Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

intra-trakeal İdaresi

10.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53964

⸱

2 Mart 2016

 ,  , 
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

Bu makalede

Özet

Haemophilus influenzae'nin farelerin alt solunum yollarına intra-trakeal inokülasyon prosedürünü gösteriyoruz. Bu, fare modellerinde hava yolu iltihabını düzenleyen sinyal yollarını incelemek için çok kullanışlı bir araçtır.

Özet

Burada, verimli ayrıntılı bir prosedür tanımlamak ve doğrudan Haemophilus influenzae teslim farelerin alt solunum yollarına. Biz H. hazırlanması için prosedür göstermek influenza aşı, H. içi trakeal damlatma akciğere influenzae, farklı gen ekspresyon analizi için bronko-alveolar lavaj sıvısı (BALF), BAL sıvısında bağışıklık hücrelerinin analizi ve RNA izolasyonu toplanması. Bu prosedür, bir bakteri, virüs ya da mantar akciğer enflamatuar yanıtı çalışma için kullanılabilir. daha az belirsizlik ile daha verimli alt solunum yollarına bakteriyel inokulum sunar, çünkü doğrudan trakea damlatma çoğunlukla burun veya aerosol inhalasyon prosedürleri tercih edilir.

Giriş

Enflamasyon enfeksiyöz ajanlara karşı savunma temel bir bağışıklık mekanizmadır. Bu patojen ortadan kaldırılması ve hasarlı doku onarımını teşvik eder. Aynı zamanda normal sağlıklı durumuna 1'e kurtarma kolaylaştırır. Ancak, düzensiz inflamasyon sıklıkla kronik enflamatuar hastalıklar 2 yol açar. Hava yolu inflamasyonu, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (COPD), astım ve pulmonar fibrosis 3 farklı akciğer hastalıkları için bir başlangıç ​​tetikleyicidir.

Tiplendirilemeyen (kapsüllenmemiş), Haemophilus influenzae (NTHi) kronik üst ve alt akciğer enflamatuar hastalıklar 4,5 ile ilişkilidir. Kronik obstrüktif akciğer hastalığı 4,6,7 çocuk ve yetişkinlerin alt solunum yolları izole baskın türdür. NTHi enfeksiyon sonrası inflamatuar yanıtı (örneğin, TNF ve IL-1 gibi) proenflamatuar sitokinlerin regülasyonu ile karakterize edilir ve b aracılıky mitojen aktive protein kinaz (MAPK) ve toll benzeri reseptörler aracılığıyla nükleer faktör-KB (NF-KB) (TLR) 8.

Fare modelleri nedeniyle farklı gen eksikliği hatlarının durumu akciğer inflamatuar hastalığın altında yatan patolojiyi analiz etmek için çok yararlı araçlardır. Çeşitli metotlar, intranazal uygulaması ve aerosol haline getirilmiş inhalasyon 9,10 dahil olmak üzere, canlı / zayıflatılmış bakterileri ve bakteriyel ürünler, aşılamak için kullanılmıştır. Burada, içi trakeal instilasyon göstermektedir. daha az sıklıkta kullanılmasına rağmen, bu yaklaşım daha verimli ve çünkü daha düşük solunum sistemine inokulum doğrudan teslimat yüksek tekrarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler Baylor Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yapıldı.

1. Kültürleme tipi belirsiz Haemophilus influenzae (NTHi) ve aşı hazırlama

  1. Bir çikolata agar plakası üzerinde Plaka NTHi ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde başaşağı plaka tutun. Ertesi gün, kültür beyin kalp infüzyon suyu bakteri. Daha sonra, steril 1.5 ml'lik tüp içine suyu 1 ml.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüjleyin. Sonra, süpernatantı atmak ve steril 1x PBS 1 ml pelet yeniden askıya. kez bu adımı yineleyin.
  3. Bir spektrofotometrede 600 nm dalga boyunda seyreltilmiş kültür absorbansı 1x PBS 900 ul içinde yeniden süspansiyon haline çözeltisi 100 ul aktarın ve ölçün.
  4. canlılık ve koloni oluşturan birim belirleyinçukulata agar plakaları üzerinde 1:10 seri dilüsyonları kültürlenmesi ve CO2 37 ° C'de gece boyunca inkübe ve% 5 inokulum S (CFU).
  5. Önceki aşamada belirlenen canlılık ve CFU göre, 20 x 10 6 CFU / ml'lik bir son konsantrasyona inokulum ayarlayın.

2. İçi trakea (o) damlatma

  1. 150 mg / ml ketamin + 20 mg / ml ksilizin çözeltisi ile fare, 0.1 ml / 10 g vücut ağırlığına sahip intraperitonal fare (ip) enjekte edilir. prosedür hayvan sıcak tutmak için bir ışık kaynağı ile kaputu yapılmalıdır.
  2. Fare yeterli anestezi olduğunu doğrulamak için fare birlisme alan sıkıştırın.
  3. Sırtında fare yerleştirin. boyun ventral alan tıraş ve klorheksidin ve% 70 etil alkol ile dezenfekte edin.
  4. Sıçan diş forseps kullanarak boyun üst karın kısmının cilt kaldırın. Bir neşter kullanılarak timus üzerinde küçük bir kesi (0.5-1.0 cm) yapmakve dikkatle trakea maruz kas teşrih.
    1. 27 G iğne ile 1 ml hava ile yavaş yavaş başka bir 0.05 ml hava ve ardından, bir kontrol olarak, Bölüm 1 veya tuz elde edilen 0.05 mi NTHi, ardından 0.05 mi hava, enjekte edilir. yaklaşık 1 dakika boyunca dikey hayvan tutun.
  5. cerrahi yapıştırıcı ile kesi kapatın. yaklaşık 10 dakika yanal yaslanmış ve sıcak fare tutmak.

3. BALS Koleksiyonu

  1. enfeksiyondan sonra servikal dislokasyon 24 saat ile fare Kurban.
  2. anatomik makas ile fare karın boşluğuna açın ve kanamaya ventral aort kesti. Akciğerin ventral kısmını Açığa.
  3. trakea Açığa ve 20 gauge kateter ile entübe. BALF tamponu 0.8 ml (1 x PBS,% 0.1 dekstroz, 10 U / ml heparin) aşılamak ve yumuşak aspirasyon ile lavaj toplanır. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
  4. Bir hemocyto kullanılarak BALF süspansiyon 100 ul toplam hücre sayısınıTripan Mavisi boyama ile 10X büyütme altında ölçer.
  5. modifiye Giemsa boyama için slaytlar hazırlayın. 5 dakika boyunca 500 xg'de Sitospin ve santrifüj uygun oyuklarına BAL'da alikosu 100 ul. 10 dakika için slaytlar kurutun ve üretici protokollerine göre modifiye Giemsa kullanarak hücreleri leke.
  6. Bu floresans (FACS) aktive hücre, konfokal mikroskopi, gen ifadesi ve western blot 11-13 kadar bir sonraki analiz için geri kalan hücreler, kullanın.

4. Histopatolojisi Hazırlık

  1. Adım 2.4 açıklandığı gibi histopatoloji analizi için, NTHi ile fareleri enfekte. enfeksiyonun 24 saat sonra, servikal dislokasyon ile hayvanlar kurban. akciğerler ve daha önce de belirtildiği gibi trakea maruz anatomik makas ile göğüs boşluğu açmak kesin. Sonra, trakea içine 20 gauge kateter yerleştirin.
  2. % 4 formalin içinde hazırlanan% 2 sıcak agaroz çözeltisi ile akciğer doldurun. Bir kereAkciğerler tam agaroz çözüm katılaşmaya akciğerlere üstüne yeri buz, şişirilmiş.
  3. Sonra, dikkatle göğüs fişi çıkarın ve hematoksilen ve eozin (H & E) bölümleri için işlenir kadar 1x PBS içinde% 4 formalin 50 ml çözelti koydu.

BAL'da Hücreleri Boyama 5. FACS

  1. 96 oyuklu V-tabanlı mikro titre plaka BALS sıvısından 1 x 10 5 hücre koyun.
  2. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 4000 x g'de 300 soğuk 1 x PBS ul ve spin hücreleri yıkayın.
  3. (1: 1000 seyreltme) 100 ul 1x PBS hücre leke çözeltisi ile hücreleri leke ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında tutulması.
  4. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 4000 x g'de soğuk 1 x PBS, 300 ul hücre yıkayın.
  5. 1 içeren FACS yıkama tamponu [Yıkama tamponu (1 x PBS,% 2 FBS, 1 mM EDTA,% 0.1 sodyum azid] 100 ul hücre edin: 100 seyreltilmiş Fc Block, 4 ° C'de 15 dakika karıştırıldı.
  6. 4.000 xg'de Santrifüj hücreleri 3 dakika ve sup atınernatant.
  7. 4 ° C'de 30 dakika boyunca bir FACS yıkama tamponu (100 seyreltme 1) 100 ul yüzey boyama kokteyli ile Leke hücreleri.
  8. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 4000 x g'de FACS yıkama tamponu 300 ul ile üç kez hücreleri yıkayın.
  9. Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid, 100 ul hücre düzeltildi.
  10. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'de PBS 1X 300 ul hücreler iki kez yıkanır ve FACS yıkama tamponu 300 ul içinde yeniden askıya.
  11. boncuk flow sitometri kullanılarak tek renkli boyama kontrolleri yapın.
    1. 96 oyuklu V-tabanlı mikrotiter plakası içine tanelerin bir damla ekleme ve PBS 1X 200 ul ile yıkayın.
    2. PBS ve boncuk 1x 100 ul lekeleme antikorun 1 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
    3. PBS 1X 300 ul iki kez boncuk yıkayın.
  12. 14 flow sitometri tek lekeli kontrolleri ve hücreleri analiz edin.

RNA izole etmek Akciğer Doku 6. Homojenizasyon

  1. Enfeksiyondan sonra, akciğer (20-40 mg), küçük bir parça toplamak ve gece boyunca 4 ° C 'de reaktif stabilize edici RNA tutun. Daha sonra, bir sonraki aşamada kadar -80 ° C'de saklayın.
  2. RNA stabilizasyonu ayıracı kurtulmak için soğuk 1x PBS akciğer dokuları yıkayın.
  3. 1.5 ml santrifüj tüpü ihtiva eden liziz tamponu (1 mi liziz tamponu, 10 ul β-merkaptoetanol) halinde doku yerleştirin.
  4. sivri makas kullanarak küçük parçalar halinde doku doğrayın ve 20-40 saniye boyunca bir kablosuz motorlu pelet havaneli kullanarak homojenize.
  5. 5 dakika boyunca buz üzerinde lizat tutun ve adım 7.1 ile devam edin.

Akciğer 7. RNA İzolasyon

  1. 3 dakika boyunca 18.000 x g'de lizat santrifüjleyin. pipetle ile süpernatantı ve dikkatle yeni bir 1.5 ml tüp aktarın.
  2. lizat% 70 etanol içinde 1 hacim. Pipetleme tarafından hemen karıştırın ve 2-4 dakika bekleyin.
  3. yerleştirilmiş bir döndürme kolonuna lizat 700 ul kadar transfer2 ml'lik bir toplama tüpü içinde.
  4. 15 saniye boyunca 9.600 xg'de Santrifüj ve flow-through atın.
  5. 15 saniye boyunca 9.600 xg'de 350 mcL sıkı yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. flow-through atın.
  6. Doğrudan spin kolon zarına 80 ul DNaz eklenir ve 15 dakika için oda sıcaklığında saklayın.
  7. 15 saniye boyunca 9.600 xg'de spin kolon ve santrifüj 350 ul sıkı yıkama tamponu ekleyin. flow-through atın.
  8. 15 saniye boyunca 9.600 xg'de 500 ul RNA yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. flow-through atın.
  9. 2 dakika süreyle 9600 xg'de 500 ul RNA yıkama tamponu ve spin ekleyin. flow-through atın.
  10. 1 dakika boyunca 9.600 xg'de yeni 2 ml toplama tüpü ve santrifüj spin kolon yerleştirin. flow-through atın.
  11. 1 dakika boyunca 9.600 x g'de spin kolon ve santrifüj doğrudan 30-50 mL RNaz içermeyen su ilave edilir. -80 ° C'de saklayın RNA.
  12. RNAseq analizi 14 gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Intra-trakeal instilasyon tuzlu su ile yükleme daha BALS (Şekil 1A, sol panel) lökositlerin belirgin artan sayıda sonuçlandı. Lökositlerin diferansiyel sayısı analizi açık bir şekilde artmış nötrofil infiltrasyon (Şekil 1, sağ panel) göstermiştir. BAL sıvısında hücrelerinin FACS analizi daha da nötrofillerin sayısını (Şekil 1B) doğruladı. Akciğer dokusunda H & E-boyanan kesitler histolojik analiz havayolu inflamasyonu (Şekil ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, bakteriyel akciğer patojen ile farelerin akciğerleri aşılamak için eşsiz ve minimal invaziv prosedürü açıklar. Bu prosedür, inflamatuar sinyal yollarının genleri eksik olan fareler kullanılarak, farklı genlerin fonksiyonunu incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu prosedür, aynı zamanda, viral ve mantar akciğer enfeksiyonu enflamatuvar yanıtları incelemek için kullanılabilir. Böyle intranazal veya aerosol inhalasyon gibi diğer yöntemlere göre bu prosedürün avantajları (1) Bu prosedürde, patojenik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

El yazmasını eleştirel bir şekilde okuduğu için Dr. Carson Harrod'a teşekkür ederiz. Ayrıca katkılarından dolayı Sayın Minghui Zeng ve Dr. Mahesh Kathania ve Prashant Khare'ye de teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği'nden (Araştırma Bursu hibesi, 122713-RSG-12-260-01-LIB) ve Sammons Kanser Merkezi'nden (Pilot Proje hibesi) K. Venuprasad'a verilen hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Çikolatalı agar plakasıFisher ScientificCAS50-99-7
Dekstroz SusuzThemo ScientificR01300
HeparinHospira,IncRL-3010
Deft hızlı çözümSigmaGS500-500ML
Şırınga iğnesi 20 / 26G & nbsp;BD(REF305115 / 175)
Iml şırıngaBDREF 309602
Kateter 20GABDREF
381433 Diseksiyon Makası, düz, 10 cm uzunluğundakentscientificINS600393
İris Forseps, tırtıklı, 10 cm uzunluğundakentscientificINS650915
Cımbız #5 Paslanmaz çelik, 11 cm uzunluğundakentscientific
%10 FormalinFisher ScientificCAS 67-56-1
Agarozpeqlab35-1020
5ml polistiren yuvarlak tabanlı tüplerBDREF 352058
1.5 ml Mikrosantrifüj tüpleriLight LabsA-7001-R
Reasy Mini  kiti Qiagen74104
Pelet pestil motor (Doku homojenleştirici)SigmaZ359971-1EA
96 kuyulu mikrotitre plakaları V altThermo2605
1X PBSGibco10010-023
OneComp eBeadseBioscience01-1111-42
CD45.2-APCeBioscience17-0454-81Çalışma seyreltme 1:100
Ly-6G-eFlor 450eBioscience48-5931-82Çalışma seyreltmesi 1:100
BSA HyCloneSH30574.03
RBC Lizis Tamponu (10X)Biolegend420301
Canlı/Ölü sabitlenebilir aqua ölü hücre leke kitiInvitrogenL-34957
EDTA (0.5M)lifetechnologies15575-020
CD16/ CD32 FcBlockBD553142
Facs tüpleri polistiren yuvarlak alt tüpBD352052
FormaldehitPolyscience4018
INS600095

Kaynaklar

  1. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
  4. Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
  5. King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376(2015).
  6. Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
  7. King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
  8. Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
  9. Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
  10. Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
  11. Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
  12. Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).
  13. Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446(2015).
  14. Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22(2015).
  15. Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
  16. Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Bronkoalveoler LavajRNA zolasyonuAk SitometrisiKonfokal MikroskopiHemositometreGen Ekspresyonu
intra-trakeal İdaresi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.