Biyofilm İlişkili Hedefleme<em&gt; Staphylococcus aureus</emKullanma&gt; Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi

Özet

Çoğu bakteriyel enfeksiyon bir biyofilm üretir. Çevreleri nedeniyle, biyofilm ile ilişkili bakteriler genellikle fenotipik olarak ilaca dirençlidir. Biyofilmlerdeki bakterileri öldüren yeni antibakteriyel moleküller bu nedenle yüksek bir önceliğe sahiptir. Biyofilmleri yok etmede etkili olan antimikrobiyal bileşikleri hızlı bir şekilde taramak için bir test oluşturuyoruz.

Özet

Çoğu patojenik bakteri enfeksiyon sırasında biyofilm oluşturabilir, ancak biyofilmleri manipüle etmenin ve değerlendirmenin zorluğu nedeniyle, laboratuvar çalışmalarının büyük çoğunluğu planktonik hücrelerle yürütülür. Burada, Staphylococcus aureus ile gerçekleştirilen bir peg plaka biyofilm testini açıklıyoruz. Bakteriyel biyofilmler, 96 oyuklu bir mikrotitre plaka kapağına tutturulmuş mandallar üzerinde büyütülür, tampona hafifçe daldırılarak yıkanır ve bir ilaç meydan okuma plakasına yerleştirilir. Sonraki inkübasyondan sonra tekrar yıkanırlar ve floresan boya resazurinin bir canlılık göstergesi olarak işlev gördüğü son bir geri kazanım plakasına taşınırlar. Bu tahlil, kinetik okuma olarak yürütüldüğünde büyük ölçüde artırılmış kullanım kolaylığı, güvenilirlik ve tekrarlanabilirliğin yanı sıra çok sayıda veri sunar. Ayrıca, bu tahlil, ilaç keşif çabaları için bir yol sunan, bunun yerine bir son nokta floresan okumasının alındığı orta verimli bir ilaç tarama yaklaşımına uyarlanabilir.

Giriş

Patojen mikropların olmayan akut kronik enfeksiyonlara ¹ giden in vivo biyofilm oluşturabilir. Biyofilm ilişkili enfeksiyon yabancı cisimler (örneğin, suni kemik değişimleri, meme implantları) veya trakea tüpler veya üriner kateterlerin ² kurulumu implantasyonu içeren tıbbi prosedürler ciddi bir risk faktörüdür. Biyofilm tabanlı enfeksiyonlar nadiren kendi temizlenir olarak bu bağlamlarda, anti-enfektif tedavi bile immün sistemi sağlıklı bireylerde, hemen hemen her zaman gereklidir. Staphylococcus aureus kullanımı sırasında ortaya çıkan biyofilm ilişkili komplikasyon karıştığı En sık görülen patojenlerden biridir invazif tıbbi cihazlar ^3.

Ne yazık ki, koruyucu bir bariyer olarak biyofilm doğası planktonik hücreler ^1,4 den tedaviye onları daha dirençli hale getirir ve tahmin klinik etkinliği değerlendirilmesi hem ilk kritik bir parçasıdırilaç geliştirme yanı sıra ilaç direnç gözetim. Planktonik kültürler üzerinde duruldu laboratuvar koşulları, sadakatle gerçek dünya hastalığı ⁵ temsil olmayabilir artan bildirim yoktur. Sorunu daha bileşik, biyofilm fenotipleri çoğaltma zordur ve mevcut biyofilm modelleri sıkıcı ve yüksek içi ve tahlil değişkenliği ⁶ muzdarip. Böylece, birçok araştırmacı, zorunluluk yoluyla, böylece potansiyel bakteriyel virulans ve hastalığın önemli bir yönünü ihmal, uyuşturucu duyarlılık planktonik hücre deneyleri için varsayılan.

Burada özellikle, bakteri tahlil için S. protokolü açıklamak aureus, 96 oyuklu bir göre biyofilm sistemi ^7,8 kullanarak önceden büyümüş Biyofilmlererde. biyofilm oluşumu ve meydan okuma için protokol esas üreticinin tavsiye takip ederken, biz biof canlılığı ölçülmesi için alternatif bir bilgi açısından zengin bir metodoloji sunmakmücadeleden sonra ilm. Kısaca, bakteriler, biyofilm levhanın kapak takılı çıkıntı yapan mandal üzerinde oluşan mandal plakası, kültürlenir. biyofilm sonra mandal yavaşça planktonik hücrelerini uzaklaştırmak için PBS ile dolu yeni bir levhanın gözleri içine daldırılır. PEG kapaklı ekli biyofilm ile deneye tabi antibiyotik çeşitli konsantrasyonlarını içeren, yeni bir meydan okuma plakasına aktarılır. ikinci bir inkübasyondan sonra, kapaklar daha çıkarılır, yıkanır ve son bir inkübasyon maruz boya, resazurin ihtiva eden bir geri kazanma plakasına aktarılır. Resazurin dönüşüm kinetik kaydedilmiş veya tanımlanmış bir iyileşme döneminden sonra bir bitiş noktası okuma olarak alınabilir. Biyofilm canlılığını nicel Bu boya temelli yöntem sıkıcı CFU (koloni oluşturan birim) önemli ölçüde orijinal protokolde ^7'de tarif saymak tabanlı bir metodoloji farklıdır. İlaç meydan plaka ve dönüşüm kinetiği resazurin OD ₆₀₀ ölçümler canlılığı okundu olarak hizmetbiyofilm hayatta kalmak için hızlı, güvenilir, bilgi açısından zengin ve teknik basit tahlil sunan sırasıyla planktonik ve biyofilm hücrelerinin çıkışları.

Protokol

1. Biyofilm Başlatma

1. bir besleyici zengin ortam içinde biyofilm üreten bir organizmanın bir kültürü büyütün. Bir gliserol stokundan Mueller-Hinton ortamı, 10 ml Staphylococcus aureus suşu Newman inoküle. S. taşıma ile ilgili tüm çalışmaları gerçekleştirmek eldiven ve bir biyogüvenlik kabini içinde aureus.
2. bir döner sallayıcı (100-200 rpm) ile 37 ° C'de 16 saat süreyle inkübe edilir.
3. Bir spektrofotometre ve standart bir küvet (: 1cm yol uzunluğu) ile kültür OD ₆₀₀ belirleyin.
4. Formül kullanılarak chelexed Roswell Park Memorial Institute ortam (cRPMI) ^9, 0.1 OD _{600 (inokulum)} ile inokulum 20 mi hazırlamak için gerekli kültür hacmi (V) hesaplayın: [V = 20 mi x 0.1 / OD _{600 (kültür )]}
   Not: Referans 9 cRPMI hazırlanması ayrıntıları sağlar.
   1. 10.000 x g'de 1 dakika için iplik, bir santrifüj tüpüne ve topak hücrelere (yukarıdan) hesaplanan kültür hacim. hazırlık aşamasında içinbiyofilm inokulum yeniden 20 ml cRPMI harcanan büyüme ortamı ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire.
5. 25 ml'lik bir hazne içine inokulum dökün.
6. Dikkatle yukarı doğru çekerek steril 96-yuvalı peg plaka kapağı çıkarın.
   Not: Bakım aşağı kapağın sarkan mandal kirletmesine dikkat edilmelidir. kapak bir biyogüvenlik kabini içinde temiz bir yüzeyin üstünde ters yerleştirilebilir.
7. 200 ul çok kanallı pipet kullanarak, taban plakasının G sıraları her oyuğuna 125 ul inokulum ekleyin.
8. sterilite kontrolü olarak H sırası, her oyuk 125 ul steril cRPMI orta doldurun.
9. peg-kapağı atın ve aşağı bakacak şekilde mandal ile plaka alt yukarıda tutun. Dikkatle kendi kuyuları ile bireysel mandal aynı hizaya getirin. plaka ve mandal arasındaki fiziksel temastan kaçının. hizalanmış sonra, dikkatlice aşağı kapağı indirin. mandal sonra gerçekleştirilen yeniden düzenlemeler alt plaka devam edebilir dokundu olarak misalignments kaçınınSatır H. aminat kısırlık kontrolleri
10. sıkı sızdırmazlık, bir yapışmalı plastik bir torba içinde buharlaşmasını ve yer önlemek için parafin film ile plaka kapağı kapatılmalıdır. buharlaşmasını en aza indirmek için mümkün olduğunca düşük çantada hava hacmini tutun.
11. % 5 _CO2 inkübatöründe 48 saat süreyle 37 ° C'de çalkalanmadan inkübe edin.
    Not: büyüme 48 saat S. için optimal olmuştur aureus, ancak değişir kullanılan organizmaya göre.
    Not: Statik inkübasyon iyi bir başlangıç ​​noktası olmasına rağmen hafifçe bir mikro-çalkalayıcı üzerinde 150 rpm'de sallayarak, tahlil optimize etmek için bazı S. biyofilm oluşumunu artırabilir olası bir varyasyon aureus izole eder.

Biyofilm Mücadelesi Plate 2. Hazırlık

1. tutarsız sonuçlar önlemek için biyofilm meydan okumanın yapıldığı gün taze 96-yuvalı plaka almak ve H. B sıranın her çukuruna, oda sıcaklığına dengelendi cRPMI 100 ul, ilave 200 ul tutabilecek bir 96 oyuklu plaka kullanılmasıortam mandal içinde, ve biyofilm başlangıç ​​plakasının özdeş boyutlara sahip kuyu olduğu takdirde,.
2. Aşama 2.7 nihai bir seyreltme için hesaba katmak için, arzu edilen nihai konsantrasyonu 2x cRPMI 1.0 ml ayrı 4 test bileşiklerine kadar seyreltilir.
   Not: İyi bir başlangıç ​​noktası planktonik hücreler inhibitör konsantrasyonun üzerinde 8 kat daha fazladır.
3. A3, kuyu A12 A10 A9 kuyu A7 A6 kuyu A4 bileşik 2, bileşik 3 ve 4 bileşiği için kuyu A1 bileşik 1 200 ul ekle.
4. Seri, çok kanallı pipet kullanarak test bileşiklerinin sulandırmak ve B satır ve karıştırmak için satır A 100 ul aktarın.
5. Bu şekilde, iyi iyi 100 ul transfer devam etmektedir. Her aktarımdan sonra karıştırın ve satır F durdurmak
6. karıştırıldıktan sonra, bir atık kabı içine satır F 100 ul sınırdışı. satırlar G ve H. herhangi bir sıvı transferi yapmayın
7. Bir çok kanallı pipet kullanılarak plakanın her oyuğuna cRPMI 100 ul ekle200 ul hacim getirmek. Nihai plaka düzeni için Şekil 1'e bakınız.

3. Biyofilm Mücadelesi

1. biyofilm başlangıç ​​plakasının özdeş boyutlara sahip kuyu özellikleri taze, steril 96 gözlü plaka, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 200 ul ekle.
2. kuluçkaya biyofilm başlatma plakadan plastik torba ve parafin filmi çıkarın.
3. yukarı doğru kapağını kaldırın. biyofilm zarar verebilir, bu kadar mandal ve plaka alt kısmı arasındaki temastan kaçının. (3.8 bakınız) sonraki OD ₆₀₀ analiz için alt kısmını tutun.
4. (Adım 3.1) PBS içeren plaka üzerine tahta kapağı koyarak planktonik hücreler durulayın. PBS üzerinden kaldırın, 5 sn mandal Batmak ve iyi tarafı karşı mandal vurmak için dikkatli olmak, bir kez daha daldırın.
5. meydan plakası içine durulanır topaç kapağı yerleştirin. biyofilm giden zarar verecek bu kadar mandal ve alt plaka arasında gereksiz temastan kaçınıntutarsız sonuçlar.
6. Adım 1.10 açıklandığı gibi mühür parafin film ile plaka ve yapışmalı plastik torbaya koyun.
7. % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 24 saat boyunca çalkalamadan plaka inkübe edin.
8. 3.3 ile biyofilm başlangıç ​​plakanın alt alın. Iyi, çok kanallı pipet kullanarak her bakteri tekrar süspansiyon ve satır H. tüm kuyulara ama sterilite kontrolü meydana gelen büyüme onaylamak için uygun bir mikroplaka okuyucu ile OD ₆₀₀ ölçmek

4. Biyofilm Belirlenmesi

1. dönüşüm resazurin tespit etmek için bir kuluçka odası ve kinetik floresan okumaları alma yeteneğine sahip ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanın. 530 nm uyarma ve 590 nm emisyon kullanarak 24 saat kinetik floresan ölçümü ayarlayın.
2. 37 ° C oda sıcaklığını ayarlamak ve plaka her 20 dakikada okudum. üreticinin Okt. göre plaka tabanından ölçmek için plaka okuyucusu ayarlamaleri.
3. Bir steril 96 oyuklu bir plaka çok kanallı bir pipet ile 200 ul PBS ilave edilerek Plakayı hazırlayın.
4. 0.8 mg, 400 ul ekleyerek biyofilm geri orta hazırlayın / 16 ug / ml resazurin nihai bir konsantrasyona kadar cRPMI ortamı 20 ml stok çözeltisi resazurin ml.
   Not: Resazurin bilinen bir cilt tahriş edicidir. işlenirken bir laboratuvar önlüğü, gözlük sıçrama ve eldiven kullanın. biyofilm kurtarma ortamı olarak cRPMI en düşük arka plan sinyali sağlar, çünkü kullanılan, ancak uygun eğer Mueller Hinton medya tarafından değiştirilebilir.
5. taze 96-yuvalı plakanın her oyuğuna çok kanallı bir pipet ile biyofilm geri kazanım aracına 150 ul ekle.
6. Bir biyogüvenlik kabini içine inkübatör transfer meydan plakası ve dikkatle plastik torba ve mühürleme filmi çıkarın.
7. meydan plaka tahta kapağını çıkarın ve 3.4 açıklandığı gibi PBS içinde planktonik hücreler durulayın. Sonraki OD ₆₀₀ ana için zorluk plakanın alt tutunerimesi (4.10 bakınız).
8. duruladıktan sonra, biyofilm kurtarma ortamı içeren plaka dibine tahta kapağı yerleştirin.
9. çevre kuyuların dibine engel için dikkatli olmak, parafin film ile plakanın yan sarın. Hemen plaka tamamlamasından sonra, plaka okuyucusu üzerine yerleştirin ve adım 4.1 daha önce kinetik protokol resazurin yapılan başlatarak 24 saatlik bir süre boyunca, bir kinetik okuma başlar.
10. Ya da zorlukla sırasında meydana olmayabilir planktonik hücrelerin büyümesini ölçmek için, bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak, tüm zorluk plakası alt OD ₆₀₀ oku. Adım 3.8'de verilen talimatları izleyin.
    Not: Dikkatle iyi biyofilm kapalı dökülme hücreler kuyunun dibinde yığınlarda büyürler her içeriğini tekrar süspansiyon. Kuyunun içinde herhangi bir baloncuklar kuvvetle OD ₆₀₀ okuma engeller ve kaçınılması veya okuma öncesinde çıkarılmalıdır.

Sonuçlar

resazurin deney güvenilir mücadeleden sonra, ilaç barındırmayan ortam içinde replike edebilen çok az canlı hücreleri saptamak için yeterince hassastır. Bu metodoloji, biz hiçbir resazurin dönüşüm 24 saat içinde görülür ki en düşük konsantrasyon olarak en az biyofilm ortadan kaldırılması konsantrasyonunu tanımlar. resazurin tahlil pembe maviden boya rengi dönüştürmek metabolik olarak aktif hücrelerde bulunan oksidatif moleküller dayanır. Boya dönüşümü, bundan ötürü hücre büyümesinin bir g...

Tartışma

Burada, S. üzerinde test inhibitörlerinin aktivitesinin belirlenmesi için bir tadil edilmiş biyofilm tahlili tarif etmişlerdir biyofilm ilişkili hücrelerin metabolik durumuna odaklanan aureus biyofilm. açıklanan biyofilm başlatma ve meydan prosedürleri çoğunlukla taklit üretici tavsiyelerine rağmen, 24 saat inhibitörü meydan hayatta biyofilm ilişkili hücreleri tespit ve ölçmek için boya resazurin kullanımı dramatik hücre (su banyosu sonification aracılığıyla) kurtarma ve sonraki numaralandırma önerilen...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mueller-Hinton Orta	Oksoit	CM0405	Corning'in tavsiyelerine uyun
		17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 orta şelaj, Chelex 100 reçine ile 1 saat süreyle şelekslenmiş ve daha sonra %10 şelesiz RPMI-1640 ile takviye edilmiştir
Chelex 100 Reçine	Bio Rad	142-2822
MBEC plakaları	Innovotech	19111
Resazurin, Sodyum Tuzu	Sigma	R7017	800 &; mikro; DI suda g/ml        Filtre steril
mikro plaka sallama platformu	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plaka Okuyucu	Biotek
Gen5 yazılımı	Biotek		Resazorin dönüşümünün kaydedilmesi ve analizi
Neocuproine	Sigma	N1501	% 100 Etanol içinde 10 mM stok hazırlayın, -80 >m'de saklayın; C
Bakır sülfat	Acros Organics	7758-99-8	suda 100 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın, 4 &m'de saklayın; C
Cu-Neocuproine	Self-Made		Neocuproine ve bakır sülfatın eşit molaritelerinin karıştırılmasıyla üretilir. Karışım, CRPMI ortamında istenen konsantrasyona seyreltildi.
Gentamisin	Sigma	G3632-1G

Üretici RPMI-medium ; : ; : ,, ,