Yöntem makalesi
Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.
Vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC'ler) sarkoplazmik retikulumunda (SR) kararlı durum kalsiyum (Ca2+) seviyelerinin korunması, genel sağlıkları için hayati önem taşır. Hücre içi Ca2+ içeriğinin önemli bir kısmı VSMC'lerdeki SR depolarında bulunur. Plazma zarı-SR bağlantıları yoluyla çevredeki hücre dışı boşlukla yakın ilişkisi olan tek hücre içi organel olan SR'nin, Ca2+ geçici olaylarındaki herhangi bir düzensizliğe veya hücrenin yaşadığı strese ilk yanıt hattını oluşturduğu düşünülebilir. Pek çok işlevi arasında, en önemlilerinden biri, aşağı akışta hücre çapında daha fazla reaksiyonu indüklemek için hücre boyunca Ca2+ tarafından düzenlenen sinyallerin iletilmesindeki rolüdür. Bu bağlamda sitoplazmik Ca2 + göstergelerinin daha yaygın kullanımı, intraluminal SR Ca2 + deposunda henüz tam olarak karakterize edilmemiş olan oldukça dinamik değişikliklerin araştırılması için genel olarak yetersizdir. Burada, luminal SR Ca2 + 'nın doğrudan ve net ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu araç, hücrenin normal işlevi ve sağlığı üzerinde daha sonra önemli etkileri olan SR Ca2 + 'daki nüanslı değişikliklerin araştırılması için kullanışlıdır. Özellikle SR Ca2+ içeriğindeki dalgalanmalar, hücrenin yaşadığı hastalık veya stres durumlarına hücresel tepkilerle ilgili önemli miktarda bilgi sağlayabilir. Bu yöntemde, SR hedefli bir Ca2+ göstergesinin değiştirilmiş bir versiyonu olan D1SR, ajanların kültürlenmiş sıçan aort düz kas hücrelerine (SMC'ler) girmesine yanıt olarak Ca2+ dalgalanmalarını tespit etmek için kullanılır. D1SR indikatörü ile inkübasyonun ardından, konfokal floresan mikroskobu ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı görüntüleme, kontrol koşulları altında intraluminal SR Ca2+ seviyelerindeki değişiklikleri doğrudan gözlemlemek için ve hücre içi Ca2+ hareketini indüklemek için işlev gören agonist ajanların eklenmesiyle kullanılır.
Ca 2 + vücuttaki her hücre içinde bolca bulunan çok önemli bir iyon olduğunu. Bu büyüme, çoğalma, göç ve apoptosis 1-4 dahil olmak üzere birçok farklı hücresel fonksiyonları, önemli rolleri vardır. İyi Ca 2 + hem doğrudan hem de dolaylı eylemlerle bu süreçleri etkileyebilir olduğunun tespit edilmesi ve bu nedenle, bu iyonun normal hücre içi konsantrasyonları değişiklikleri kolayca etkilenen hücreler için olumsuz sonuçlara neden olabilir. SR hücresinin 5 içinde en büyük hücre içi Ca 2 + mağaza olarak kabul edilir. SR ve sitoplazma hem de Ca 2+ kararlı durum düzeyleri normal içine ve bu organel Ca 2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Etik deyimi: Bütün deneyler ve prosedürler British Columbia, Vancouver, Kanada Üniversitesi Laboratuvar Biyogüvenlik kurallarına anlaşma yapılmıştır.
FRET tabanlı Konfokal Mikroskopi için 35 mm Cam-bottom Kültür Yemekleri hazırlanması 1.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu bölüm, dolaylı sitoplazmik Ca dalgalanmaları gözlemleyerek Ca 2 + deposu konsantrasyonları organele değişiklikleri ölçmek yaygın olarak kullanılan şekilde göre SR lümen Ca2 + konsantrasyonu verilerini yakalamak için tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini içerir 2+ .
Şekil 1A YFP kanal (514 nm uyarma / 535 nm emisyon) 'de D1SR adenovirüs.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol SR lümeninde Ca 2 + kavkıdaki D1SR adenovirüs ile VSMC'Ierin aktarıldığı açıklanmaktadır. Bu yöntem, doğrudan bu organel olan Ca2 + ölçümü hem de değişik kalsiyum hareket eden maddelerin uygulanmasının bir sonucu olarak SR üzerinden içindeki hareketinin / sağlar. Bu yöntem SR ve sitoplazmik Ca 2 + düzeyleri değişiklikleri genel hücresel sağlığını etkiler ve nasıl bu değişiklikler birbiriyle ilişkili nasıl kapsamlı bir anlayış doğrultusunda çalışan araştırmacılar için birç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Bu çalışma [CVB & ME MOP-1112666] Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri fon tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (yüksek glikoz, piruvat) | Yaşam teknolojileri | 11995-065 | 37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Matrigel Basement Membran Matris Büyüme Faktörü Azaltılmış, 5 ml | Corning | 356230 | 20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar C |
| Yenidoğan Buzağı Serumu | Sigma-Aldrich | -20 ° C'de tutun; Kullanmadan hemen önce C | |
| 35 mm cam tabanlı plakalar | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| 250 ml 0.2 & mu; M havalandırmalı mavi fişli conta kapağı şişesi | BD Falcon | 353136 | |
| Tripsin/EDTA Çözeltisi | Ömrü teknolojileri | 25200056 | -20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar |
| C 50 ml Polipropilen Konik Boru | BD Falcon | 352070 | |
| D1SR | N/A | N/A | Hediye |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Fluo 4- | Yaşam teknolojileri | F-23917 | -20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar C |
| 1.5 ml Siyah Mikrosantrifüj Tüpleri | Argos Technologies | T7100BK | |
| Leica TCS SP5 konfokal mikroskop | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite 2.6.3 (FRET SE Wizard uygulaması ile) | Leica Microsystems | ||
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Software, Inc. |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste