Yöntem makalesi

Prosedür bitki özleri gelen Dağınık Parçacıkların çıkarması için Flokülantlar Verimliliği değerlendirin

8.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53940

⸱

9 Nisan 2016

1Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University

Bu makalede

Özet

Burada sunulan deney tasarımı prosedürü, farklı topaklaştırıcıların bitki özlerindeki dağılmış parçacıkları toplama yetenekleri açısından değerlendirilmesine olanak tanır, böylece bulanıklığı ve sonraki işleme maliyetlerini azaltır.

Özet

Bitkiler insanlar için sadece gıda, yem ve hammadde gibi emtialar sağladıkları için değil, aynı zamanda biyofarmasötikler gibi katma değerli ürünler için üretim platformları olarak kullanılabildikleri için de giderek daha fazla önemlidir. Her iki durumda da, partikülleri uzaklaştırmak için sıvı bitki özlerinin arıtılması gerekebilir. Optimum arıtma, kapasiteyi ve uzun ömürlülüğü artırarak filtrasyon ve santrifüjleme maliyetlerini azaltır. Bu, katı-sıvı ayrımını kolaylaştırmak için dağılmış parçacıkları çapraz bağlayan topaklaştırıcılar olarak bilinen yüklü polimerlerin eklenmesiyle elde edilebilir. Bitki özleri gibi karmaşık karışımlar için mekanik flokülasyon modelleri yoktur, bu nedenle bunun yerine ampirik modeller kullanılır. Burada, farklı topaklaştırıcıların hızlı bir şekilde taranmasına izin veren, bitki özlerinin arıtılmasını optimize eden ve bulanıklığı önemli ölçüde azaltan bir deney tasarımı prosedürü açıklanmaktadır. Elde edilen tahmine dayalı modeller, sağlam proses koşullarının ve tamamlayıcı özelliklere sahip polimer setlerinin, örneğin belirli iletkenliklere sahip ekstraktlarda etkili flokülasyonun tanımlanmasına olanak tanır. Tütün yaprağı ekstraktları için sunulan sonuçlar, diğer bitki türlerine veya dokularına kolayca uyarlanabilir ve böylece emtialar ve bitki türevli farmasötikler için daha uygun maliyetli alt süreçlerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.

Giriş

Bitkiler yaygın olarak meyve suları gibi gıda malları üretmek için kullanılır, ancak aynı zamanda daha yüksek değer biyofarmasötik ürünlerin 1-3 imalatı için platformlar olarak geliştirilebilir. Her iki durumda da, ayırma işlemleri (DSP) çoğu zaman partikül yüklü özler 4,5 açıklama takip yaprak ve meyveler gibi dokulardan sıvı ekstraksiyonu ile başlar. Biyofarmasötiklerle üretimi için, DSP maliyetleri toplam üretim maliyetlerinin 6,7 varan% 80'ini ve kısmen bu tür bıçak tabanlı homojenizasyon 8,9 olarak yıkıcı yöntemlerle hazırlanan özleri yüksek parçacık yükü hediye yansıtır . Filtre tabakalarının rasyonel seçim filtre kapasitesini artırmak ve maliyetlerinden 10,11 azaltabilir özü partikül büyüklüğü dağılımını maç olmasına rağmen, iyileşme başına saklanmalıdır parçacıkların sayısına göre belirlenen mutlak kapasite tavanı aşan aslaFiltre alanının birim açıklama elde etmek.

Daha az partiküller, filtrasyon tren, en iyi filtre yüzeyine ulaşması halinde tavan kaldırılabilir ve dağılmış parçacıklar geniş yumakları 12 oluşturmak üzere toplanmasını teşvik pıhtılaştırıcı maddeler olarak bilinen polimerler ile karıştırılır, bu elde edilebilir. Böyle yumaklar daha ince ve daha pahalı derinlik filtreleri ulaşan partikül yükünü azaltmak, kaba ve daha az pahalı torba filtreler daha da yukarı muhafaza edilebilir. Polimerler onlar iyi imalat uygulamaları (GMP) ile uyumlu olmalıdır biyoilaçlar için örneğin kendi uygulamaları için uygun güvenlik profiline sahip olmalı ve tipik olarak bir molar kütle> 100 kDa olmalı ve nötr ya da 13 ücret ya. Nötr pıhtılaştırma genellikle agregasyonu ve çaplarda yumakların oluşumuna neden dağılmış parçacıklar çapraz bağlama ile hareket ise 1 mm 11 yüklü polimerler, d yükünü nötralize>ispersed parçacıklar, bunların çözünürlüğünü azaltır ve dolayısıyla çökelmesine 14 neden olur.

Flokülasyon ekstresi 15,16 özelliklerini eşleştirmek için, bir tampon, pH ve iletkenlik, ve polimer türü ya da konsantrasyon olarak parametrelerini ayarlayarak geliştirilebilir. Tütün 0.5-5.0 g L-1 polietilenimin (PEI) ile ön işleme tabi özler, derin filtre kapasitesinde daha fazla 2 misli artış için 100 L'lik bir pilot ölçekli işlemde bildirilmiştir. Bu polimerin maliyeti daha az € 10 kg'lık böylece sürecin içine giriş toplu 16 başına filtreleri ve sarf malzemeleri hakkında 6.000 € maliyet tasarrufu sonuçlandı hatta daha fazla zaman selüloz bazlı filtre yardımcıları 17 ile kombine -1 olduğunu. Öyle olsa bile, öngörü modellerinin içerme 15-30 dakika 16,18 arasında tutun adımlar gerektirir çünkü depolama için daha fazla yatırım maliyetlerine yol açan, flokülant a priori ekonomik yararlarını değerlendirmek için gerekli olantanklar. Ancak, flokülasyon karmaşık doğası bu tür deneylerin sonucunu tahmin edebilirsiniz hiçbir mekanik modeller şu anda vardır. Bu makalede açıklanan nedenle, daha uygun bir tasarım-of-deneyler (DoE) yaklaşımı 19 geliştirilmiştir. Genel DoE işlemi için bir protokol en son 20 yayınlanmıştır.

Küçük ölçekli cihazları şimdi çökeltme şartları 21 yüksek verimli tarama için kullanılabilir. Reaksiyon kabı (~ 96 çukurlu bir levha üzerindeki kuyu 7 mm) ve parçacıklar veya yumakların boyutları birbirinden büyüklük sırasında daha az olabilir Ancak, bu cihazlar, gerçekçi bir bitkinin topaklaşma sırasında koşulların simüle edilmesi değil ayıklar. Bu nedenle desen ve model tahmin gücü karıştırma etkileyebilir. Ayrıca, bunun nedeni karıştırma davranışı ve çökelti sta doğrusal olmayan değişikliklere yağış içeren süreçleri küçültün zor olabilirbility 22. Bu nedenle, bu makale 100 L pilot ölçekli sürecine 16 ilk 20 ml'lik reaksiyon hacmi ölçeklenebilir sonuçlar veren, günde 50-75 numune hacmi ile tezgah üstü ölçekli tarama sistemi özetliyor. Bir DoE yaklaşımı ile kombine edildiğinde, bu öngörü modelleri kalite-by-tasarım kavramının bir parçası olarak proses optimizasyonu ve belgeler için kullanılmasına izin verir.

Aşağıda tarif edilen yöntem aynı zamanda pıhtılaştırma da maliyet tasarrufu aracı 23 olarak kabul edilmektedir hücre kültürü bazlı işlemler, üretilen biyofarmasötik adapte edilebilir. Kanola, mısır ve soya fasulyesi 24,25 üretilen β-glukuronidaz için gösterildiği gibi, aynı zamanda, bir saflaştırma stratejisinin bir parçası olarak, bir ham ekstreden hedef proteinlerin çökelmesini modellemek için de kullanılabilir. Flokülan özelliklerinin ayrıntılı bir açıklaması başka 16,26 bulunabilir ve sağlanması önemlidir polimer Concentrkus toksik olmayan ya da son ürün 11 zararlı seviyelerinin altında alınarak belirlenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Bir Yeterli Deneysel Strateji geliştirin

  1. Flokülasyon işlemi faktörleri flokülasyon üzerinde en güçlü etkiye sahip olan, yani kurulmuş veya optimize edilmesi için ilgili çevresel ve proses parametrelerini belirlemek. Tipik olarak, son zamanlarda 20 nedeniyle mekanik modellerin eksikliği için gerekli açıklandığı gibi bir DoE yaklaşımı yüzden birkaç tür parametre vardır.
    1. Literatür verilerine 12, sistem ile önceki bilgi ve deneyime dayalı Seç parametreler (faktörler). Tipik faktörler tamponu pH, tampon iletkenlik, inkübasyon süresi ve sıcaklık gibi, polimer tipi ve konsantrasyonu 15,16,27 bulunmaktadır.
    2. kategorik faktörler için anlamlı her sayısal faktör için aralıkları ve seviyeleri tanımlamak için aynı referansları (1.1 bakınız) kullanın.
    3. Deneysel sonuçlar (yanıt) izlenmeli ve flokülasyon etkinliğini değerlendirmek için kullanılacak tanımlar. Sisteme bağlı olarak, buSüzüntü veya süpernatant bulanıklık, çökelme hızı, toplam büyüklüğü ya da sonraki bir filtre 16,23,28-30 kapasitesi olabilir.
    4. Elde edilen yüksek kaliteli veri sonra ya da başka bir operatör tarafından gerçekleştirilen deneyler ile artar böylece tepkileri ölçmek için kullanılan deneyler tekrarlanabilir / kantitatif sağlam ve tekrarlanabilir olduğundan emin olun.
  2. faktörlerin sayısı araştırılacak ve bilginin derecesi zaten sistem hakkında birikmiş çalışmalardaki bir DoE türü seçin. Uygun bir DoE tipi 20 tanımlamak için kullanılabilir literatürü kullanın.
    1. Parametrelerin çok sayıda ekranlı olmalıdır ya da çok az parametreler için anlamlı aralıkları hakkında bilinen araştırılacak flokülasyon sistemi hakkında az bilgi varsa bir tarama tasarımı seçin. Tipik tarama tasarımları tam ve kısmi faktöryel tasarımları vardır. Parametreleri, örneğin, doğrusal olmayan bir etkisinin olması beklenmektedir eğer tasarım orta noktalarını dahil Belirli bir eşiğin 19 üzerinde doygunluk.
    2. Bir cevap yüzey yöntemi (RSM), örneğin merkezi kompozit dizayn (CCD) 31 veya optimum 32,33, tanınmış aralıklar ile sadece bir kaç faktör gerekirse tam karakterize edilebilir seçin.
  3. DoE tasarım alanı fraksiyonu 20 karşılandığı gibi önsel kalite kriterlerinin sağlanması, uygun yazılım ile ayarlayın.

2. Flokülasyon Deneyler hazırlayın

figure-protocol-1
Şekil 1: Bitki özü flokülasyon iş akışı: süreç ölçeği (solda) ve tezgah üstü ölçeği (sağda). Sulu tamponlar ile protein çekimini takiben, hücre enkaz dağılmış parçacıkları flokülant eklenerek toplanır. agregalar daha sonra çanta ve derinlikli filtreleme bir kademeli ve bunların kapasitesi ile çıkarılırSüzüntü türbiditelerin birlikte filtreler flokülasyon etkinliğini ölçmek için doğrudan kullanılabilir.

  1. Genel Deneysel İş Akışı (Şekil 1) geliştirin.
    1. Örneğin özel bir homojenleştirici son uygulama ölçeğinde beklenen aynı parçacık büyüklüğü dağılımı ile sonuçlanır (ya da daha önce gözlenen) bir ekstraksiyon cihazı kullanın. Mümkünse tütün homojenizasyon 10 yaprak için tarif edildiği gibi, aspiratör bir ölçek aşağı modeli tasarımı.
    2. flokülasyon deneyleri (burada 20 ml) sırasında kullanılan özü hacimleri tanımlayın. Parçacıkların belirli bir sayısı, reaksiyon kabı içinde mevcut olması için izin veren bir ses seçin 20 mi alikotlar içinde, örneğin çökeltme deneyleri katı 34 ve parçacık boyutu ~ 0.5 [ağırlık / hacim] ~% 7 ihtiva eden tütün ekstreleri için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir sonuçlar vermiştir um ~ 3 ila 16 mm.
    3. tüm izleme ve post-flokülasyon işlemleri Tasarım o inci böyleceey son başvuru ölçek temsilcisi, üretim ölçeğinde kullanılanlarla aynı partikül tutma davranışı ile örnek seçme filtreler.
  2. Özler Türetilmiş olacak hangi gelen Tesisleri geliştirin.
    1. Aynı bitki hattını, burada Nicotiana tabacum cv kullanın. Petit Havana SR1 ve üretim sırasında kullanılacak yetiştirme koşulları önceden 33 nitelendirdi.
    2. Diğer yem stokları işlenecek, bunlar örneğin, nihai uygulama ölçeği temsil eden özgün tamponlar kullanın, böylece bu yem stokları hazırlamak dikkate almak herhangi bir seyreltme adımlarını sürecinde ve burada, beklenen pH ve iletkenlik, pH 7.5 sopa ve iletkenlik 30 mS cm -1.
  3. Filtrasyon Utilities, Bulanıklık-İzleme Cihazları ve Örnekleme gemiler hazırlayın.
    1. Onlar değilse, burada gerekli boyutları, 15 x 15 cm 2 filtre malzemeleri kesmek hazır bizee modülleri. Tüm izleme ve analiz cihazları işlevsel olduğundan emin olun ve tüm örnek tüplerini etiketleyin.
    2. Bu basit görevleri olmasına rağmen, onlar gerçek flokülasyon deneyleri sürekli aksamasına neden olmayacak emin olmak için zaman içinde bu öğeleri hazırlamak. o flokülasyon verilen sonuçlar etkilediği için bu gecikmeleri önlemek zamana bağlı bir işlemdir.
  4. Topaklayıcı stok çözelti hazırlayın. DİKKAT: örneğin eldiven pıhtılaşmış işlerken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. malzemeler tehlikeli olabilir (Avrupa UE 67/548 / CEE göre tehlike etiketleri, 1999/45 / CE N, Xi veya Xn dahil). tozdan kaçının ve malzeme güvenlik veri sayfalarına bakın. Davlumbaz altında çalışmak.
    1. Burada her çökeltme için bir stok konsantrasyonu, 80.0 g L -1 kullanılan iki PEI flokkulantlarla için seçin. parçacık konsantrasyonunun azaltacak topaklaştırıcı eklerken örnek seyreltme önlemek için mümkün olduğunca yüksek Seç konsantrasyonları,yon ve böylece flokülasyon verimliliği etkiler.
    2. Polimer daha önce sulu% 50 [ağırlık / hacim] çözelti olarak tedarik edilir ise, örneğin, polimerin üreticinin formülasyon yansıtan herhangi bir ön-seyreltme için hesap. % 4-8 arasında flokülan stok çözeltileri [ağırlık / hacim] Şimdiye kadar en uygun olduğu bulunmuştur.
    3. akılda yukarıda tartışılan noktaları Rulman, flokülant konsantrasyonu nihai çöktürücüdür konsantrasyon doğru ayarlanmış olmadığından potansiyel hatalara neden pipetleme inhibe eden oldukça viskoz çözüm üretmek değil emin olun.
    4. Bu nedenle hata olasılığını azaltan bir pipetleme şeması (2.5) kurulumunu kolaylaştıracak çünkü eğer mümkünse tüm flokkulantlarla için aynı stok konsantrasyonu kullanın.
    5. Özler, burada pH 4-10 ve iletkenlik 15-55 mS cm -1 koşullara uyan her çöktürücüdür stok çözeltinin pH ve iletkenlik ayarlayın. m ise tek bir çökeltme için bireysel stokları hazırlayınpH ve / veya iletkenlik koşullarında bir dizi daha cevheri bu polimer için test edilir.
    6. Kullanmadan önce 48 saat daha uzun, taze flokülant stok çözümleri hazırlayın. Flokülasyon fazla 4 hafta boyunca, polimer stokları ile indüklenebilir olsa da, verim, yüksek ya da düşük pH değerleri ile, polimer hidrolizine bağlıdır düşebilir. Daha fazla bilgi için üreticinin belgelerine bakın.
    7. Burada, 4 ° C, 20 ° C ve 37 ° C inkübasyon sıcaklıkları ayarlamak için kullanılabilir ısıtma / soğutma banyoları sağlamak ör Doe için seçilen parametreler deney sırasında her bir örnek için tam olarak ayarlanabilir olduğundan emin olun. flokülasyon sırasında karıştırma deneyin bir parçası ise, karıştırma cihazı gibi güç girişi gibi kritik parametreler açısından son başvuru ölçek temsilcisi olduğundan emin olun.
  5. Bir Pipetleme Programı içine DoE Programı dönüştürün.
    1. tes olmak farklı Topaklayıcı konsantrasyonlarını dönüştürmeközü numuneleri eklenecektir stok solüsyonu hacimleri içine ted: stok konsantrasyonu son flocculant konsantrasyonları bölmek ve flokülasyon deneylerinde kullanılan örnek hacmi ile çarpın. Örnek 20 mi, bu 22 mi olacak 2 mi flokülan stok çözeltisi en fazla karıştırılır, eğer, örneğin büyük Nihai son hacim tanımlar.
    2. Flokülan stokunun 0.75 mi, daha sonra tampon 1.25 mi korumak için gerekli olan bir örneğe ilave edilmesi gerekiyorsa, flokülan stokunun büyük hacmine bağlı olarak, tüm çökeltme alikotları, aynı nihai hacmi muhafaza etmek için gerekli olan hacim tampon eklenmesi, örneğin, hesaplama 22 ml'lik nihai numune hacmi (2.5.1).
    3. DOE için gerekli olan stok solüsyonu mutlak hacimlerini hesaplamak için her polimer ve flokülasyon durum için çöktürücüdür stok solüsyonu hacimleri Özetle.
  6. Hasat Tütün Yaprakları ve Extract hazırlayın.
    1. ilk altı lea kaldırBu ya bir homojenizer olarak ves (veya işlem talimatlarında belirtildiği gibi pek çok), uygun bir ekstraksiyon cihazı için uygun bir yaş, 6 haftalık ör ve transfer tütün bitkilerinden basın vidalayın.
    2. 100 g örneğin gram biyokütle başına 300 ml ekstraksiyon tamponu üç cilt ekleyin ve 8 dakika boyunca karıştırın.
    3. Farklı pH ve / veya iletkenlik test edilmektedir, uygun tamponlar ile tek tek ekstrelerini hazırlamak. İşte, bu bir blender 3 x 30 sn veya bir meyve sıkacağı 34 bitki materyali homojenize içerir.
    4. Seçenek olarak ise, araştırma altındaki işlem için temsili bir şekilde özü hazırlamak.
  7. Özü alikotu ve Tamponu ekleyin.
    1. El ve iyice örnekler parçacıkların bir dağılımını homojen olmasını sağlamak için tüm işlem boyunca özü karıştırın.
    2. Tam olarak boşaltılarak önceden etiketlenmiş reaksiyon tüpleri arasında özü dağıtmak,Her bir kap içinde buradan 20 mi. Kendi başına ayakta durabilen 50 mi tüpler kullanımı kolaylaştırmak ve 20 ml numune için idealdir.
    3. Uygun bir pipet kullanılarak, her bir reaksiyon tüpüne sabit nihai hacmi muhafaza etmek için gerekli olan her bir ekstraksiyon tampon hacim.

3. Topaklanmak Bitki Farklı Polimerler ile ayıklar

  1. DOE randomize çalışma düzenine gösterilen sırayla olarak örnekleri, burada, 0.1-2.0 ml flokülant stok solüsyonu gerekli hacmi pipetle. İyice hemen tam 20 saniye boyunca sallayarak yoğun manuel olarak flokülantmın eklenmesinden sonra her bir örnek karıştırın.
    1. Gerekirse, iyice karışmasını sağlamak için diğer yem stokları sallayarak süresini ayarlamak, ama kesinlikle tüm örnekler için tutarlı karıştırma süreleri sağlamak. flocs geri dönüşsüz bozulmasına neden olabilir karıştırma uzun ve tutarsız bir flokülasyon sonuçlarını bozabilir sallayarak sırasında uygulanan kuvveti unutmayın.
  2. İsteğe bağlı: iki veya daha fazla pıhtılaştırma maddelerinin aynı anda uygulama için yukarıda tarif edilen prosedür değiştirin.
    1. Seçenek 1: İki veya daha fazla Flokülan, burada PEI ve kitosan karışımı ekleyin yerine tek bir polimer. DOE tanımlanan flokülan kombinasyonlarını kullanarak. DoE kurulumu (1.1) sırasında oranı ve bireysel parametre olarak polimerlerin mutlak konsantrasyonlarını birleştirir.
    2. 2. Seçenek: özü iki veya daha fazla polimer sırayla ekleyin.
      1. DoE kurulumu sırasında ek faktörler gibi bireysel polimer konsantrasyonları, kendi türünü ve özü her ilave arasında inkübasyon süresi kullanın.
      2. Ayrıca, tek bir polimer tekrar eklenmesi Pıhtılaşmanın iyileştirilmesi olup olmadığını test etmek için, bu yaklaşımı kullanır. Bir pıhtılaştırma yavaş ilavesini taklit etmek için bir adım adım eklenmesini, örn dört adımda, 20 mL'lik bir hacmi 4 üzerinde dakika için her ekleme 0.25 mi, 80 g L-1 flokülan hazır olan çökeltme maddesi ilave taklit edebilir0.25 mi dak-1 bir akış oranı.
      3. Her durumda, burada, örnek hacmi hala 22 ml tüm flokülant maksimum hacimleri ekleyerek bu kurulum için yeni bir maksimum nihai örnek hacmi belirlemek ve gerekirse ses ayarı için flocculant stok solüsyonları ve tamponlar gerekli hacimleri yeniden hesaplayın.
  3. topaklanma oluşumunu sağlamak için, DOE tipik olarak 3-30 dakika tanımlanan kez örnekleri inkübe edin. Diğer tüm inkübasyon koşulları emin olun örneğin sıcaklık, DOE göre ayarlanır.
  4. Gözlemlemek ve belge floc oluşumu. Gerekli topak mm yerleşmiş katı yüksekliğini ölçerek dakika başına hesaplaşma olarak örneğin olarak topaklanma oluşumu ilerleme kaydedin. Gerekirse, örneğin gece boyunca uzun bir süre için flokülasyon uzatır.
  5. Topaklanmış Özü Filtre.
    1. Daha önce hazırlanan filtre malzemelerini kullanın (2.3) uygun sonra pıhtılaşmış özü açıklığa kavuşturmak içinFiltre malzemesi ile ve temiz bir kap veya reaksiyon tüpüne pıhtılaşmış numuneler boşaltılarak inkübasyon süresi.
      1. Do not filtrasyon önce yerleşmiş yumakları yeniden askıya ve 20 ml'lik bir örnek için 3-4 sn ~ 300 oranında sahip ml dk -1 filtreye, ilgili özü uygulayın.
      2. Farklı malzemenin partikül tutma açısından son işleme kıyasla tezgah üstü deneylerinde kullanılan, filtreleme adımı performansının teyidi, her iki örnek tip 11, partikül boyut dağılımının ölçülmesi ile, örneğin.
    2. Örneğin bir türbidimetre bulanıklık ve / veya gerekli kullanılarak uygun cihazlar olarak parçacık boyutu dağılımı açısından, süzüntü analiz edin.
    3. İsteğe bağlı: kararsız flocs oluşumunu ya da reform araştırmak için, örneğin 12-24 saat, genişletilmiş kuluçka sürelerinden sonra analiz tekrarı.
  6. Pr Açısından örnekleri analizE-tanımlı Cevapları (1.1.3).
    1. Süzüntülerden numune almak ve farklı hedef protein ya da değerli ürünlerin konsantrasyonları örneğin, ek cevabı parametreler için analiz eder.
    2. İsteğe bağlı: sürecinin kütle dengesi kapatmak için aynı parametreler için bakiyenin (çoğunlukla katı) analiz edin. Özellikle, örnekler tedavi edilebilecek veya çökeltme ile tedavi edilmeyen sonra seri geri kalan katı karşılaştırarak sıvı kurtarma pıhtılaştırma etkisini ölçmek.
  7. veri kalitesini onaylamak ve DoE yazılımına sonuçlarını aktarmak.
    1. Toplanan cevap verilerde aşırı değerler, örneğin beklenmedik yüksek değerler için bak.
    2. Tüm yanıt verileri doğru bunlara karşılık gelen deneysel koşullar ile uyumlu olduğundan emin olun.
    3. DoE yazılım içine sonuçlarını aktarın ve standart ve randomize çalışma siparişleri karışık olmadığından emin olun.

4. değerlendirinDoE

  1. Daha önce 20 açıklandığı gibi bir öngörü modeli geliştirmek için DoE yazılım yerleşik veri analizi araçlarını kullanın.
    1. Model bina kolaylaştırmak için gerekirse uygun bir veri dönüştürme modunu seçin, burada 10 günlük. En büyük vs küçük tepki değeri A oranı daha büyük 10 veri dönüşümü gerekli olabileceğini gösterir. Box-Cox arsa 35 örneğin, uygun istatistiksel araçları kullanarak en uygun dönüşümü belirleyin.
    2. (I) seçilen DOE (1.2) uyan ve (ii) örn varyans (ANOVA) analizi dayalı soruşturma altında sistemi hakkında önceki bilgi DoE yazılım araçları, ikinci dereceden polinom ile kabul eder bir baz model seçti genellikle, bir birinci dereceden polinom daha inkübasyon süresi gözlenen etkisi daha iyi uyum sağlar.
    3. Onları seçimini kaldırarak iteratif önemsiz bir model faktörleri, örneğin p> 0.05, veya faktör etkileşimleri KaldırReby modeli karmaşıklığı azaltarak ve öngörü gücünü artırmak.
    4. R 2, düzeltilmiş R2 karşılaştırarak modeli kalitesini teyit ve studentized artıklarının normal olasılık arsa ile birlikte R 2 öngörülen, artıklar-vs-run, tahmin edilen vs-fiili ve Box-Cox 36 araziler. Tüm R2 değerleri 0.2 aralığında olmalıdır.
    5. Son model olumsuz konsantrasyonları tahmin edilen örneğin fizik ve termodinamik, temel varsayımlar kabul eder emin olun.
  2. Burada soruşturması kapsamında sistemin, düşük bulanıklık için en elverişli koşulları tahmin etmek modeli kullanın.
    1. En önemli tepkiler ve tercih ettikleri durumları seçip, en az bulanıklık örneğin. Built-in birkaç DoE yazılım paketleri 36 özellikleri bir cazibe işlevi veya benzer araçları maksimize ederek bu seçimleri birleştirin.
    2. amaçlanan uygulama o bağlımodeli f seçin onay koşulları en uygun olduğu tahmin takip deneyler olarak onları seçin ilk DOE parçası olmasa en uygun koşulları ve / veya örneğin, genel olarak modelin öngörü gücünü doğrulamak için çalışır.

5. Model geliştirin ve Tahmini Güç doğrulayın

  1. En çok arzu edilen çalışma koşullarına ilk tasarım alanı daraltmak 0-1.000 nefelometrik bulanıklık üniteleri (NTU) aralığında örneğin, düşük bulanıklık, model öngörüleri (4.2) dayalı.
  2. Yeni DoE önemli ya da ilgili olarak tespit edilmiştir sadece bu faktörler de dahil olmak üzere, bu aralıklar içinde kurmak (4.1.2)).
    NOT: Bir faktör bir süreç için model analizi, ancak ilgisiz açısından önemli olabilir, bir yanıt üzerindeki etkisi% 1 diğer faktörlere kıyasla yani.
  3. Model tahminlerinin kalitesi requiremen kavuşana kadar tekrarlayın 1-5.2 adımlarıts, örneğin bir yazılım ile gösterildiği gibi modelin standart sapması amaçlanan uygulama için yeterlidir. Örneğin arıtma tek topaklaştırıcı kullanın bu tekrarlamalar için gerekirse deneysel strateji değiştirin.
  4. Aktarın ve pilot ölçekli veya nihai üretim ölçeğine ölçek aşağı modelin sonuçlarını doğrulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Farklı polimerlerin tütün özü Flokülasyon

Yukarıda tarif edilen yöntem, başarılı bir şekilde monoklonal bir antikor (HIV nötralize edici antikor 2G12) bir floresan proteini (DsRed) (Şekil 1) 16 üretimi sırasında tütün ekstraktlarının flokülasyon için bir işlem geliştirmek için kullanılmıştır, ve o zamandan beri aktarıldı lektinler, sıtma aşısı adayları ve füzyon proteinlerinin (yayınlanmamış veriler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

En önemli yönü parçacık topaklanmayı karakterize bir Doe kurarken tasarım prensibi örneğin pH, polimer tipi ve polimer konsantrasyonunun 16 etkisi beklenen veya olası etkileri 36,38, algılamak ve anlatmak gerekir olduğunu düşünün. Nedenle, gerçek deneyler başlamadan önce tasarım alanı (FDS) kısmını değerlendirmek önemlidir. FDS örneğin 250 bulanıklık bir fark tespit edilmesi, bilinen bir değişkenlik sistemi verilen Deney sonuçları arasındaki önceden belirlenen farkları tespit etme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar ifşa herhangi bir çıkar çatışmaları vardır.

Teşekkürler

Transgenik tütün tohumlarını sağladığı için Dr. Thomas Rademacher'e ve tütün bitkilerini yetiştirdiği için İbrahim Al Amedi'ye teşekkür ederim. Editöryal yardımları için Dr. Richard M. Twyman'a ve verimli tartışmalar için Prof. Dr. Rainer Fischer'e teşekkür etmek isterim. Bu çalışma kısmen Avrupa Araştırma Konseyi İleri Hibe ''Future-Pharma'', 269110 teklif numarası, Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) ve Fraunhofer-Gesellschaft Hibe No'lu İç Programlar tarafından finanse edilmiştir. 125-600164 çekin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2100P Taşınabilir TürbidimetreHach4650000Türbidimetre
2G12 antikorPolymunAB002Referans antikoru
Biacore T200GE Sağlık28-9750-01SPR cihazı
BP-410Furh2632410001Torba filtre
Catiofast VSHBASF79002360Topaklaştırıcı ajan
Santrifüj 5415DEppendorf5424 000.410Santrifüj
Santrifüj tüpü 15 mlLabomedik2017106Reaksiyon tüpü
Santrifüj tüpü 50 ml kendi kendine duranLabomedik1110504Reaksiyon tüpü
KitosanCarl Roth GmbH5375.1Topaklaştırıcı ajan
Design-Expert (R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEyazılımı
Disodyum fosfatCarl Roth GmbH  4984.3 Medya bileşeni
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Gübre
Forma -86C ULT dondurucuThermoFisher88400Dondurucu
Serayetiştiriciliği için
Grodan Taşyünü Küpleri 10 x 10 cmGrodan102446Taşyünü blok
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Medya bileşeni
K700P 60DPall5302305Derinlik filtre katmanı
KS50P 60DPallB12486Derinlik filtre katmanı
MiraclothLabomedic475855-1R Filtrebezi
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH metre / iletkenlik ölçer
Osram soğuk beyaz 36 WOsram4930440Işık kaynağı
PhytotronIlka Zelln.a.Bitkiyetiştiriciliği için
Polymin PBASF79002360Topaklaştırıcı ajan
POLYTRON PT 6100 DKinematica11010110Özel bıçak aletli homojenizasyon cihazı
Protein ALife teknolojileri10-1006Antikor bağlayıcı protein
Sodyum klorürCarl Roth GmbHP029.2Medya bileşeni
Sinerji HTBioTekSIAFRTFloresan plaka okuyucu
TRISCarl Roth GmbH4855.3Ortam bileşeni
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Ortam bileşeni
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Filtre muhafazası
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS partikül boyutu dağılımı ölçümü
n.a.n.a.Bitki

Kaynaklar

  1. Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
  2. Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
  3. Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
  4. De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  8. Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
  9. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  11. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  12. Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
  13. Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
  14. Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
  15. Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
  16. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  17. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  18. Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
  19. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
  20. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  21. Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
  22. Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
  23. Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
  24. Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
  25. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  26. Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
  27. Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
  28. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  29. Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
  30. Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
  31. Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
  32. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
  33. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  34. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  35. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
  36. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  37. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  38. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Flok lant Verimlili iBitki Ekstrakt Berrakla t rmaDeney Tasar mBulan kl k l mPolimer TaramaFlok lasyon S reciDerinlik FiltrasyonuT t n Yapra EkstraktS re OptimizasyonuKat S v Ayr m

İlgili makaleler