Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Özet

Bu protokol, fare koroner endotel hücrelerini görüntüleme veya moleküler biyolojik deneyler yapmak amacıyla izole etme yöntemimizi paylaşmak için hazırlanmıştır.

Özet

Endotel hücreleri, kan damarlarının iç çeperini kaplamak ve damar tonu, vasküler geçirgenlik ve yeni damar oluşumu düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücre fonksiyon bozukluğu, iskemik kalp hastalığı da dahil olmak üzere birçok kardiyovasküler hastalıkların gelişimi ve ilerlemesinde rol oynar. fonksiyonu ve koroner endotel hücrelerinin karakterizasyonu incelemek için, hücre izolasyonu ilk adımdır ve daha sonraki deneyler yüksek saflıkta ve miktarını gerektirir. Bu protokol, yetişkin fare koroner endotel hücrelerini izole etmek için etkili bir yöntem tarif eder. Fare kalp disseke ve küçük parçalar halinde kıyılmış. dispaz ve kolajenaz II kullanılarak kalbin sindirimden sonra hücreler yıkanır ve anti-CD31 antikoru ile konjuge edilmiş, manyetik boncuklar ile inkübe edildi. endotel hücreleri ile boncuk yıkanmış birkaç kez ve görüntüleme ve moleküler biyoloji experime dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda kullanıma hazırNTS. Verimli izolasyon% 90'ın üzerinde saflıkta tek yürek başına yaklaşık 10 ⁴ hücre verir.

Giriş

Çeşitli kardiyovasküler hastalıklar ve metabolik bozukluklar fare modellerinde hastalarda bulunan benzer fizyolojik ve moleküler değişiklik taşımaktadır. Ayrıca, farelerin genetik değişim bizi hastalıkların gelişimi ve ilerlemesinde belirli genlerin patojenik rolünü araştırmak için olanak sağlayan güçlü bir araçtır. Günümüzde, hücre tipi-özgü gen in-tak ya -kasa farenin kolayca farenin gerçek genetik olarak tadil edilmiş olup olmadığını belirlemek için ilk adımdır spesifik hücre tipleri çok laboratuar ve mRNA ölçümü ve protein seviyeleri üretilir.

Endotel endotel hücreleri (EC) hatları, iç damar duvarı ince bir tek tabakadır. Endotel hücreleri, vasküler tansiyon, damar geçirgenliğini ve yeni damar oluşumu ^1,2 düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Endotel disfonksiyonu, birçok patolojik durumlarda ve endotel fonksiyonu değişiklikleri bir işaretidir çeşitli araç yol açabilir olduğunukardiyovasküler hastalıklar ^3,4. Fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında endotel hücrelerinin işlevini incelemek böylece önemlidir.

Orada ECS ^5-8 izole etmek çeşitli yolları vardır ve izolasyon yöntemi doku ve türlerin kullanılacak olan bağlı optimize edilmiş olması gerekir. Farklı dokulardan EC yüzey belirteçleri ile ilgili ve protein ekspresyonu ⁹ heterojenlik ileri düzey bir olmasıdır. endotel hücrelerinin Başarılı izolasyonu genellikle zor olabilir ve eğitim ve uygulama bir dereceye gerektirir. elde kez, bu protokolde öngörülen izolasyon yöntemi istikrarlı ve verimli olduğunu kanıtlamaktadır.

Bu yöntemin genel amacı yüksek kalite ve miktar fare koroner EC (MCECs) elde etmektir. Bir kalp toplanan hücrelerin miktarı diğer teknikleri kullanarak, diğer dokulardan elde hücrelerden daha az olsa da, bu teknik yine de bahsi sağlarter kalitesi. Elde edilen popülasyonda endotel hücrelerinin saflığı% 90 daha büyüktür. Bu nedenle, bu teknik, hücre görüntüleme gibi tamamen izole edilmiş endotel hücreleri kullanan uygulamalar için ideal olacaktır.

Protokol

fareler üzerinde araştırma Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) kurallarına göre gerçekleştirildi.

Not: Bölümler 1, 2 ve 3 kurulum olarak Deneyden bir gün önce yapılmalıdır.

1. hazırlanması Çözümler

1. CD31 tamponu (50 mi)
   1. 50 ml'lik bir tüpe 50 mi 1 x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. 0.05 g Sığır Serum Albümini (BSA) ve 0.037 g etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) tartılır ve bir 50 ml tüp ekleme toz eriyene kadar 1 saat boyunca döndürmek için tüp koydu. 7.4 pH ayarlama yeni bir 50 ml tüp içine 0.2 um'lik bir filtreden filtre ve kullanılana kadar 4 ° C'de muhafaza edin.
2. HEPES Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (500 mi)
   1. HBSS çözeltisi içinde 10 mM HEPES yapmak ve iyice karıştırın HEPES 1,1915 g ekleyin. pH ölçümü ve 7.4 ayarlamak. 4 filtre ve mağaza˚C.
3. 1x Krebs çözeltisi (1 L),
   1. 1 L'lik bir şişeye damıtılmış su çift 10 x Krebs çözeltisi [Tablo 1], 100 ml ilave edilir. 2.1 gr sodyum bikarbonat ve 2 g D-glikoz tartılır ve şişeye ilave edin. Karıştırın ve 1 L. toplam ses seviyesini ayarlamak
   2. Kaput içinde 30 dakika ve filtre solüsyonu% 95 O _{2/5% CO2} gazı ile kabarcık çözeltisi. 4 C'de muhafaza ve deney sırasında buz üzerinde tutmak.

2. Manyetik Boncuk hazırlanması

1. Her 1.5 ml tüp (örnek başına bir boru) 1 ml CD31 tampon ekleyin. Koyun anti-fare IgG boncuk karışımı ve her numune [Tablo 1], uygun miktar ekleyin. kuvvetlice 30 kez tüpleri çalkalayın ve çalkalama 1 dakika süreyle manyetik plaka koyun. plaka üzerinde iken tüpler açın ve bir kovaya çözümler dökümü.
2. Her tüpe 1 mi CD31 tampon ekleyin. 2 ul sıçan anti-fare CD31 anti-eklemeHer tüpe gövde ve 4 ºC de tüpler O / N çevirin.

3. Otoklavlama

1. Tüm cerrahi aletler ve pipet uçları otoklavlayın. 4 farklı çaplarda ipuçları vardır, böylece dar olan en geniş dan, pipet uçları uçlarını kesin. İpuçları için yaklaşık çapları 3 mm, 2.5 mm, 2 mm, sırasıyla 1.5 mm'dir. ipuçları kesin ve 121 ºC sıcaklıkta sterilizasyon 30 dakika ile bir gün önce otoklav.
   Not: Bölüm 4-11, deney günü yapılmalıdır.

4. hazırlanması Çözümler

1. M199 2% Demir-Müstahkem Buzağı Serumu (IFCS) içeren yıkama tamponu hazırlayın. görüntüleme için, 30 ml / fare hazırlamak.
2. enzim çözeltisi (10 mi / numune) hazırlayın. 50 ml'lik bir tüp içine 0.6 birim / dispaz ml ve 1 mg / kollajenaz tip II ml tartılır. M199 ekleyin ve 15 dakika boyunca 4 ° C'de tüp döndürün. insid yeni 50 ml'lik bir tüp içine 0.2 um'lik bir filtreden filtree kaput ve kullanılıncaya kadar 4 ° C'de tutun.
3. Heparin ile HBSS / HEPES hazırlayın. 15 ml'lik bir tüp içinde 10 mM HEPES içeren HBSS, 10 ml ekleyin. tüpe Heparin 100 ul ekle ve kullanılana kadar 4 ° C'de tutun.

5. Yıkama Boncuk

1. 4 ° C'de rotator gelen boncuklar tüpleri dışarı atın ve kaput getirmek. Manyetik plaka tüpler koyun ve 1 dakika boyunca çalkalanır. çözelti dökümü ve her tüpe 1 mL CD31 tampon eklemek.
2. Manyetik plaka dışında tüplerini alın ve kuvvetlice 30 kez çalkalayın. Manyetik plaka tüpler geri koymak ve 3 yıkar toplam tekrarlayın. tamamlanmasından sonra, 4C geri tüpleri koymak ve kullanılana kadar dönen tutmak.

6. Diseksiyon

1. Kan pıhtılaşmasını önlemek için, heparin 0.1 ml intraperitonal fareler enjekte edilir. Daha sonra pentobarbital 0.01 ml intraperitoneal kullanarak fareler uyutmak, 10 dakika bekleyin. Fare duygu olup olmadığını kontrol edinayak kısma ağrı.
2. kafa ile bir polistiren gemide fare yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve iğneler ile silah tutun. boğazına kadar üst torakal alanda deriyi kesme forseps ve sert kesme makas kullanın.
3. diyaframın hemen üstünde göğüs kafesinin ortasında bir kesim olun. kalp ve akciğerler açığa bir üçgen yapmak için boğaz doğru yanlara ve yukarıya kemik kesti. diyaframın hemen üstünde aorta kesin.
4. çekerek olmadan forseps ile timus tutun ve birlikte akciğer ve kalp kaldırmak için dikkatlice herhangi bir bağ dokusu kesmek için makas kullanın. 1 × Krebs bir beher yer dokular, forseps ile sallamak ve 1 × Krebs ile 6 cm çanak aktarın.
5. makas ve forseps kullanarak akciğer lobları çıkarın. aort içine 20 G steril kateter yerleştirin. HBSS / Heparin ile koroner dolaşım sisteminde kan yıkayın. , Ventrikül küçük bir kesim yapmak kalbi sallamak ve M199 bir örnek tüpüne transfer. buz üzerinde tüpler tutun.

class = "jove_title"> 7. Doku sindirimi

1. Enzim çözeltisi, 10 ml dolu 6 cm çanak kalp transfer ve makas kullanılarak küçük parçalar halinde kıyma. 15 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde yemekler yerleştirin. Doku kolay geçmesine izin vermek için bir kesik ucuna bir ucu aşağı 30 kez yukarı pipetleme tarafından sindirilmiş malzemeleri çalkalayın.
2. Başka bir 15 dakika süreyle 37 ºC inkübatör geri koyun. Ajitasyon üç kez tekrarlayın, büyük açıklıklar gelen pipet uçları kullanarak her zaman dar ve her arasında 15 dakika inkübasyon için.
3. Son 15 dakika inkübasyondan sonra, dışarı ve kaputun içine numune almak. Pipetleyin çözüm yukarı ve pipet ucu dar açılması ile yeni bir 50 ml tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden geçmesi kullanarak aşağı 30 kere.
4. 10 ml'lik pipet kullanarak 10 ml yıkama tamponu ile çanak yıkayın ve hücre süzgecinden üzerine aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 g'de santrifüj ve spin 50 ml tüpler koyun.

Boncuk ile itle "> 8. Yıkama ve Konjugasyon

1. pelet bozmadan süpernatantı. iki kez 5 ml yıkama tampon maddesi ile hücreleri yıkayın.
2. Daha önce biri bir anda bir tüp boncuk ve çalışma ile 1.5 ml tüpler hazırlandı alın. Manyetik plaka bir 1.5 ml tüp koymak 3 kez sallayın ve açın.
3. Son santrifüj sonra, pelet bozmadan mümkün olduğunca süpernatant kaldırmak. kuvvetlice iterek hücre kümeleri ilişkisini.
4. 50 ml'lik bir tüpe 1 mL yıkama tamponu ilave edin ve 1 ml pipetle hücreler karıştırın. 1.5 ml tüp solüsyonun dökümü ve boncuk 50 ml'lik bir tüp hücre süspansiyonu 1 ml. boruları 30 kez Flick, daha sonra 30 dakika boyunca 4 ° C'de döner.

9. Hücre Kültürü / Görüntüleme için hazırlanıyor

1. hücreleri kaplama için bir oda hazırlayın. kaplamak için de yüzey bölmeye jelatin çözeltisi (w / v% 5, 300 ul) ilave edin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. İnkübasyon, rem sonrasıove jelatin ve kuru yüzey.
2. Dönme 30 dakika sonra boncuk / hücreleri ile tüpler dışarı atın ve kaput içinde manyetik plaka koymak. 2 dk, dökümü için çalkalayın ve 1 ml yıkama tampon ekleyin.
3. plaka üzerinden tüpleri almak, şiddetle 30 kez sonra fiske 30 kez çalkalayın. Manyetik plaka onları geri koymak ve 1 dakika boyunca çalkalanır. 5 yıkama toplam 4 kez tekrarlayın, fakat 1 dakika plaka üzerinde çalkalayarak.
4. Son yıkamadan sonra, bir tüp çıkar ve bir anda her tüp biri üzerinde çalışmak. Daha sonra 30 kez fiske 30 kez çalkalayın. Manyetik plaka üzerine koyun ve 1 dakika boyunca çalkalanır. Damper ve (37 ºC'de önceden ısıtılmış) 1 ml% 20 IFCS AK medya ekleyebilirsiniz.
5. kuvvetlice 30 kez daha sonra 30 kez fiske sallamak. 500 ul pipetlemeyin ayarlayın ve pipetlemeyin yukarı ve 10 kez aşağı. Her bölmeye 500 ul aktarın.
6. 37 ºC inkübatör koymak ve / N O bırakın. Bir sonraki gün,% 10 FBS AT ortam hücreleri yıkayın.

Western Blot (WB) Örnekleri 10. hazırlanması

1. Takdönme 1 saat sonra boncuklar / hücreleri ile tüpler dışarı e. Manyetik plaka koyun ve 2 dakika süreyle çalkalayın. Süpernatantı dökümü ve 1 ml soğuk HBSS ekleyin. kuvvetlice 30 kez daha sonra 30 kez fiske sallamak. 3 yıkama için iki kez tekrarlayın, ancak 1 dakika plaka üzerinde çalkalayarak.
2. Son yıkamadan sonra, manyetik plaka üzerine tüpleri koymak ve 1 dakika boyunca çalkalanır. Pipet kullanarak tamponu çıkarın ve bir yöntemi daha önce ^11,12 açıklanan kullanarak WB için hücrelerin lize. Toplanan lizat genellikle yaklaşık 30 ug protein içerir.

11. Görüntüleme

1. Bir bölme için 250 ul nihai hacimde, medya hücreleri 3 kez yıkayın. hücrelere Dil-acLDL 1.5 ul ekle. Bu noktadan sonra, karanlıkta hücreleri tutun.
2. 37 ° C'de 3.5 saat süreyle inkübe edin. Hoechst 1.5 ul ekleyin karıştırın ve PBS ile 37 ˚C.Wash hücre, 30 dakika boyunca inkübe ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4'lük paraformaldehit (PFA) ile tespit edin.
3. 30 Mİ-PBS BSA PBS ile iki kez yıkanır ve% 5 ile blokeOda sıcaklığında n. % 1 BSA-PBS ile iki kez yıkanır. ml 2 ug / bir konsantrasyona kadar% 1 BSA-PBS ile BS-lektin FITC seyreltilir ve her bir bölmeye 300 ul ekle.
4. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında orbital bir karıştırıcı üzerinde odasına koyun. PBS ile 3 kez yıkayın.
5. FITC (Lektin boyanma, EC işaretleyici, uyarma / emisyon 488 nm / 519 nm), DAPI (Hoechst, 358 nm'de bir nükleer boyanma, uyarma / emisyon / 30 ms 200 msn pozlama süresi ile floresan mikroskop altında hücrelerin görselleştirmek 461 nm) ve 557 nm / 576 nm) TRITC (acLDL boyaması, EC işaretleyici, uyarma / emisyon 300 milisaniye. 20X objektif lens kullanarak görüntüleri elde edin.

Sonuçlar

Bir fare kalp koroner endotel hücrelerinin başarılı izolasyonu tipik bir Arnavut kaldırımı şekli ile% 90'ın üzerinde saflıkta yaklaşık 10 ⁴ hücre verir. endotel hücreleri saf nüfus için, dikkatli her türlü kirlilikten arındırılmış steril bir ortam sağlamak için protokol boyunca alınmalıdır. uzatılmış hücreler ya da nüfus içinde büyütülmüş hücrelerden görünümü, diğer hücre tipleri, yumuşak kas hücreleri ve fibroblastlar ile kirlenmesini ifade eder. Endotel hücre saflık test...

Tartışma

Araştırmada en yaygın olarak kullanılan endotel hücreleri nedeniyle rahatlık ve kültür kolaylığı, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) vardır. Bununla birlikte, bir çok araştırma diğer özel organlar ¹⁰ arasında endotel hücrelerinin izolasyonu ile elde edilen fizyolojik modelin varlığını gerektirir. Endotel hücreleri, kalp dokusu hücrelerinin çok küçük bir popülasyonu oluşturan; onların izolasyon ve kültür çok zor olabilir kanıtlayabilirim.

Bu protokol kapsamında üç krit...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BSA	Sigma	A3311-10G
EDTA	Fisher	BP120-500
HBSS	Fisher	SH3026801
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Sodyum Bikarbonat &	Sigma	S5761
D-(+)-Glikoz	Sigma	G7021-1KG
DynaBeads pan fare IgG boncuk ve nbsp;	Thermo Fisher Scientific	11035
Sıçan anti-fare CD31 Antikor	BD Biosciences	550274
IFCS	Fisher	SH30072.04
M199	Fisher	MT10060-CV
Dispase (Nötr Proteaz)	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS02109
Kollajenaz Tip II	Worthington Biyokimya A.Ş. / Fisher	LS004176
Gliserol	Fisher	BP381-1
Igepal	Sigma	I3021-50 ml
Fosfataz inhibitör kokteyli	Sigma	P0044-1ml
Proteaz inhibitör kokteyli	Sigma	P8340-1 ml
Heparin	Sigma	H3149-100KU
FBS	Fisher/Mediatech	MT35010CV
D-Valine	Sigma	V1255-5G
EGS	Corning	356006
Penisilin/Streptomisin	Fisher/Mediatech	MT-30-002-CI