Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Karaciğer ana parankimal hücre tipi olan hepatosit ^1, dikkate değer yenilenmesi kapasitesine rağmen, kronik karaciğer yetmezliği, hepatik progenitör hücre (HPC) bağlı yenilenme ² giden, bu yeteneği bozar.

Kronik karaciğer hasarı özellikle alkol bağımlılığı, kronik hepatit C virüsü (HCV) enfeksiyonu ³ ve non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAYKH) ⁴ türetilmiştir. Bu hücre-dışı matrisi (ECM) proteinlerin birikmesiyle ilişkilidir sürekli karaciğer fibrozu, yol açar. Kalıcı ECM ​​birikimi sonradan yüksek morbidite ve mortalite ile siroz sonuçlanan bir fibröz skar dokusu ⁵ oluşturarak sağlam karaciğer mimarisi bozan. Birçok girişim profibrojenik sitokinler ve aktif miyofibroblastlar ⁶ inhibe odaklanarak esas fibrotik tepkisini azaltmak için yapılmıştır. İkinci temel olarak H (gelmiş hepatik yıldız şeklinde hücreler elde edilirSC'ler), karaciğer skar oluşumu ⁴ sorumlu prensip karaciğer olmayan parankimal hücreler. Bununla birlikte, sürekli fibrojenik hakaret varlığında hepatosit yeniden oluşturmak için HPC dahil endojen hücre kaynakları teşvik rejeneratif tedaviler daha ileri araştırmayı bekliyor.

karaciğer fibrozu birçok deneysel modeller, memelilerde tarif edilmiştir. Karbon tetraklorür _(CCI4) tekrarlanan enjeksiyonu yaygın kemirgen ve sıçan modellerinde ⁷ karaciğer fibrozu uyarılması için kullanılmıştır. Yüksek yağ (HF) diyet ile birlikte alkol profibrojenik gen ekspresyonu ve karaciğer fibrozu ⁸ önemli bir artışıyla yol açmıştır. Steatoz (lipid birikimi), akut alkol maruz kalma sonuçları olsa da, daha ciddi karaciğer hasarı ⁹ duyarlı karaciğer yapar.

Zebra balığı, Danio rerio, yenilenmeyi incelerken için paha biçilmez bir omurgalı model sistem olarak ortaya çıkmıştır. gerçiBu tür semenderler ve axolotls gibi diğer alt omurgalıların Zebra balığı potansiyel rejeneratif işlemek için gerekli olan gen manipülasyonu ve görselleştirme stratejileri açısından diğer model sistemleri üzerinde avantajlara sahiptir ¹⁰ faktörleri, rejenerasyon için olağanüstü bir kapasiteye sahip. Zebra balığı da sadece kendi su etanol (EtOH) ekleyerek alkolik karaciğer hastalığı (ALD) eğitimi için cazip bir omurgalı modeli temsil etmektedir. Larva ve yetişkin zebrabalıkları Akut EtOH maruz hepatik steatoz ^11-13 neden oldu. Yetişkin zebrabalıkları genişletilmiş EtOH maruz aldığında, kollajen depozisyon fibroz ile ilişkili genlerin ¹⁴ yukarı doğru düzenleme gözlenmiştir. Bununla birlikte, bir ihtiyaç fibrojenik uyarıcı olarak EtOH yanıt olarak karaciğer rejenerasyonu çalışma modellerin geliştirilmesi için bulunmaktadır.

Son zamanlarda, Zebra balığı ¹⁵ bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modeli geliştirmiştir. Biz larva ve Adul EtOH tedavi ile hepatosit özgü genetik ablasyon sistemi kombinet zebra balığı. İki transjenik satır oluşturulur, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^gt1 ve TG (fabp10a: mCherry NTR) ^GT2 E.coli nitroredüktaz (NTR) kontrolü altında, sırasıyla, mavi ve MCherry floresan protein, kaynaşık olduğu protein 10a, karaciğer bazik (fabp10a) promotör bağlanma hepatosit özel yağlı asit. Bu sistemde, NTR hepatositlerin açık ölümünü teşvik bir DNA arası şerit çapraz bağlama maddesi ¹⁶ bir toksik olmayan bir ön ilacı metronidazol (MTZ) dönüştürür. Bu modeli kullanarak, Çentik sinyallemesinin cevap veren karaciğer hücrelerinin bir popülasyonu, hepatositlerin civarındaki yokluğunda ECM fazla hepatositlere dönüştürülmüş olduğunu göstermiştir. Bu HPC olarak bu hücreleri belirlenmiş. Ayrıca, kimyasal ekranlar aracılığıyla, biz fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu artırmak küçük moleküllü Wnt sinyal aktivatörleri ve Notch sinyalizasyon inhibitörleri belirledi. therefoyeniden, Zebra balığı bizim fibrotik karaciğer modeli hücre Kültürü- ya da memeli tabanlı tarama sistemi ile karşılaştırıldığında mükemmel bir kimyasal tarama sistemini temsil etmektedir. Bu önemli maliyet ve zaman tasarrufu yararları ile in vivo sistemdir. Burada bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modeli oluşturmak için ve zebrafish bu model kullanılarak kimyasal ekranları gerçekleştirmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. Ayrıca, zaman ders analizleri fibrotik karaciğerde gerçekleşir nasıl hepatosit rejenerasyon araştırmak için yapılmıştır. Bu protokol mekanizmaları ve fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu sağlamak stratejilerini incelemek için paha biçilmez bir araç sağlayacaktır.

Zebra balığı kaldırdı ve Teknoloji Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Georgia Institute of tarafından onaylanan Ulusal Sağlık Enstitüleri ve ölçütlerini karşılayan standart bir protokol kullanılarak yetiştirilmiş.

Çözümler 1. hazırlanması

1. embriyonik / larva zebrafish korumak için (dönüşümlü 'embriyonun orta' ile kullanılır) 20 L yumurta suyu hazırlayın. Damıtılmış su, 250 ml 1.5 gr CaSO ₄ ve 6 gr anında okyanus deniz tuzu çözülür. 20 L distile su ve ajitasyon dolu bir damacana içine dökün.
2. 1 L 'nin Hazırlanması 1-fenil-2-tioüre (PTU) stok çözeltisi (20x). 1 L damıtılmış su içinde 0.6 g PTU toz eritilir. bir çalışma çözeltisi olarak% 0.003 arasında nihai bir konsantrasyona kadar 20 mi embriyo orta ortalama stok çözeltisi 1 ml.
   DİKKAT: PTU Teneffüs veya dermal maruziyeti takiben sistemik toksisite neden olabilir. Hazırlayın ve uygun taşıma kurallarına uygun olarak kullanın.
3. 1 L etil 3-aminobenzamid hazırlanmasınzoate metansülfonat (Tricaine) stok çözeltisi (20x). damıtılmış su içinde 4 g Tricaine toz eritilir. 1 M Tris tamponu (pH 9) ilave edilerek pH 7'ye ayarlamak, ve damıtılmış su ile 1 L son hacim getir. -20 ° C'de 50 ml kısım ve mağaza. Kullanmadan önce çözülme.
   DİKKAT: Tricaine duyu kaybına yol açabilir. Hazırlayın ve uygun taşıma kurallarına uygun olarak kullanın.
4. 100 ml larva metronidazol (MTZ) çalışma çözeltisi hazırlayın. 100 mi embriyo ortamda% 0.1 dimetil sülfoksit içinde (DMSO) 0.25 gr MTZ tozunun çözülmesiyle taze 15 mM MTZ çözeltisi olun. dinç sallayarak tamamen MTZ tozu eritin. Taze MTZ çözüm yapmak ve MTZ fotokatalitik bozulmasını önlemek için alüminyum folyo kullanın.
   DİKKAT: MTZ tahrişe neden olabilir. Hazırlayın ve uygun taşıma kurallarına uygun olarak kullanın.
5. 100 ml larva etanol / metronidazol (EtOH / MTZ) çalışma çözeltisi hazırlayın. Taze MTZ çözüm yapmak ve fotokatalitik DE önlemek için alüminyum folyo kullanınMTZ derece. Kullanımdan hemen önce% 1.5 bir son konsantrasyona kadar, 100 ml MTZ çözeltisi içine 1.5 ml% 100 etanol ilave edin.
6. 500 ml yetişkin MTZ çalışma çözeltisi hazırlayın. 500 mi sistemi su içinde% 0.1 DMSO içinde 0.83 g MTZ tozunun çözülmesiyle taze 10 mM MTZ çözeltisi olun. dinç sallayarak tamamen MTZ tozu eritin. Taze MTZ çözüm yapmak ve MTZ fotokatalitik bozulmasını önlemek için alüminyum folyo kullanın.
7. 1 L PEM tampon hazırlayın. 30.2 g PIPES, 0.74 g EGTA ve 0.12 g damıtılmış su içinde MgSO ₄ eritin. NaOH ile pH 7 ayarlayın. damıtılmış su ile 1 L son hacim getirin.

Larva Zebra balığı 2. Hazırlık

1. [Tg (fabp10a: CFP-NTR) kadar ayarlayın çiftleşme ^GT1; Tg (Tp1: mCherry) ^jh11] Tg (Hand2: EGFP) ile ^15,17 yetişkin zebrafish çiftleşme tanklarda ¹³ yetişkin zebrafish ^{PD24 modeli.} zamanlanmış çiftleşme yapmak için bölücüler kullanın.
2. d kaldırve ertesi sabah ivider balık kesinti olmadan çiftleşmek için izin verir. 2 saat sonra sistem su süzme ve embriyo orta ile 100 mm Petri kapları içine embriyo transfer ederek Hasat embriyolar.
3. Petri kabı başına en fazla 100 embriyolar tutun. Bir stereomikroskop altında, bir cam pipet kullanarak döllenmemiş yumurta kaldırmak. 28 ° C 'de embriyolar büyümeye ve pigment gelişimini inhibe 10 saat sonrası gübreleme (HPF) sonra,% 0.003 arasında nihai bir konsantrasyona kadar feniltiyoüre (PTU) ekleyin.

Larva Zebra balığı 3. Etanol, Metronidazole Tedavi ve Karaciğer Rejenerasyon

1. % 1.5 oranında bir nihai konsantrasyona kadar embriyo ortamı içine etanol ekleyerek, taze EtOH çözeltisi hazırlayın. PTU katmayın.
2. 56 80 hpf Petri kabı başına 20 ml etanol çözeltisi ile embriyolar davranın. Etanol buharlaşmasını önlemek için naylon ile Petri kapları örtün.
3. Sıralama dışarı [Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^GT1; Tg (Tp1: mCherry) ^jh11 sup>; Tg (Hand2: EGFP) 80 hpf CFP denklem ile tespit edilen benzer karaciğer boyutu ^{PD24 modeli]} larva. EtOH-tedavi larvaları sıralarken bu sonraki EtOH / MTZ tedavi ile yüksek mortalite oranına neden olur, çünkü Tricaine kullanmayın. Petri çanağı başına 30 embriyo yoğunluğunda sıralanmış larva tutun.
4. % 0.1 DMSO içinde embriyo orta taze 15 mM MTZ hazırlayın. % 1.5 oranında bir nihai konsantrasyon yapmak MTZ çözeltisine EtOH uygun miktarda ekleyin. 28 ° C'de 24 saat boyunca bir Petri tabağı başına 20 mi EtOH / MTZ çözelti içinde larva inkübe edin. ışıktan korumak için EtOH konsantrasyon ve alüminyum folyo ile korumak için naylon ile Petri kapları örtün.
5. Tedavi sonunda, taze embriyo ortam ile yeni bir Petri tabaklara larva aktarılarak EtOH / MTZ uzaklaştırın. embriyo orta ile larva 3 kere yıkayın ve PTU olmadan 20 ml embriyo ortamda saklayın.
6. floresan gözlemlemek, hepatositlerin tama yakın ablasyon ile larvaları dışarı sıralamak için80X bir büyütmede CFP filtreli bir epifluorışıma mikroskop altında. karaciğerde az OBP floresan Başarılı ablasyon sonuçları ve önemli ölçüde azalır karaciğer hacmi.
7. EtOH / MTZ-tedavi larva ölümü önlemek için, sıralama için Tricaine kullanmayın. immün için larva Fix (bölüm 5'e bakınız) ya da daha fazla analizler için 28 ° C'de Petri kutularına sıralanan larva tutun.

EtOH / MTZ-tedavi Larva Zebra balığı 4. Kimyasal Ekranlar

1. DMSO içinde 10 mM stok, kimyasal ihtiva eden 96 oyuklu plakalar getirmek ° C derin dondurucuda -80 (Ticari kimyasal kütüphanelerin ayrıntıları için Materyaller listesine bakınız). kimyasalların fotokatalitik bozulmasını önlemek için alüminyum folyo ile örtün. hafif sallama ile oda sıcaklığında stok solüsyonları çözülme.
2. 96 yuvalı plakalar içinde 50 uM (nihai konsantrasyona kadar embriyo ortamı ile 10 mM stok çözelti seyrelti kimyasal çözüm hazırlanması: İlk screen; 1.5 ml tüpler: yeniden test). Kontrol larvaları embriyo orta DMSO eşit konsantrasyonları ile muamele edildi.
3. ya da 96 gözlü (ilk ekran),% 1.5 EtOH / 15 mM MTZ ile muamele edilmiş ve yukarıda belirtildiği gibi kriteri edildi tama yakın hepatosit ablasyonu veya 24-iyi ile transfer larvaları (tekrar test) plakaları bir yoğunlukta embriyo orta ile doldurulmuş kuyu başına 5 larva. Her kimyasal için yinelenen kuyu kullanın.
4. Embriyo Ortamı çıkarın ve 250 ul (96 oyuklu plakalar) ya da her bir 500 ul (24-iyi levha) kimyasal çözeltiler ya ekleyin. alüminyum folyo ile kapak plakaları ve 28 ° C'de 50 saat boyunca larva davranın. günlük kimya-iliklerine larvaları kontrol edin ve bireysel kuyulardan herhangi bir ölü larva kaldırın.
5. kimyasal muamele sonunda 80x büyütmede CFP filtreli bir epifluorışıma mikroskop altında CFP eksprese eden hepatositlerin sayısını ve / veya yoğunluğunu dikkate alınmalıdır. Fotoğraf canlı larva gösteren gelişmiş veya azaltmakd numarası ve / veya kayıtları için bir dijital kamera ile CFP ifade eden hepatositlerin yoğunluğu.
6. 5. bölümünde açıklandığı gibi konfokal görüntüleme için formaldehit fiksasyon larvaları koruyun.
7. Başlangıç ​​ekranında hepatosit rejenerasyonu kolaylaştırmak kimyasallar yeniden test etmek, 4,1-4,5 ( 'yeniden test') 'de açıklanan prosedürlere en etkili konsantrasyonunu bulmak için yüksek ve düşük konsantrasyonlarda kendi gücünü incelemek.

5. Larva Zebra balığı Fixation, immün ve Konfokal Görüntüleme

1. % 0.02 nihai konsantrasyona Tricaine ekleyerek larvaları anestezisi. 1.5 ml tüp 10-15 larva transferi ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez yıkanır. PBS çıkarın ve 4 ° C'de O / N düzeltmek için PEM tamponu içinde taze hazırlanmış% 2 formaldehid 1 ml.
   DİKKAT: Formaldehit tahriş olmasına neden olur ve bir insan kanserojen olduğu bilinmektedir. Kimyasal bir davlumbaz olarak taşıyınız.
2. wa düzgün ve daha sonra çözüm sabitleme atınOda sıcaklığında PBS ile SH 3 kez. Sabit larvalar birkaç güne kadar 4 ° C 'de PBS içinde tutulabilir. Bir sonraki adıma geçmeden hemen daha iyi immün sonuç verir.
3. Dikkatlice stereomikroskop altında bir 55. forseps kullanarak karaciğer alanı kaplayan sarısı ve cilt kaldırmak.
4. Permeabilize ve Blok tamponu blok larvaları (% 4 sığır serum albümini ve% 0.3 PBS içinde Triton X-100), O / N 4 ° C'de.
5. 1 bir seyreltme tavşan anti-kollajen I antikor ile inkübe: 100 Blok tamponu O'da / N 4 ° C'de. Yıkama tamponu (PBS içinde% 0.3 Triton X-100) her biri 15 dakika için 5 kez yıkayın.
6. 1 bir seyreltmede AlexaFluor 647 konjüge edilmiş eşek anti-tavşan antikoru inkübe: 200 Blok tamponu O'da / N 4 ° C'de. Yıkama tamponu, 15 dakika için her 5 kez yıkayın. Daha sonra bir kez PBS ile yıkayın.
7. Yavaşça sol lateral yüzü yukarı bakacak şekilde bir cam pipet ve yönlendirmek sabit larvaları kullanılarak cam slaytlar larva transferi. Aşırı PBS kullanarak Kimwipes çıkarın. montaj medya bir damla ekleyinoje ile ve mühür cam kapak. İletken konfokal görüntüleme hemen büyük ölçüde tavsiye edilir.
8. görüntü yakalamak için 40X / 1.3 yağ lens ile donatılmış bir konfokal sistemi kullanın. % 20-50 lazer gücünü kullanın. 1 mikron aralıklarla Z yığın görüntüleri yakalayabilir.

Yetişkin Zebra balığı 6. hazırlanması

1. [Tg (fabp10a: CFP-NTR) kadar ayarlayın çiftleşme ^GT1; Tg: çiftleşme tanklarda (Tp1 mCherry) ^{jh11] 15,17} yetişkin zebrabalıkları. Hasat sistem suyu süzme ve embriyo orta ile 100 mm Petri kapları içine embriyo transferi ile ertesi sabah embriyolar.
2. Petri kabı başına en fazla 100 embriyolar tutun. Bir stereomikroskop altında, bir cam pipet kullanarak döllenmemiş yumurta kaldırmak. 28 ° C 'de embriyolar büyümeye ve pigment gelişimini inhibe 10 HPF sonra% 0.003 arasında nihai bir konsantrasyona kadar PTU ekleyin.
3. 4 dpf'e, larvaları uyutmak ve sıralamak için Tricaine kullanın [Tg (fabp10a: CFP-NTR)^GT1; Tg (Tp1: mCherry) ^jh11] larva. taze embriyo orta birkaç kez değiştirerek Tricaine yıkayın. Onlar dakikada ¹⁸ başına 120-180 atım normal kalp hızı elde edene kadar larva 28 ° C'de kurtarmak için izin verin.
4. Standart prosedür ¹⁹ dayalı 6-12 aylık sınıflarına larva kaldırın.

Yetişkin Zebra balığı 7. Etanol, metronidazol tedavisi ve Karaciğer Rejenerasyon

1. 6-12 aylık [Tg (fabp10a: CFP-NTR) transfer ^GT1; Tg: Bir net kullanarak çiftleşme tanklara (Tp1 mCherry) ^jh11] yetişkin zebrabalıkları. tank başına en fazla 10 balık bir yoğunlukta balık tutmak.
2. % 1 bir son konsantrasyona sistemi su EtOH eklenerek taze bir EtOH çözeltisi hazırlayın. Her tankta 500 ml EtOH solüsyonu ile erişkin balık davranın ve bir 28 ° C inkübatör onları korumak.
3. günlük taze EtOH çözeltisi Transfer yetişkin balık, ıskarta ölü balık pervanebiyolojik tehlike olarak Erly. Sürekli MTZ tedavisinden önce 72 saat boyunca hayvanları tedavi.
4. % 0.1 DMSO içinde sistemi su taze 10 mM MTZ çözeltisi hazırlayın. 28 ° C inkübatör MTZ çözeltisi önceden ısıtın. 28 ° C 'de 8 saat süre ile 1 L'geçişi tankında 500 mi MTZ çözeltisi ile balık tedavi alüminyum folyo ile ışıktan koruyunuz.
5. tedavi sırasında saatlik gözlemleyin ve derhal ölü balık kaldırın. biyolojik tehlike olarak düzgün ölü balık atın. MTZ Tedavi sonunda, iki sefer taze olarak sistem, su hayvanları aktarılarak MTZ yıkayın.
6. hayvanlar 28 ° C'de bir kuluçka kurtarmak ve onları korumak için izin verin. Yem ve analizler için zaman noktaya kadar günlük taze sistem su balık transferi.

8. Yetişkin Zebra balığı Karaciğer Fixation, immün ve Konfokal Görüntüleme

1. % 0.02 Tricaine yetişkin balık anestezisi ve 15 dakika buzlu su içinde euthanize. Pat balık kağıt havlu üzerinde kuru ve diseksiyon mat üzerine yerleştirin.
2. Daha önce olduğu gibi cilt ve kasların kaldırarak gastrointestinal organları Açığa ²⁰ nitelendirdi. anal yüzgeç geri posteriora balık kenarı boyunca sonra operculum'un anal yüzgeç gelen karın boyunca cilt ve altta yatan kas kesmek için makas kullanın ve.
3. 15 ml konik tüp içinde balık koymak ve bir kez PBS ile yıkayın. PBS çıkarın ve 4 ° C'de O / N düzeltmek için PEM tamponu içinde taze hazırlanmış% 2 formaldehid 4 ml.
4. düzgün bir çözelti sabitleme atın ve oda sıcaklığında 3 kez PBS ile yıkayın. Sabit örnekler birkaç gün 4 ° C'de PBS içinde tutulabilir. Bir sonraki adıma geçmeden hemen daha iyi immün sonuç verir.
5. özofagus keserek balıkların vücut boşluğunda karaciğer ile tüm gut teşrih. % 4 bir kesit kalıpta agaroz düşük erime gastrointestinal organlar gömün.
6. Ön ucundan başlayarak, buz gibi soğuk PBS 50 um aralıklarla enlemesine bölüme numunelerin kesilmesi için bir vibratome kullanın. sn transfer# 1 boya fırçası kullanılarak PBS ile 6 oyuklu plaka leri.
7. Permeabilize ve Blok tamponu O blok bölümleri / N 4 ° C'de.
8. 1 bir seyreltme tavşan anti-kollajen I antikor ile inkübe: 100 Blok tamponu O'da / N 4 ° C'de. 5 kez, 15 dakika yıkama tamponu ile her bir yıkama.
9. 1 bir seyreltmede AlexaFluor 647 konjüge edilmiş eşek anti-tavşan antikoru inkübe: 200 Blok tamponu O'da / N 4 ° C'de. Yıkama tamponu ile ve bir kez PBS ile 5 kez, her biri 15 dakika yıkanır.
10. Yavaşça 1. boya fırçası kullanarak cam slaytlar bölümleri aktarmak. , Kimwipes kullanarak aşırı PBS kaldırmak montaj medya bir damla ekleyin ve oje ile mühür cam kapak. İletken konfokal görüntüleme hemen şiddetle önerilir.
11. görüntü yakalamak için 40X / 1.3 yağ lens ile donatılmış bir konfokal sistemi kullanın. % 20-50 lazer gücünü kullanın. 1 mikron aralıklarla Z yığın görüntüleri yakalayabilir.

Şekil 1 larva zebrafish bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modelinin gelişimini gösterir. EtOH için Zebra balığı larvaları sergilemek için bir protokol optimize etmek için, öncelikle EtOH toksisitesini değerlendirildi. 2,5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) larvaları eşzamanlı 24 saat EtOH / MTZ muamele edilir, 24 saat için EtOH konsantrasyonu% 1,% 1.5 ya da% 2 maruz bırakıldı. Neredeyse bütün larvalar kolajen gibi hücre dışı matris proteinleri nadir birikimi ile az fibrojenik değişiklikler gösterdi% 1 EtOH ya da daha az maruz kalan ise% 2 EtOH maruz yüksek ölüm oranına sebep olmuştur. Bu sonuçlara göre, larva 24 saat (2.5-3.5 dpf) ve daha sonra eş zamanlı olarak 24 saat (3.5-4.5 dpf) (Şekil 1A) MTZ ile muamele% 1.5 EtOH ile önceden muamele edilmiştir. EtOH / MTZ-tedavi larva gövde ve kuyruk yukarı eğrilik, perikardiyal ödem ve yüzmek mesane şişirmek için yetmezliği dahil morfolojik anormallik saptanmadı. (Şekil 1B). Biz1) Tg (fabp10a: EtOH / MTZ-tedavi larva karaciğerlerinde fibrojenik değişiklikleri analiz etmek için üç transgenik hatları kullanılır CFP-NTR) GT1 hat hepatosit özgü fabp10a promotör 15 altında mavi floresan proteini ile kaynaşmış NTR geni ifade eder; 2) Tg (Tp1: mCherry) jh11 hattı birden RBP- ihtiva TP1 modülünün kontrolü altında ekspresyonları, nükleer mCherry 17 aktif Çentik sinyallemesi (Çentik cevap veren hücrelerin, URM'ler) ya da safra epitel hücreleri (BECS) ile hücrelerin işaretler sitesi jK-bağlanması; ve 3) Tg (Hand2: Karaciğer yıldızsı hücreleri (HKH'lerin) 13 etiketler EGFP) PD24 modeli hattı. DMSO ile tedavi edilen kontrol [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 Tg (Hand2: EGFP) PD24 modeli] karaciğerleri Ben, birikimi 4,6,9 (Şekil 1C, C ') kolajen hiçbir fibriler tipi gösterdi EtOH / MT iseZ-tedavi karaciğerler Ben 25 ve 50 saat-sonrası ablasyon (hpa) (Şekil 1D, D ', E, E') de birikimini kollajen yüksek tip görüntülenir. Buna ek olarak, DMSO ile tedavi edilen kontrol karaciğer (Şekil 1C '') ile karşılaştırıldığında, HSCler EtOH / MTZ tedavi edilen rejenere karaciğer kayıp sitoplazmik süreçler (bir miyofibroblast benzeri şekle yıldız şeklinde yapılandırma değişen morfoloji ile orantılı artış Şekil 1D ', E' '). Biz EtOH / MTZ-tedavi yenileyici karaciğerinde 25 hpa de mCherry ifade URM'leri iki ayrı popülasyonları gözlenen: kırmızı URM'leri (Şekil 1D '', gömme, beyaz oklar) ve parlak kırmızı URM'leri (Şekil 1D '' dim, ek sarı ok başları). 50 hPa hepatosit özgü CFP yenileyici karaciğerinden (Şekil 1E '', içerlek, beyaz oklar) boyunca loş MCherry ifadesi URM'leri in-express birlikte başladı. Bunlar OBP ve loş mCherry coexpressing URM'ler CFP (Şekil 1E '', gömme, sarı ok başları) için negatif olan parlak kırmızı URM'nden açıkça ayırt edilebilir. Önceki çalışmalar hepatosit çoğalması kısmi hepatektominin (PHX) sonra bastırıldı zaman, HPC HSC 21 eş zamanlı çoğalması ile genişletilmiş olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, HPC ve BECS histokimyasal işaretleri 22 ortak. Dolayısıyla, sonuçları OBP ve loş mCherry birlikte ifade URM'ler Notch infekte karşılaşmak tarafından hepatositlerin içine ayırt HPC bir zebrafish-meslektaşı tasvir olduğunu göstermektedir. Notch sinyalizasyon yüksek seviyede muhafaza URM'ler BECS 23 diferansiye cholangiocytes olarak kalabilir.

Şekil 2 yetişkin zebrafish bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modelinin gelişimini gösterir. İlk olarak, uygulanabilirliğini değerlendirmek için EtOH% 1,% 1.5 ya da% 2 yetişkin zebrafish maruz bırakılmıştır. Çoğu yetişkin zebrabalıkları n yaptımot EtOH konsantrasyonlarda maruz fazla% 1 (yayınlanmamış veri) fazla 72 saat hayatta. Bu nedenle, yetişkin zebrabalıkları sağlamak için, 72 saat süreyle% 1 EtOH ile balık işlemden geçirilmiş ve MTZ tedavisi (Şekil 2A) ile devam etti. Zaman kurs analizleri yaparak, biz 2, 3, EtOH / MTZ-tedavi yenileyici karaciğerlerinde birikimi kolajen ve önemli ölçüde artmış tip gösterdi 4 gün-sonrası ablasyon (dpa) (Şekil 2C 'D', E ') DMSO ile tedavi edilen karaciğer (Şekil 2B ') ile karşılaştırıldığında. Larvalarda gözlenene benzer, CFP ve loş MCherry ko-eksprese eden hücreler 12 aylık [Tg (fabp10a: CFP-NTR) EtOH / MTZ ile muamele rejenere karaciğerinde tespit edilmiştir gt1; Tg (Tp1: mCherry) 3 ve 4 dpa (Şekil 2B, E, takmalar, beyaz oklar) jh11] yetişkin balık. Bu veriler duyarlı HPC, sinyalizasyon Notch hepatositlerde olarak yeniden kapasitelerini korumak için olduğunu göstermektedirYetişkin Zebra balığı fibrojenik hakaret varlığı.

Şekil 3, larva zebrabalıkları eden etanol ile indüklenen fibrotik karaciğer modeli kullanılarak Örnek kimyasal tarama sonuçlarını göstermektedir. fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu hızlandırmak biyoaktif bileşiklerin tespit etmek için, biz kimyasal, genetik ekranlar gerçekleştirdi. Biz iyi karakterize biyolojik ve farmakolojik faaliyetleri (Bileşik Library Sinyal Selleckchem Kök Hücre) ve [Tg (fabp10a kullanarak 1.000 az karakterize küçük moleküller (ActiProbe-1K Kütüphane, TimTec) bir kütüphane ile 75 küçük moleküllerin bir kütüphane ekranlı: CFP -NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] larva. Bu% 1.5 EtOH / 15 mM MTZ mevcudiyetinde hepatositleri ablasyon ve daha sonra 50 saat (Şekil 3A) bileşiklerin 50 uM larva maruz bırakılmıştır. SB 415286 ve CHIR-990 olarak Wnt agonistler bir dizi21, glikojen sentaz kinaz-3, tanıtılan hepatosit rejenerasyon DMSO (Şekil 3b) göre (Şekil 3C, D) önleyicileri. Bundan başka, [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-il) -1,2,5-oksadiazol sağladı-3-ilamin] HTOA, yeni bir Wnt yolu etkinleştirici olarak kısaltılır, geliştirilmiş hepatosit yenilenmesi bölgesindeki Daha büyük rejenere karaciğer (Şekil 3E) ile gösterildiği gibi fibrotik karaciğer. Bu veriler, bizim sürekli fibrotik modeli hepatosit rejenerasyonu arttırmak küçük moleküller keşfetmek için paha biçilmez bir araç sağladığını göstermektedir.

Larva zebrafish bir etanol-kaynaklı fibrotik karaciğer modeli Şekil 1. geliştirilmesi. (A) Şema larvaları bir fibrotik karaciğer modeli kurulması için EtOH ve EtOH / MTZ tedavi dönemleri gösteren. 50 saat-sonrası ablasyon (hPa) (B), EtOH / MTZ-muamele lARVAL Zebra balığı gövde ve kuyruk yukarı eğrilik, perikardiyal ödem ve yüzmek mesane şişirmek için yetmezliği dahil morfolojik anormallikler geliştirdi. [Tg karaciğerinin ise (CC '') (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 Tg (Hand2: EGFP), DMSO ile muamele edilmiş PD24 modeli] larva ECM proteini kollajen 1a (C, C ') neredeyse mümkün olduğunu ve sakin HSC hücreleri (C yıldız şeklinde bir konfigürasyonu gösteren' ise ') hepatositlerde (C, C '', içerlek) arasında dağıtılır URM'ler. (DE '' ') (E, E' EtOH / MTZ ile tedavi edilen larvalar karaciğerlerinde, yüksek kollajen 1a yerleştirme D, D) gözlenmiştir. ' HKH'lerin sayısı artmış ve karmaşık sitoplazmik süreçleri (D ', E' ') kaybetti. 25 hPa, mCherry ifade URM'ler iki farklı nüfus oluşur. '(' ', Içerlek beyaz oklar loş kırmızı URM'leri D) işaret ise (ek Sarı ok başları parlak kırmızı URM'leri D' ')' gösterir. 50 hPa, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ve Tg (Tp1: mCherry) parlak kırmızı URM'ler hiçbir OBP ifadesini varken birlikte ifade eden hücreler, yenileyici karaciğerinden (E '', gömme, beyaz oklar) boyunca ortaya çıkan başladı (E '', gömme, sarı ok başları). Tüm konfokal görüntüleri projeksiyon görüntüleri C ', D', E 'dışında tek düzlem görüntüleri vardır. Ölçek çubukları: B, 100 mikron; CE '', 20 mikron. EtOH, etanol; MTZ, metronidazol; hpa, saat-post-ablasyon; dpf, günler-sonrası fertilizasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu ekran için Şekil larva Zebra balığı etanol kaynaklı fibrotik karaciğer modeli kullanılarak 3. Temsilcisi kimyasal tarama sonuçları. (A) Şema. Bilinen ve yeni Wnt (BE)aktivatörleri fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu artırmak. DMSO (B), SB415286 (C), CHIR-99.021 ile (tatbik edilmiştir larva:;: [jh11 Tg (MCherry TP1) gt1 Tg (CFP-NTR fabp10a)], EtOH / MTZ ile muamele edilmiş karaciğerinin Konfokal projeksiyonlar D) ya da HTOA olarak kısaltılır yeni bir Wnt aktivatör [4- (1 H-1,2,3,4-tetraazol-5-il) -1,2,5-oksadiazol sağladı-3-ilamin] (f) (E). SB415286 ve CHIR-99.021 sintaz kinaz-3 inhibitörleri glikojen edilmiştir. Tüm görüntüler konfokal projeksiyon görüntüleri bulunmaktadır. Ölçek çubuğu, 20 mikron. EtOH, etanol; MTZ, metronidazol; hpa, saat-post-ablasyon; dpf, günler-sonrası fertilizasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.