücre içi Ca²⁺ hareketini indüklemek için işlev gören agonist ajanların eklenmesiyle kullanılır.

Giriş

Ca ^{2 +} vücuttaki her hücre içinde bolca bulunan çok önemli bir iyon olduğunu. Bu büyüme, çoğalma, göç ve apoptosis ^1-4 dahil olmak üzere birçok farklı hücresel fonksiyonları, önemli rolleri vardır. İyi Ca ^{2 +} hem doğrudan hem de dolaylı eylemlerle bu süreçleri etkileyebilir olduğunun tespit edilmesi ve bu nedenle, bu iyonun normal hücre içi konsantrasyonları değişiklikleri kolayca etkilenen hücreler için olumsuz sonuçlara neden olabilir. SR hücresinin ⁵ içinde en büyük hücre içi Ca ^{2 +} mağaza olarak kabul edilir. SR ve sitoplazma hem de Ca ²⁺ kararlı durum düzeyleri normal içine ve bu organel Ca ²⁺ -transporting kanalları dışında sürekli bir akış yoluyla korunur. Nedeniyle yaralanma ya da hastalık herhangi bir biçimde hücrelere dayatılan stresli koşullar genellikle onun üzerinde uzun süreli etkilere sahip gitmek SR Ca önemli değişiklikler ²⁺ ile ilişkiliHücrenin alth. Olguların çoğunda şiddetli, stresli bir hücrenin yetersizlik kurtarmak için ve kararlı durum SR Ca korumak ²⁺ seviyeleri bile apoptozis ^6-8 ölümle sonuçlanacak olabilir.

Hücresel Ca ^{2 +} dinamikleri güncel araştırma az sayıda çalışma testi Ca ²⁺ mağaza içeriği doğrudan ^9-11 organel gerçeği ile sınırlıdır. En yaygın uygulama yerine SR Ca ^{2 +} içerik ^12-14 değişikliklerin dolaylı ölçümleri gibi sitoplazmik Ca ^{2 +} düzeyleri ölçümü içerir. Bu deneylerde, Ca ^{2 +} yaygın organel en azalmasına neden farmakolojik ajanların (örn thapsigargin) kullanılarak SR serbest bırakılmasını indüklenir. Sonuçlar daha sonra sitoplazmik Ca ^{2 +} konsantrasyonları dalgalanmalara göre SR Ca ²⁺ değişiklikler ile ilgili çizilir. dolambaçlı ma böyle sonuçlara varmak için araştırmacılar için kalan yeteneğine rağmennner, SR Ca ²⁺ ölçüm bu yöntem toplanan verilerin yorumlanması ile ilgili birçok sınırlamalar bu bilgileri, toplamak için dolaylı yoldan açıkça. Bu açık kısıtlama atlamak için, SR lümen ağ içinde doğrudan bulundu Ca ²⁺ miktarını ölçmek için gereklidir.

Doğrudan intraluminal SR Ca ^{2 +} rekor seviyelere edememek nihai sonucu açısından hayati hücre kültürü araçları ve kullanılan Ca ^{2 +} göstergesidir. Mevcut yazıda referans veriler için, kullanılan VSMC donmuş hücre hattından gelen dikkat etmek önemlidir. Hücreler,% 5 _CO2 kaynağı ile sabit bir 37 ° C 'de kuluçkaya yatırılır Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) + belirtilen deneyler için geçitlerin 22-26 fazla% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS), kültürlenmiştir. Mevcut yöntem kullanılarak, örneğin, hücreler, çok başarılı bir şekilde ekstrasel- simüle eden bir protein karışımı ile yetiştirilendokuda ^15, birçok farklı türde çevre. SR Ca ven boyunca başarısı için önemli ²⁺ araştırma kullanılan protein karışımı türüdür; Bu durumda, düşük büyüme faktörü çeşitli normal Ca2 ⁺ sinyali etkileyen hareketleri sürekli olarak test edilen hücreler içinde meydana gelen bu aracın bileşenlerini önlemek için gerekliydi. Test hücrelerinin başarılı büyümenin ardından, Ca ^{2 +} göstergesi de etkin bir şekilde bu kültür hücreleri devreye sokulmalıdır. Bu SR-yerleşik Ca ²⁺ göstergesi D1SR taşıyan adenoviral bir vektör ile mümkün hale gelmiştir. Yüksek bir transfeksiyon verimliliği elde etmek için, hücreler önce, görüntüleme için en az 36-48 saat boyunca viral vektörler ile inkübe edilmesi gerekir. Bu hazırlık ca yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik SR lümeninde ²⁺ geçişlerini ölçmek için güvenilir bir araç sağlar.

Bu protokolde kullanılan D1SR gösterge D1ER Ca değiştirilmiş çeşididir ²⁺ iBaşlangıçta California Üniversitesi'nden Dr. Roger Y. Tsien laboratuarında, San Diego, ABD ^9,16 tarafından oluşturulan ndicator. Orijinal D1ER önceki Ca ^{2 +} göstergelere ^9,16 oranla çok daha geniş aralık (0,5-160 uM) üzerinden Ca ²⁺ hassasiyetleri göstermek cameleons denilen genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri ikinci nesil aittir. Yeni varyant D1SR Dr. Wayne Chen (Alberta, Kanada Üniversitesi'nden) bir tür hediye, ancak, bir mutant calsequestrin dizisi (yerine orijinal D1ER gibi bir kalretikülinden dizisi) taşır. Mutant calsequestrin bir ¹¹ lümen SR içinde Ca ^{2 +} bağlayıcı endojen calsequestrin rekabet sorununu ortadan kaldıran Ca ²⁺ bağlanma azalttı. D1SR göstergesi kesik geliştirilmiş siyan floresan proteini (OBP) ve sarı floresan protein (YFP) modifiye kalmodulin (CaM) ve M13 içeren bir bağlayıcı protein tarafından bağlanan (t taşırCaM) dizilerine bağlanan miyozin hafif zincir kinaz o 26-kalıntı peptit. CaM-M13 sekansı, endojen kalmodulin bağlanmasını M13 önlemek için modifiye edilmiştir. Ayrıca, SR tutulmasını sağlamak için, calsequestrin sekansı CFP ¹¹ 5 'ucunda eklenmiştir. ^{Ca2 +} bağlandığında, Eksantrik M13 alan FRET sinyal yoğunluğunda bir artış olarak kaydedilir yan CFP ve YFP arasında enerji transferi bir artışa neden şekilsel değişiklik geçer. ^{2 +} SR lümen Ca konsantrasyonu düştüğünde Öte yandan, Eksantrik M13 alan komşu CFP ve YFP ve FRET sinyal yoğunluğunda belirgin bir düşüş arasındaki enerji transferinde bir azalma ile sonuçlanır ters şekilsel değişiklik geçer .

Protokol

Etik deyimi: Bütün deneyler ve prosedürler British Columbia, Vancouver, Kanada Üniversitesi Laboratuvar Biyogüvenlik kurallarına anlaşma yapılmıştır.

FRET tabanlı Konfokal Mikroskopi için 35 mm Cam-bottom Kültür Yemekleri hazırlanması 1.

1. Aşağıdaki yordam 36-48 saat önce deneyler kullanarak tabak hazırlayın.
2. C depolama ° -20 seçilen jelatinimsi protein karışımı ve% 0.25 tripsin-EDTA Al ve kullanıma kadar mobil buz banyosu içinde saklayın.
   NOT: Kaplama proteini karışımı, sadece kullanımdan önce katılaşmasını karışımı önlemek için kısa bir zaman süresi için oda sıcaklığına maruz olmalıdır. ihtiyaç kadar Tripsin çözümü de soğutulmuş tutmak gerekir; Seçenek olarak ise, tripsin 1.5 adım tamamlandıktan sonra -20 ° C depolama alınabilir.
3. DMEM (hiçbir eklenen serum, soğutulmuş): protein karışımı 1:25 seyreltme hazırlayın. Her plaka hazırlanan protein karışımı / DMEM uygun hacimde aktarın. 35 mm cam tabanlı plakalar için tam plakanın altındaki iç cam daire kapsayacak şekilde yaklaşık 200 ul ekleyin.
4. güvenlik kabini içinde ve oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle oturmaya plakaları bırakın. Bu süre içinde, su banyosu içinde 37 ° C,% 10 NCS ile sıcak DMEM.
5. hemen önce sonraki adımlara 37 ° C su banyosunda sıcak tripsin.
6. Bir cam pipet ve emme kullanarak kültür şişelerinde şu anda DMEM çıkarın. Sıcak steril PBS ile balonun yıkayın zemin kalan DMEM artıklarını çıkarın.
7. şişeyi alttan önceden kültüre düz kas hücreleri çıkarmak:
   NOT: Flask hücreleri plaka hazırlanmasından önce istenen confluency (yaklaşık% 80) ulaşmak için izin vermek için bu adımı gün kuruldu. Hücreler ilk olarak% 10 NCS DMEM, 20 ml bir şişe içinde süspansiyon haline getirilmiş ve DMEM kaynağı tazelendi ve hücreler inkübatöre geri konuldu, sonra, 24 saat için,% 5 _CO2 kaynağı ile 37 ° C'de inkübe edildi. DMEM eve tazelendiHücreler birleşmeye ulaşana kadar ry 48 saat bu ilk adımları izleyerek.
   1. Yıkama tripsin 1 ml hızlı şişe ve daha sonra emme ile 1 ml tripsin çıkarın.
   2. Tripsin bir 1 ml ekleme ve enzim, şişenin tüm alt ile temas sağlamak için balon swishing, daha uzun bir süre (yaklaşık 30-60 saniye) bekletin.
   3. şişeden ayrılma memnun kadar mikroskop altında müstakil ne kadar hücreler gözlemleyin. şişeden ayrılan hücrelerin oranı ile memnun kadar alternatif hışırtı tripsin solüsyonu ve kontrol hücre dekolmanı.
      NOT: şişesi 37 ° C'de bu süreci hızlandırmak için yaklaşık 30-60 saniye boyunca inkübatör iade edilebilir.
   4. Hücreler tripsin kullanılarak yerinden alındıktan sonra (tripsin şişede toplam hacminin 1/8 ^inci oluşturacak şekilde yeterli hacmi), tripsin reaksiyonu durdurmak için şişeye% 10 NCS ile taze DMEM ekleyin.
      Not: 250 ml'lik bir kültür şişesi ile, örneğin, bu olur7 mi DMEM hücre çözeltisine 8 ml ile sonuçlanması tripsin 1 ml üzere eklenir.
8. Temiz (etiketlenmiş), 50 ml konik tüp şişeye hücre çözeltisi elde transferi.
9. Her plaka 1 ml taze DMEM artı% 10 NCS ekle (yeterli ortam 24 saat sürecek) hazırlanmaktadır.
10. Yavaşça tüp oluşmuş olabilecek pelet kırmak için hücre çözümü birden çok kez içeren ters çevirin.
11. Pipet Her plaka içine yavaşça karma hücre çözeltisinin hacmi istenen.
    NOT: Bu protokol için kaplama önerilen SMC'lere numarası 35 mm kültür kaplarına başına 0.5-0.8 x 10 ^6. Bu numaralar hücre tipine bağlı olarak değişebilir ve her bir laboratuar tarafından test edilmiş ve modifiye edilmelidir.
12. Cam alt kısmında hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için iyice / saat yönünün tersine her plaka girdap.

D1SR Ca ²⁺ Göstergesi Taşıma adenoviral Vektör 2. Geçici Transfeksiyon

1. Benim ilavesinden sonradium ve her bir plakanın hücre çözeltisi hücre yemekler altındaki cam doğru bağlamak için izin vermek için en az 1 saat boyunca _CO2 kaynağı 5% ile 37 ° C'de inkübe plakaları bırakın. Hücreler açıkça bağlı olan kadar 15 dakika aralıklarla mikroskop altında plakaları kontrol edin.
2. -80 ° C depolama adenovirüs-D1SR kısım Al ve biyolojik güvenlik kabini için taşımak için mobil buz banyosu içinde tutmak.
3. Pipet Arzu edilen doz, her plakaya soğutulmuş D1SR arasında (100 enfeksiyon çokluğu).
   Not: plaka başına gerekli adenoviral çözelti hacmi hesaplama plak oluşturucu birim (pfu) olarak gösterilen orijinal stok solüsyonu, virüs titresi bağlıdır. Bizim deneyime dayalı, biz kültür plakasına bir düz kas hücresi (SMC) bulaştırmak için gerekli sayı veya virüs partikülleri olarak yorumlanır 100 enfeksiyonu (İçişleri Bakanlığı), çokluğu öneriyoruz.
4. % 5 _CO2 kaynağı O / N 37 ° C 'de enfekte hücreleri inkübe edin.
5. Ertesi gün, taze DMEM 1 ml artı% 10 NCS hücreleri doldurmak.
6. _CO2 göre O / N,% 5 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde inkübe edin.

FRET tabanlı Confocal Görüntüleme Kullanılması 3. Ölçüm SR Lüminal Ca ²⁺

1. O / N inkübe edildikten sonra, plaka kültür ortamı çıkarın.
2. Ihtiva eden 1 ml ılık fizyolojik Hepes-PSS tamponu ile kültürü plakası yıkayın (mmol·L bölgesindeki ^{- 1)} NaCl 140, glükoz 10, KCI 5, HEPES 5, _CaCl2 1.5 ve _MgCI2 1 (pH 7.4) ile üç kez.
3. hemen önce kayıt başlamadan 1 ml taze sıcak HEPES-PSS tamponu ekleyin.
4. konfokal mikroskop ilişkili yazılım üzerinde FRET SE (Hassaslaþan Emisyon) uygulaması (veya benzer bir özellik) kullanarak başlangıç ​​görüntüleme gerçekleştirin.
   1. Uygulama açıldıktan sonra, istenilen deneysel koşullar elde etmek için ayarları yapmak için "Setup" sekmesine tıklayın.
   Manuel kanal ayarlarını değiştirin. (Donör için) 488 nm ve 535 nm (FRET ve alıcı için) emisyon dalga boylarını toplayın.
   2. ve maruziyet arasında 10 sn aralıklarla (üç ardışık CFP donör, FRET ve YFP alıcı kanalları için kayıt süresi) hücrelerin 150 ms uyarma pozlama süresi ile,% 15 iletim ışığın yoğunluğunu ayarlayın.
5. mikroskop sahnede plaka stabilize.
6. görüntü çözünürlüğünü kontrol etmek için "Canlı" düğmesini kullanın. İstenilen çözünürlük ulaşılana kadar daha ince ayar.
7. Yine "Kur" sekmesi altında, "Yakalama görüntü" düğmesini kullanarak örnek bir görüntü alır.
8. "Değerlendirme" sekmesine taşıma, deneyler için FRET verimlilikleri yapılıyor hesaplamak için uygun yöntemi seçin. Yöntem 3, oranlı metrik hesaplama [E _A (i) = B / A kullanarak], Örneğin D1SR göstergesi olarak cameleons içeren deneyler için tavsiye edilir.
9. yoğunluk değerleri deney sırasında grafik şeklinde kaydediliyor gözlemlemek mümkün "Graph" sekmesine geçiş.
10. Deney ilerledikçe grafik üzerinde ilgi bu alanda karşılık gelen ortalama yoğunluğunu gözlemlemek için görüntü izleyicide bir ROI çizin.
    NOT: Araştırmacı aynı zamanda birden fazla ROI'ları çizmek ve şiddetleri kaydedildi ve grafik üzerinde eş zamanlı olarak gösterilebilir gelen var seçebilirsiniz. Alternatif olarak, araştırmacılar ilk kayıt için tek bir yatırım getirisi anahat ve yazılım veri analizi odaklı versiyonunda deneme dosyasını açarak bir sonraki seferde birden fazla ROI'leri anahat geçebilirsiniz.
    NOT: FRET-tabanlı deneyler kurmak için gerekli adımlar hakkında ilave detay FRET uygulama sihirbazı kılavuzları bulunabilir. mikroskop FRET Sihirbazı ile donatılmış değilse, aşağıdaki protokol parametrelerini ayarlamak için kullanılabilirManuel kayıt.
11. Kaydı başlatmak ve önceki faiz ajan tanıtmak için sinyalin sürekli bazal kaydedilmesini sağlamak için en az 3 dakika süreyle veri toplama izin verir.
12. -moving Maddesi Ca2 ⁺ tanıtılması (örneğin 2 uM thapsigargin 100 nm endotelin-1) elle İlgi varlığın bölgeye kadar yakın bir noktada plaka doğrudan önceden tespit edilmiş bir doz pipetleme SR Ca2 ⁺ tüketen için bir araç olarak mümkün olduğu kaydedilmiştir. istenen zaman sonrası tedavi için kayıt devam edin.
13. Yakalama oranlı metrik FRET SE uygulamasını kullanarak konfokal ters mikroskop 63X yağ daldırma amacı ile seri görüntüler (512 x 512 piksel) FRET.
14. biçimlendirmek ve istatistik tabanlı yazılım kullanarak analiz sonradan faiz (ROI) her bölgede 5-10 SMC'lerin bir kümesinden görüntüleme kaynaklanan verileri toplamak ve.
    1. daha sonra kullanmak için verileri kaydetmek için, kaydedilen iz üzerinde sağ tıklayın ve sav "Export" seçeneğiaraştırmacının seçtiği sürücüsünde kaydedilen ortalama sinyal şiddetleri ile e-tablo.
    2. zaman noktasında 0 sn gözlenen başlayan yoğunluk değerine göre her veri noktası bölerek her deneyden veri normalleştirmek.
    3. elle kopyalama ve özgün tablo / sn alakalı veri satırlarını yapıştırarak bir istatistik programı proje dosyasına elektronik tablolar İthalat normalize veri.
    4. Otomatik olarak programa yapıştırılan veri setine karşılık gelen grafikler oluşturmak.
       NOT: Programın varsayılan ayarları içe aktarılan verilerin satır grafikler oluşturmak. Görüntülenen grafiğin tipi ana araç içinde bulunan başlığinı "Değişim" başlığı altında "grafiğin farklı bir türü seçin" butonuna tıklayarak değiştirilebilir.
    5. Tek bir veri sayfası içine özdeş deneyler daha büyük bir grup içinde birden fazla bağımsız denemeler temsil Havuz verileri gerçekleştirilen özel test için ortalama bir iz üretmek.

Sitoplazmik Ca 4. hazırlanması ²⁺ Gösterge

1. Siyah bir mikrosantrifüj tüpü içinde, dimetil sülfoksit (DMSO), 1 ml 0.0125 g pluronik asit (PA) içinde çözündürülür (PA çözülür yardımcı mobil su banyosu içinde tüp sıcak gerekebilir).
2. -20 ° C depolama sitoplazmik Ca ^{2 +} gösterge boya (Fluo-4 AM) bir boru (50 ug) Al.
3. ışık ile temas mümkün olduğunca korunması için folyo boyanın boru sarın.
4. Pipet boya içeren bir tüp içine DMSO + PA çözeltisi 45 ul. Oda sıcaklığında folyo ve mağaza DMSO + PA çözüm sarın.
5. iyice çözüm yukarı ve aşağı birden çok kez pipetleme tüp içeriği karıştırın. Seçenek olarak ise, 10 dakika boyunca, boya tüp sonikasyon.
   NOT: iyice yeterli olacaktır DMSO + PA çözeltisi boyunca boya dağıtmanın iki yöntem; sadece araştırmacının bir tercih meselesidir. Araştırmacı çözümü ses dalgalarına maruz seçerse, onuDiğerleri gürültü etkilenmez edilecek bir izole alan / odada yapılmalıdır. Araştırmacı ayrıca kulaklarını korumak için ağır susturucular kullanmalıdır.
   1. Çözümü sonicating ise 2/3 tam (ile dH ₂ O) sonikatör banyosu içinde bir köpük tüp tutucu ve yerin içinde boya içeren folyo sarılı tüp yerleştirin.
   2. izole alan / odası ve güç makinesinde yer sonikatör banyosu (koruyucu Şapkalar sağlamak önceki sonikasyon işlemini başlatmadan yerinde olduğundan). odadan ve tüp (mümkün olduğunca uzun için ışıktan korumak için folyo ile sarılmış tutmak) o kapatılması ve almadan önce 10 dakika süreyle çalışan makineyi bırakın.
6. karanlık mikrosantrifüj tüpler içine şimdi iyice karışık bir çözüm alikotu (tüp başına 5 ul, 10 tüpler toplam yapmak mümkün olmalıdır).
7. folyo Her eş pay, tüp sarın. kullanılana kadar -20 ° C koşullarda kurutucu Etiket tüpler saklayın.

5. Sitoplazmik Ca ölçümü ^{2 +}

1. Sıçan aort SMC'lerin kültür plakaları hazırlamak için 1.1-1.12 adımları izleyin.
2. 48 saat sonrası kültüründe plakadan kültür ortamı çıkarın.
3. -20 ° C depolama sitoplazmik Ca ^{2 +} göstergesi (5 ul), daha önce hazırlanmış kısım çıkarın ve kullanılana kadar mobil buz banyosu içinde muhafaza.
4. Ihtiva eden 1 ml ılık fizyolojik Hepes-PSS tamponu ile kültürü plakası yıkayın (mmol·L bölgesindeki ^{- 1)} NaCl 140, glükoz 10, KCI 5, HEPES 5, _CaCl2 1.5 ve _MgCI2 1 (pH 7.4) ile üç kez.
5. Sıcak HEPES-PSS 1 ml göstergesi karıştırın ve kültür plaka üzerine yerleştirin.
6. Oda sıcaklığında 1 saat için bir gösterge (24 ° C) SMC'lerinin inkübe edin.
7. kültür plakasından göstergesini çıkarın ve 1 ml ılık fizyolojik HEPES-PSS tamponu üç kez yıkayın.
8. hemen önce kayıt başlamadan 1 ml taze sıcak HEPES-PSS tamponu ekleyin.
9. Bir 63X o seri görüntüler (512 x 512 piksel) Yakalamakonfokal ters mikroskop il-daldırma objektif.
   1. El ile hücreler 488 nm heyecanlı böylece ayarlarını değiştirmek ve emisyon dalga boyları 700 Hz tarama hızı ile 555 nm toplanır.
   2. Hücrelerin 150 msn uyarma maruz kalma süresi (hücre kayıt sırasında belirlenen zaman aralıklarında ışığa maruz kalan süreyi) ve maruziyet arasındaki 5 sn aralıklarla,% 15 iletim ışığın yoğunluğunu ayarlayın.
10. Mikroskop sahnede plaka Stabilize ve kaydetmeye başlayın.
11. en az 3 dakika süreyle kayıt önce ilgi maddenin eklenmesi, sinyal sabit bir taban kayıt sağlamak.
12. (Adım 3.16 tarif edildiği gibi) ^{2 +} SR Ca tüketen ve zaman tedavi sonrası istenen miktarda kayıt devam için bir araç olarak Ca2 ⁺ -moving madde (örneğin, 2uM thapsigargin) sunar.
13. Kayıt sinyal yoğunluğu floresan si ortalamasını alarak mikroskop özel yazılımını kullanarakFaiz (ROI) her bölgede 5-10 SMC'lerin bir kümeden gnals (F / F _0). Toplamak biçimi ve veri analiz yazılımı kullanılarak görüntüleme kaynaklanan verileri analiz. Bu yazılımı kullanarak veri toplama tanımı ve analizi için Adımlar 3.18.1-3.18.5 bakın.

Sonuçlar

Bu bölüm, dolaylı sitoplazmik Ca dalgalanmaları gözlemleyerek Ca ^{2 +} deposu konsantrasyonları organele değişiklikleri ölçmek yaygın olarak kullanılan şekilde göre SR lümen Ca2 ⁺ konsantrasyonu verilerini yakalamak için tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini içerir ²⁺ .

Şekil 1A YFP kanal (514 nm uyarma / 535 nm emisyon) 'de D1SR adenovirüs...

Tartışma

Bu protokol SR lümeninde Ca ^{2 +} kavkıdaki D1SR adenovirüs ile VSMC'Ierin aktarıldığı açıklanmaktadır. Bu yöntem, doğrudan bu organel olan ^{Ca2 +} ölçümü hem de değişik kalsiyum hareket eden maddelerin uygulanmasının bir sonucu olarak SR üzerinden içindeki hareketinin / sağlar. Bu yöntem SR ve sitoplazmik Ca ^{2 +} düzeyleri değişiklikleri genel hücresel sağlığını etkiler ve nasıl bu değişiklikler birbiriyle ilişkili nasıl kapsamlı bir anlayış doğrultusunda çalışan araştırmacılar için birç...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (yüksek glikoz, piruvat)	Yaşam teknolojileri	11995-065	37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Matrigel Basement Membran Matris Büyüme Faktörü Azaltılmış, 5 ml	Corning	356230	20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar C
Yenidoğan Buzağı Serumu	Sigma-Aldrich		-20 ° C'de tutun; Kullanmadan hemen önce C
35 mm cam tabanlı plakalar	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 & mu; M havalandırmalı mavi fişli conta kapağı şişesi	BD Falcon	353136
Tripsin/EDTA Çözeltisi	Ömrü teknolojileri	25200056	-20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar
C 50 ml Polipropilen Konik Boru	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Hediye
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-	Yaşam teknolojileri	F-23917	-20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar C
1.5 ml Siyah Mikrosantrifüj Tüpleri	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 konfokal mikroskop	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (FRET SE Wizard uygulaması ile)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.

-