Yöntem makalesi

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

DOI:

10.3791/53933

⸱

8 Mayıs 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modelinin indüksiyon ve skorlama yöntemlerini, çeşitli hastalık evrelerinde sırasıyla akış sitometrisi ve kantitatif PCR kullanılarak lenf düğümleri, dalak, kan ve omurilikteki immün hücre dağılımı ve mRNA sitokin seviyelerinin değerlendirilmesi ile birlikte

açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipl skleroz, bilişsel, motor bozukluğu ile sonuçlanan santral sinir sistemi (CNS) lezyon formasyonu ile karakterize bir enflamatuar otoimmün hastalık, olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca, CNS'de lezyon oluşması, motor hasar ile karakterizedir ve otoimmün ve enflamatuar reaksiyonların etkili olduğu için, deneysel otoimmün ensafalomiyelitis (EAE), MS için yararlı bir hayvan modelidir. EAE modelleri bir miyelin oligodendrosit proteini farede (MOG) 35-55 türetilmiş bir peptit ile indüklenir. EAE fareler ilerleyici bir hastalık seyrini gelişir. Bu ders, üç aşamaya ayrılır: preklinik faz (gün 0-9), hastalık başlangıcı (gün 10 - 11) ve akut faz (gün 12 - 14). MS ve 'EAE CNS infiltre otoreaktif T-hücreleri tarafından indüklenir. Bu T hücreleri, daha bağışıklık hücrelerinin işe neden kemokinler ve sitokinler salgılarlar. Omurilik d nedenle, immün hücre dağılımıÜç hastalık evrelerini uring araştırılmıştır. T hücreleri, B hücreleri ve monositler aktivasyonu / çoğalması / toplama başladığı hastalığın zaman noktası vurgulamak için, lenf düğümleri, dalak ve kan immün hücre dağılımı da değerlendirildi. Ayrıca, üç hastalık aşamalarında çeşitli sitokinlerin (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) seviyeleri, hastalığın enflamatuar süreçleri hakkında bilgi edinmek için, tespit edilmiştir. Sonuç olarak, veri EAE patoloji sırasında bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel profilinin bir bakış sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipl skleroz (MS) ve karşılık gelen bir hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), merkezi sinir sisteminde (CNS) otoimmün nöroenflamasyon değişiklikleri göstermektedir. Erken aktif MS ve 'EAE lezyonlar infiltre bağışıklık hücrelerinin varlığı ile karakterize edilir. Etiolojisi bilinmemektedir, ancak yaygın reaktif T hücrelerinin aracılık ettiği miyelin yıkımına dahil kabul edilir. Bu oto-reaktif T-hücreleri, dolaşım B hücreleri, monositler ve nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücreleri çekmek pro-enflamatuar sitokinler ve kemokinleri salgılar. Monositler makrofajlar içine ayırt. reaktif T hücresi tarafından salgılanan interferon gamma (IFNy) pro-enflamatuar makrofajlar içine makrofajları polarizes. oligodendrositlere apoptozu teşvik pro-inflamatuar makrofajlar bırakma sitokinler ve reaktif oksijen türleri. oligodendrosit ölüm demiyelinizasyon yol açar. Bundan başka, B hücreleri, p ayırtsonuçta miyelin bozulması ile sonuçlanan lasma hücreleri ve miyelin kılıf karşı bırakma otoantikorlar. Miyelin kaybı akson ve nöronların bozulması ve böylece MS 1 temel özelliklerini temsil CNS'de lezyon sitelerinin oluşumuna yol açar. Çevresinde, T hücreleri ve B hücreleri, lenf nodüllerinde aktive edilir, bu dalakta çoğalır ve merkezi sinir sistemi içine dolaşım içinden yer değiştirmektedir. Monosit ve nötrofillerin kemik iliğinde çoğalır ve merkezi sinir sistemi içine dolaşımla göç de.

kana veya MSS içine kan kemik iliği, dalak ve lenf düğümleri lökosit ekstravazasyon kemokin ve kemokin reseptörlerinin aracılık ettiği lökositler ve endotel arasındaki moleküler etkileşimler de dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır çok aşamalı bir süreçtir. çeşitli hücre tipleri tarafından kemokinlerin üretimini bağışıklık reaksiyonunun ne indüklenebilirDaha sonra enflamasyon 2,3 siteye bağışıklık hücrelerini toplayan, tümör nekroz faktörü-a (TNFa), IFNy ve interlökin-6 (IL-6) gibi sitokinlerle n. Bağışıklık hücreleri enflamatuar sitesine hücre tipine ve taşıma yolunun bağlı olarak, kendi yüzeyi üzerinde kemokin reseptörlerinin bir alt sunulmaktadır. Bu nedenle, CXCR2, CCR1 ve CXCR1, kemik iliği ve kanda 4 olgun nötrofiller üzerinde tanımlı ve onun ligandlan, CXCL2, CCL5 ya CXCL6 bağlanması sırasıyla, nötrofil aktive eder ve daha sonra hücre göçü endotele yapışıklıklarını teşvik eder ve dokulara 5-9 içine. CCL2 ve CCL20 sırasıyla CCR2 11 ve CCR6 12 ifade monositler ve Th1 / Th17 hücreleri 10, çekmek. T hücreleri, monositler ve makrofajlar dahil olmak üzere, 13 farklı hücre tipleri tarafından eksprese CCR1 ve CCR5, CCI3, CCL5 ve CCL7 bağlanan ve MS 14 sırasında yukarı düzenlenen edilir. CXCR3 T hücreleri üzerinde ifade edilir ve CCL9, CCL10 bağlanır veCCL11 15.

MS tedavisinde bir ana strateji bağışıklık hücrelerinin azalması veya merkezi sinir sistemi içine bağışıklık hücre infiltrasyonu önlenmesidir. Bu nedenle, belirli bir kemokin reseptörlerinin blokajı EAE de araştırılmıştır. Antagonizma veya CCR1 16, CCR2 17 genetik silme, CCR7 18 veya CXCR2 19 düşmanlık veya CCR1 20 genetik silinmesi ise, CCR5 20 veya CXCR3 21 patolojiye azaltmak vermedi, EAE patoloji azaltır. Bu nedenle, lökositler üzerinde belirli kemokin reseptörlerinin ifadesi MSS içine ikincisi infiltrasyonu için çok önemlidir ve EAE seyrini belirler.

Infiltre bağışıklık hücreleri, sırayla, enflamatuar süreç veya nöron 22 parçalanmasını teşvik, TNFa, IL-6 ve IL-1 gibi sitokinler, serbest, immün hücrelerin tüketiminin MS hastalar için etkili bir tedavi stratejisidir. Ayrıca, otomatikReaktif Th1 hücreleri sırayla TNFa, IL-1 ve IL-23 serbest bırakmak için makrofajları uyarır IFNy, bırakın.

Bu yazıda EAE, immün hücre dağılımı ve EAE farelerde çeşitli dokularda sitokin seviyeleri (mRNA) belirlenmesi indüklenmesini tarif etmektedir. Hücreler son CNS'de lezyon oluşumuna yol enflamatuar süreçlerin bir zamana bağlı bir genel bakış sağlamak amacıyla, hastalığın seyri sırasında farklı zaman noktalarında izole edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ETİK TABLOSU: Bizim deneysel prosedürler Regierungspräsidium Darmstadt (Almanya) Etik Komitesi tarafından onaylanmış Ulusal ve Avrupa düzenlemelerine teyit edilmiştir. Tüm çabalar hayvan acı en aza indirmek ve kullanılan hayvanların sayısını azaltmak için yapılmıştır.

1. EAE Modeli

  1. EAE modeli indüksiyonu
    1. EAE uyarılması için 10 ila 13 haftalık dişi 129S4 / SvJae x C57BL / 6 fareleri kullanın.
    2. Üst içine farelere subkutan enjeksiyon verin ve ensefalitojenik MOG 35, bel - 400 ug Mycobacterium tuberculosis içeren 200 ul komple Freund`s adjuvan (CFA) emülsifiye 55 (miyelin oligodendrosit glikoprotein) peptid (200 ug).
      Not: negatif olmayan hastalık yapıcı sham kontrol olarak, aynı hacimde, aynı yoldan, Mycobacterium tuberculosis ihtiva eden tam olmayan Freund katkı maddesi kullanılabilir.
    3. Thereafter ve tekrar 24 saat sonra, fareler (200 ul fosfat tamponlu tuzlu su, PBS içinde seyreltilmiş, toplam 0.2 ug), boğmaca toksininin intraperitoneal verir. sağlıklı hayvanlar ile hastalıklı karşılaştırma yapabilmek için, kontrol grubu olarak tedavi görmeyen farelere kullanın.
      Not: 200 EAE uyarılması da mümkündür - 300 ug MOG 35-55 peptidi, 300 - CFA içinde Mycobacterium tuberculosis, 500 ug ve 0.2 - enjeksiyon başına 0.2 ml - 0.3 ug pertussis toksin 0.1 hacminde.
    4. fareler klinik semptomlar günlük, enjeksiyondan sonra bir hafta Schulabschluss başlayarak (adım 1.2.1 bakınız)
      Not: Hastalık başlama gün farklı deneylerde değişir, ancak laboratuarımızda koşullar altında, bu gün 11 civarındadır ve bu nedenle, burada gün 14 3 gün hastalığın başlangıcından sonra, olarak tanımlanır. Mevcut çalışmadaki tüm fareler, klinik semptomlar geliştirmiştir.
  2. Farelerin Puanlama
    1. aşağıdaki gibi klinik skorlar tarafından klinik belirtiler sınıflandırır:0) hiçbir işaret, kuyruk 0.5) distal felci, 1) kuyruk tam felç, 1.5) gevşek kuyruk ve arka bacaklarda hafif güçsüzlük, 2) gevşek kuyruk ve arka bacaklarda şiddetli halsizlik, 2.5) gevşek kuyruk ve felç bir arka bacak, 3) gevşek kuyruk ve her iki arka ayakları felç, arka bacaklarda ve bir ön bacak zayıflığı hem 3.5) paralizi (bu puanı elde fareler) yerel etik kurallara uygun olarak, ötenazi uygulandı.

Sitometrisi Analizi Tek Hücre 2. Hazırlık

Not: Antikor karışımı 1 ul CD45-Vioblue, 2 ul CD8-eFluor650, 0.5 ul CD11b-eFluor605, 0.5 ul F4 / 80-PE-Cy7, 1 ul CD3 PE-CF594, CD4 V500, 0.5 ul CD11c oluşmaktadır -AlexaFluor700, 1 ul CD19-APC-H7 ve 1 ul Ly6G-APC-Cy7.

Not: Eğer kan, lenf düğümü, dalak ve omuriliği alırsak aşağıdaki şekilde prosedür: Fareler derinden isofl bir kombinasyonu ile anestezi edilirURANE ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) (dakika başına karbojen içinde% 2). Sonraki, Toraks açmak bir Intracardial sopayla kan kaldırmak ve soğuk PBS ile intrakardiyak fareler serpmek. Sonra dalak tarafından takip lenf düğümleri ve nihayet omuriliği çıkarın. Eğer intrakardiyak fareler serpmek gerek yoksa o zaman boyun çıkık ile derin anestezi altında fareler euthanize.

  1. splenositlerin izole edilmesi
    1. izofluran (dakika başına karbojen içinde% 2) ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) bir kombinasyonu ile fareler anestezi uygulayın.
    2. % 80 izopropanol ile ıslak kesi alanı makas kullanarak, kıllar ile herhangi bir kirlenmeyi önlemek ve daha derin dokulara delmeden, uzunlamasına toraks açın.
    3. Soğuk PBS pH 7.0 23 intrakardiyak fareler serpmek.
      Not: dalak göğüs kafesine altında sol superior kadranda yer almaktadır. Dalak incelenmesi gereken yalnızca, bu organın retai için perfüzyon önce kaldırılmış olabilirilgi N, tüm hücre tipleri.
    4. dalak çıkarın ve yaklaşık 1/8 kesti ve tartın. Buz üzerinde PBS içerisinde örnek saklayın.
    5. 2 ml şırınga pistonu kullanarak, (50 ml'lik bir tüp üzerine yerleştirilen) 70 mikron elekten dalak doku sıkın.
    6. 5 ml PBS ile örgü yıkayın. 3 dakika boyunca 1.800 xg'de santrifüj. çözüm yokedici 500 ul pelletini.
      Not: Bu aşamada, daha sonra, alternatif bir FACS analizi yöntemi boncuk (bölüm 3) kullanmaz kullanılırsa, eğer farklı hücre sayısı için gerekli olabilir.
    7. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inkübe ve 500 ul PBS ilave edin. Oda sıcaklığında 650 xg (RT) 6 dakika santrifüjlenir.
    8. 500 ul PBS ile yıkama adımı yineleyin. 100 ul% 0.2 sığır serum albümini (BSA) hücre pelletini, Süpernatant atılır / PBS, 2 ul Fc reseptörü-1 (FcRI) bloke tampon eklemek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
    9. 13 ul bir eklemetibody Karışım karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe oda sıcaklığında 650 x g'de 6 dakika boyunca 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin. süpernatant atın.
      Not: Üreticinin boyama işlemi, tek bir yıkama önerir, ancak arka plan boyaması ek bir azalma, isteğe bağlı olarak yıkama aşamasından, bir ya da iki kez daha tekrarlanarak elde edilebilir.
    10. (Potansiyel hücre topaklanma azaltmak için protein ayırma veya muhtemelen çalışan tampon) ve tüp flow sitometri transfer hücre 500 ul PBS içinde pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun.
  2. Lenf nod hücrelerinin izolasyonu
    1. izofluran (dakika başına karbojen içinde% 2) ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) bir kombinasyonu ile fareler anestezi uygulayın.
    2. % 80 izopropanol ile ıslak kesi alanı ve makas kullanılarak boyuna toraks açın. Soğuk PBS pH 7.0 23 intrakardiyak fareler serpmek.
    3. kasık lenf nodu izole etmek, dikkatli hi bölgesinde cilt kaldırmakp ve forseps ile yağ dokusunun dikkatlice lenf düğümü seçin. kasık lenf düğümü tartılır ve buz üzerinde PBS içerisinde örnek saklayın.
      Not: Biz çalışmaları nedeniyle O`Connor ark kasık lenf nodları kullanılır. aktive edilmiş monositler, makrofajlar, nötrofiller ve T-hücrelerinin yüksek değerleri, tüm EAE indüksiyon 24 sonra, kasık lenf düğümleri içinde mevcut olduğu görülmüştür.
    4. 2 ml şırınga pistonu kullanarak (50 ml'lik bir tüp üzerine yerleştirilen) 70 mikron elekten lenf nodu sıkın.
    5. 5 ml PBS ile örgü yıkayın. 8 dakika boyunca 2.400 xg'de santrifüj. 100 ul% 0.2 BSA / PBS içinde hücre pelletini, 2 ul FcRI bloke tampon eklemek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
    6. 13 mcL antikor karışımı ilave karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe oda sıcaklığında 650 x g'de 6 dakika boyunca 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin.
    7. Süpernatantı atın 300 ul PBS içinde hücre pelletini (ya da, uygun bir çalışma tamponu) tekrar süspansiyon ve transferbir akış sitometrisi tüpüne.
  3. kan hücrelerinin izolasyonu
    1. (EDTA ile stabilize edilmiş) 50 ul kan 50 ul 20 mM HEPES ilave edin ve solüsyonu yokedici 500 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe ve 500 ul PBS ilave edin. Oda sıcaklığında 650 x g'de 6 dakika santrifüjlenir. Süpernatantı atın ve yıkama adımı tekrarlayın.
    2. 100 ul% 0.2 BSA / PBS içinde hücre pelletini, 2 ul FcRI bloke tampon eklemek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
    3. 13 mcL antikor karışımı ilave karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe oda sıcaklığında 650 x g'de 6 dakika boyunca 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin. Süpernatantı atın 300 ul PBS içinde hücre pelletini ve tüp flow sitometri aktarın.
  4. spinal kord hücrelerinin izolasyonu
    1. izofluran (dakika başına karbojen içinde% 2) ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) bir kombinasyonu ile fareler anestezi uygulayın.
    2. Islak kesi% 80 izopropanol ile alan ve uzunlamasına toraks açınmakas kullanılarak. Soğuk PBS pH 7.0 23 intrakardiyak fareler serpmek.
    3. arkasındaki kesi alanı ıslatın ve tekrar bir neşter ile uzunlamasına kesim yapmak ve cilt kaldırmak.
    4. (Arka bacaklarda innerve) omurganın bel kısmını kesip omuriliği ayıklamak için PBS dolu şırınga ile yıkayın. Lomber kablosunun yaklaşık 1/3 kesip bu tartmak ve buz üzerinde PBS örnek saklayın.
    5. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın 500 ul hücre dekolmanı çözümü ve HBSS ekleyin (1: 1). , 3 mg / ml kolajenaz A ve 1 birim / mL DNase I ekleme kadar tekrar aşağı pipetleme hücreleri decollate 400 rpm'de 37 ° C'de çalkalama ile 30 dakika boyunca inkübe edin.
      Not: Eğer tercih edilirse, hücre süspansiyonu arka otofloresan An azaltır ve böylece, ölçüm akış sitometrisi duyarlılığını artırmak olabilir yoğunluk gradyan santrifüjü ile miyelin ve hücre artıklarının kontamine silinebilirkazanılmış gereken olayların sayısını d (bakınız bölüm 3.5).
    6. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın 1 mi,% 10 fetal dana serumu (FCS), pelet tekrar süspansiyon / Dulbecco Minimum Essential Medium (DMEM) ve tekrarlanabilir aşağı pipetleme yeniden hücreleri decollate.
    7. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin. Yıkama adımı yineleyin.
    8. 1 ml PBS içinde hücre pelletini ve 2 ml şırınga pistonu kullanarak (50 ml'lik bir tüp üzerine yerleştirilir), 70 mikron gözenekli bir elekten omurilik sıkın.
    9. 4 mL PBS ile örgü yıkayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1,800 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın 100 ul% 0.2 BSA içinde, hücre pelletini / PBS, 2 ul FcRI bloke reaktif ekleme ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
    10. 13 mcL antikor karışımı ilave karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe oda sıcaklığında 650 x g'de 6 dakika boyunca 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin.
    11. Süpernatantı atın hücre Pelle tekrar süspansiyon500 ul PBS içinde T (ya da, uygun bir çalışma tamponu) ve borunun akış sitometrisi aktarın.

3. Akım Sitometrisi Analizi

  1. Olesch ve ark., 25 tarif edildiği gibi uygun konsantrasyonlarını belirlemek için önceden tüm antikorlar titre edilir.
  2. üreticinin talimatlarına göre çok renkli tazminat matrisleri oluşturmak için tek renkli tazminat antikor yakalama tazminat boncuk kullanın.
  3. Günlük üreticinin talimatlarına göre belirli boncuklar kullanılarak alet kalibrasyonu kontrol edin.
  4. Doğrudan ölçüm flow sitometri önce hücrelere 30 ul akım sitometri mutlak sayım standardını eklemek mutlak hücre sayılarını belirlemek için (izolasyon için bölüm 2.1, 2.2, 2.3, 2.4). Bunun yerine sayma boncuklar kullanarak hücreleri sayılabilir.
  5. Bir sitometresi bir akış içine örnekleri (500.000 olayları: 100.000 olaylar, omurilik, dalak, lenf bezi ve kan hücreleri) toplayınnd belirli akış sitometri yazılımını kullanarak analiz eder.
    1. Akış sitometri yazılımını açın ve düğme "örnekleri eklemek" tuşuna basarak FC'ler 3,0 dosyaları ekleyin.
    2. çift ​​tıklayarak eklenen dosyayı açın. x ve y ekseni için kanallar ayarlayın. Ilgi hücre popülasyonlarının bir kapı oluşturmak seçmek için (Şekil 4).

4. Kantitatif PCR Analizi

  1. cDNA içine mRNA izolasyonu ve transkripsiyonu
    1. Fenol-kloroform ile lomber spinal kord (1/3), dalak (1/8) ve inguinal lenf düğümleri mRNA Özü ve etanol 26 ile hızlandırabilir.
      1. Bunun için, 10 dakika süre ile inkübe 1 mi guanidinyum tiosianat-fenol karışımı içinde dokuyu homojenleştirin. 200 ul kloroform eklenir ve 10 dakika boyunca tekrar inkübe edin.
      2. Santrifüj adımının (4 ° C'de 15 dakika boyunca 18,000 x g), üst akıcı faz yıkama 500 ul izopropanol ve santrifüj (4 ° C'de 8 dakika boyunca 18,000 x g ile° C).
      3. 500 ul etanol ile bir santrifüjleme aşama (4 ° C'de 5 dakika boyunca 18,000 x g) işleminden sonra, pelet yıkanır, vakum konsantratör pelet (30 ° C'de 5 dakika) kurutun. Daha sonra, 30 ul su içinde pelletini.
    2. Kan mRNA çıkarmak için santrifüj 500 ul EDTA stabilize kan (300 xg 10 dakika, 4 ° C).
      1. , Ince beyaz tabaka al beyaz kan hücreleri içeren ve çözelti (150 mM NH4CI, 100 mM NaHCO 3, 0.1 mM Na-EDTA, pH 7.4) lize 1 ml seyreltin.
      2. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyondan sonra, 6 dakika boyunca 650 xg'de hücreleri santrifüj ve daha sonra PBS ile iki kez yıkanır.
      3. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, RNA ekstraksiyonu için bir kit kullanılarak, beyaz kan hücreleri (lökosit) mRNA ekstrakte edin.
    3. üreticinin talimatlarına göre rasgele heksamerler içeren cDNA sentezi için bir kit kullanılarak cDNA sentez gerçekleştirir. CDN 200 ng mRNA kullanınBir sentez.
  2. nicel PCR
    1. Belirli bir mRNA'nın miktarının nicelleştirilmesi için, 1 ul cDNA, 1 uM ileri / geri primeri ve üretici talimatlarına 27 göre olan boya bağlayıcı bir fluoresan DNA kullanımı. Primer setleri için diziler için Tablo 1'e bakınız. IL-1 p, CT-değerleri ölçün, IL-6, IL-23, kantitatif PCR sistemi kullanılarak IFNy, TNFa ve PPIA (peptidil prolil izomeraz).
    2. Göreceli mRNA ifadesi karşılaştırmalı BT (çevrim eşik) yöntemini 27 kullanmak belirlemek.
      1. (Önceki çalışmalarda Barthelmes ve ark., 28, Schiffmann ve ark., 29, Schiffmann tarif edildiği gibi, bu için, hedef genden PPIA ortalama CT-değeri çıkarılarak PPIA ekspresyon seviyeleri, hedef genlerin CT-değerlerini normalize ve ark., 30). Daha sonra, ACt-değerlerini normalize hangi kullanarak, sözde ΔΔCT-değerlerini hesaplamakmuamele edilmemiş farelerin hedef genlerin ekspresyonu seviyesine EAE farelerden hedef genlerin yeniden EAE farelerde ACt-değeri tedavi edilmeyen farelerdeki ortalama ACt değer çıkarılarak.
      2. Hedef genin göreceli mRNA ifadesini elde etmek için, aşağıdaki formülü kullanarak oranını hesaplamak: 2 - ΔΔct.
  3. Her astar özgünlüğünü test edin. % 2 agaroz jeli 31 kullanarak amplifiye fragman boyutunu belirler. Parçası boyutu Tablo 1 'de gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, bu makalede açıklanan farklı yöntemler şematik bir bakış verir. 1) Fare MOG 35-55 antijen enjeksiyonu almak ve 10.7 ± 0.3 gün 28 sonra ilk klinik belirtiler gelişir. EAE farelerin bir temsilci hastalık kursu. Şekil 1'de 2) Çeşitli dokular (dalak, lenf düğümleri, bel omurilik) gösterilir ve kan preklinik faz (Günlük 2 gün 4 sırasında farklı zaman noktalarında kontrolü ve EAE fareler elde edi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anlatılan EAE modeli MS bir model olarak çok dikkat çeken ve rutin MS 32 için terapötik stratejilerin test kullanılır. Fare hastalık MS'in birçok klinik ve histolojik özellikleri sergiler ve nöronal antijenlere otoimmünite indüksiyon kaynaklanır. miyelin antijenlerine sensitizasyon CNS, kan-beyin bariyeri bozukluğu ve böylece, bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile ilişkilidir. Bulgularımız, bağışıklık hücreleri, akut fazda lenf nodlarında geçici artış olduğunu göstermektedir. Dalak T hücreleri ve B ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MJP, Xellia ve Leo Pharmaceuticals'ın danışmanıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Else Kröner-Fresenius Vakfı (EKFS) Araştırma Eğitim Grubu Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) ve Hessen Eyaleti'nin "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ABI Prism 7500 Dizi Tespit Sistemi Applied Biosystems, Austin, ABDkantitatif PCR sistemi
AccutaseSigma Aldrich Münih, AlmanyaA6964hücre ayırma çözeltisi
CD3-PE-CF594BD, Heidelberg, Almanya562286
CD4-V500BD, Heidelberg, Almanya560782
CD8-eFluor650eBioscience, Frankfurt, Almanya95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Almanya93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700BD, Heidelberg, Almanya560583
CD19-APC-H7 BD, Heidelberg, Almanya560143
CD45-Vioblue Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya130-092-910
CompBeadsBD, Heidelberg, Almanya552843kompanzasyon boncukları
Kollajenaz ASigma Aldrich Münih, AlmanyaC0130
Sitometrik mutlak sayım standardı Polyscience, Eppelheim, AlmanyaBLI-580-10
Sitometre Kurulumu ve İzleme boncukları BD, Heidelberg, Almanya642412
DNase ISigma Aldrich Münih, AlmanyaD5025
EAE KitiHooke Laboratuvarları, Lawrence, ABDEK2110
F4/80-PE-CY7 BioLegend, Fell, Almanya123114
İlk İplikçik cDNA Sentez kiti Thermo Scientific, Schwerte, AlmanyaK1612
Fc reseptörü-1 bloke edici tampon Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya130-092-575
Akış sitometrik mutlak sayım standardıPolyscience, Eppelheim, Almanya580
FlowJo yazılımı v10 Treestar, Ashland, ABDakış sitometri yazılımı
LSRII/Fortessa BD, Heidelberg, Almanyaakış sitometresi
Ly6G-APC-Cy7 BD, Heidelberg, Almanya560600
Lysing solüsyonu BD, Heidelberg, Almanya349202
Maxima SYBR Green Thermo Scientific, Schwerte, AlmanyaK0221floresan DNA bağlayıcı boya 
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Almanya74104RNA ekstraksiyon kiti

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409(2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187(2014).
  13. Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136(2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Experimental Autoimmune EncephalomyelitisMultiple Sclerosis ModelMyelin Oligodendrocyte GlycoproteinComplete Freunds AdjuvantPertussis Toxin InjectionLymph Node IsolationSpinal Cord DissectionSpleen Immune CellsFlow Cytometry AnalysisCytokine Expression Analysis

İlgili makaleler