Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

8.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54002

⸱

13 Mayıs 2016

 ,  , 
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Aşırı ekstraselüler matriks proteinlerinin birikmesi ile sürekli fibroz siroza yol açar. Alkol kötüye kullanımı, ciddi karaciğer hastalığının ana nedenlerinden biridir. Alkolün neden olduğu yaralanma üzerine hepatosit rejenerasyonunu teşvik etme mekanizmalarını ve stratejilerini incelemek için etanolün neden olduğu bir zebra balığı fibrotik karaciğer modeli oluşturduk.

Özet

Hücre dışı matriks (ECM) protein birikiminin devam etmesi ile sürekli karaciğer fibrozu, karaciğerin hücresel yeterliliğini kaybetmesine neden olarak hepatosellüler disfonksiyon ile siroza yol açar. Birden fazla karaciğer hakaretleri arasında, alkol kötüye kullanımı karaciğer yetmezliği ve hepatosellüler karsinom gibi önemli sağlık sorunlarına yol açabilir. Bununla birlikte, alkole yanıt olarak hepatositleri rejenere eden endojen hücresel kaynakların kimliği düzgün bir şekilde araştırılmamıştır. Ayrıca, az sayıda çalışma, alkolün neden olduğu yaralanma üzerine hepatosit rejenerasyonunu etkili bir şekilde modellemiştir. Yakın zamanda, zebra balığında hepatik progenitör hücrelerin (HPC'ler) fibrojenik uyaran varlığında neredeyse tam hepatosit kaybı üzerine hepatositlere yol açtığı etanol (EtOH) ile indüklenen bir fibrotik karaciğer modeli oluşturmayı bildirdik. Ayrıca, bu modeli kullanan kimyasal ekranlar aracılığıyla, hepatosit rejenerasyonunu artıran çok sayıda küçük molekül belirledik. Burada, EtOH ile indüklenen bir fibrotik karaciğer modeli geliştirme ve bu modeli zebra balıklarında kullanarak kimyasal taramalar yapma prosedürlerini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu protokol, hepatositin fibrotik karaciğerde nasıl rejenere olduğunun moleküler ve hücresel mekanizmalarını tanımlamak için kritik bir araç olacaktır. Ayrıca, bu yöntemler in vivo kronik karaciğer hastalığı için yeni terapötik stratejilerin potansiyel keşfini kolaylaştıracaktır.

Giriş

Karaciğer ana parankimal hücre tipi olan hepatosit 1, dikkate değer yenilenmesi kapasitesine rağmen, kronik karaciğer yetmezliği, hepatik progenitör hücre (HPC) bağlı yenilenme 2 giden, bu yeteneği bozar.

Kronik karaciğer hasarı özellikle alkol bağımlılığı, kronik hepatit C virüsü (HCV) enfeksiyonu 3 ve non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAYKH) 4 türetilmiştir. Bu hücre-dışı matrisi (ECM) proteinlerin birikmesiyle ilişkilidir sürekli karaciğer fibrozu, yol açar. Kalıcı ECM ​​birikimi sonradan yüksek morbidite ve mortalite ile siroz sonuçlanan bir fibröz skar dokusu 5 oluşturarak sağlam karaciğer mimarisi bozan. Birçok girişim profibrojenik sitokinler ve aktif miyofibroblastlar 6 inhibe odaklanarak esas fibrotik tepkisini azaltmak için yapılmıştır. İkinci temel olarak H (gelmiş hepatik yıldız şeklinde hücreler elde edilirSC'ler), karaciğer skar oluşumu 4 sorumlu prensip karaciğer olmayan parankimal hücreler. Bununla birlikte, sürekli fibrojenik hakaret varlığında hepatosit yeniden oluşturmak için HPC dahil endojen hücre kaynakları teşvik rejeneratif tedaviler daha ileri araştırmayı bekliyor.

karaciğer fibrozu birçok deneysel modeller, memelilerde tarif edilmiştir. Karbon tetraklorür (CCI4) tekrarlanan enjeksiyonu yaygın kemirgen ve sıçan modellerinde 7 karaciğer fibrozu uyarılması için kullanılmıştır. Yüksek yağ (HF) diyet ile birlikte alkol profibrojenik gen ekspresyonu ve karaciğer fibrozu 8 önemli bir artışıyla yol açmıştır. Steatoz (lipid birikimi), akut alkol maruz kalma sonuçları olsa da, daha ciddi karaciğer hasarı 9 duyarlı karaciğer yapar.

Zebra balığı, Danio rerio, yenilenmeyi incelerken için paha biçilmez bir omurgalı model sistem olarak ortaya çıkmıştır. gerçiBu tür semenderler ve axolotls gibi diğer alt omurgalıların Zebra balığı potansiyel rejeneratif işlemek için gerekli olan gen manipülasyonu ve görselleştirme stratejileri açısından diğer model sistemleri üzerinde avantajlara sahiptir 10 faktörleri, rejenerasyon için olağanüstü bir kapasiteye sahip. Zebra balığı da sadece kendi su etanol (EtOH) ekleyerek alkolik karaciğer hastalığı (ALD) eğitimi için cazip bir omurgalı modeli temsil etmektedir. Larva ve yetişkin zebrabalıkları Akut EtOH maruz hepatik steatoz 11-13 neden oldu. Yetişkin zebrabalıkları genişletilmiş EtOH maruz aldığında, kollajen depozisyon fibroz ile ilişkili genlerin 14 yukarı doğru düzenleme gözlenmiştir. Bununla birlikte, bir ihtiyaç fibrojenik uyarıcı olarak EtOH yanıt olarak karaciğer rejenerasyonu çalışma modellerin geliştirilmesi için bulunmaktadır.

Son zamanlarda, Zebra balığı 15 bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modeli geliştirmiştir. Biz larva ve Adul EtOH tedavi ile hepatosit özgü genetik ablasyon sistemi kombinet zebra balığı. İki transjenik satır oluşturulur, Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1 ve TG (fabp10a: mCherry NTR) GT2 E.coli nitroredüktaz (NTR) kontrolü altında, sırasıyla, mavi ve MCherry floresan protein, kaynaşık olduğu protein 10a, karaciğer bazik (fabp10a) promotör bağlanma hepatosit özel yağlı asit. Bu sistemde, NTR hepatositlerin açık ölümünü teşvik bir DNA arası şerit çapraz bağlama maddesi 16 bir toksik olmayan bir ön ilacı metronidazol (MTZ) dönüştürür. Bu modeli kullanarak, Çentik sinyallemesinin cevap veren karaciğer hücrelerinin bir popülasyonu, hepatositlerin civarındaki yokluğunda ECM fazla hepatositlere dönüştürülmüş olduğunu göstermiştir. Bu HPC olarak bu hücreleri belirlenmiş. Ayrıca, kimyasal ekranlar aracılığıyla, biz fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu artırmak küçük moleküllü Wnt sinyal aktivatörleri ve Notch sinyalizasyon inhibitörleri belirledi. therefoyeniden, Zebra balığı bizim fibrotik karaciğer modeli hücre Kültürü- ya da memeli tabanlı tarama sistemi ile karşılaştırıldığında mükemmel bir kimyasal tarama sistemini temsil etmektedir. Bu önemli maliyet ve zaman tasarrufu yararları ile in vivo sistemdir. Burada bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modeli oluşturmak için ve zebrafish bu model kullanılarak kimyasal ekranları gerçekleştirmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. Ayrıca, zaman ders analizleri fibrotik karaciğerde gerçekleşir nasıl hepatosit rejenerasyon araştırmak için yapılmıştır. Bu protokol mekanizmaları ve fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu sağlamak stratejilerini incelemek için paha biçilmez bir araç sağlayacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Zebra balığı kaldırdı ve Teknoloji Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Georgia Institute of tarafından onaylanan Ulusal Sağlık Enstitüleri ve ölçütlerini karşılayan standart bir protokol kullanılarak yetiştirilmiş.

Çözümler 1. hazırlanması

  1. embriyonik / larva zebrafish korumak için (dönüşümlü 'embriyonun orta' ile kullanılır) 20 L yumurta suyu hazırlayın. Damıtılmış su, 250 ml 1.5 gr CaSO 4 ve 6 gr anında okyanus deniz tuzu çözülür. 20 L distile su ve ajitasyon dolu bir damacana içine dökün.
  2. 1 L 'nin Hazırlanması 1-fenil-2-tioüre (PTU) stok çözeltisi (20x). 1 L damıtılmış su içinde 0.6 g PTU toz eritilir. bir çalışma çözeltisi olarak% 0.003 arasında nihai bir konsantrasyona kadar 20 mi embriyo orta ortalama stok çözeltisi 1 ml.
    DİKKAT: PTU Teneffüs veya dermal maruziyeti takiben sistemik toksisite neden olabilir. Hazırlayın ve uygun taşıma kurallarına uygun olarak kullanın.
  3. 1 L etil 3-aminobenzamid hazırlanmasınzoate metansülfonat (Tricaine) stok çözeltisi (20x). damıtılmış su içinde 4 g Tricaine toz eritilir. 1 M Tris tamponu (pH 9) ilave edilerek pH 7'ye ayarlamak, ve damıtılmış su ile 1 L son hacim getir. -20 ° C'de 50 ml kısım ve mağaza. Kullanmadan önce çözülme.
    DİKKAT: Tricaine duyu kaybına yol açabilir. Hazırlayın ve uygun taşıma kurallarına uygun olarak kullanın.
  4. 100 ml larva metronidazol (MTZ) çalışma çözeltisi hazırlayın. 100 mi embriyo ortamda% 0.1 dimetil sülfoksit içinde (DMSO) 0.25 gr MTZ tozunun çözülmesiyle taze 15 mM MTZ çözeltisi olun. dinç sallayarak tamamen MTZ tozu eritin. Taze MTZ çözüm yapmak ve MTZ fotokatalitik bozulmasını önlemek için alüminyum folyo kullanın.
    DİKKAT: MTZ tahrişe neden olabilir. Hazırlayın ve uygun taşıma kurallarına uygun olarak kullanın.
  5. 100 ml larva etanol / metronidazol (EtOH / MTZ) çalışma çözeltisi hazırlayın. Taze MTZ çözüm yapmak ve fotokatalitik DE önlemek için alüminyum folyo kullanınMTZ derece. Kullanımdan hemen önce% 1.5 bir son konsantrasyona kadar, 100 ml MTZ çözeltisi içine 1.5 ml% 100 etanol ilave edin.
  6. 500 ml yetişkin MTZ çalışma çözeltisi hazırlayın. 500 mi sistemi su içinde% 0.1 DMSO içinde 0.83 g MTZ tozunun çözülmesiyle taze 10 mM MTZ çözeltisi olun. dinç sallayarak tamamen MTZ tozu eritin. Taze MTZ çözüm yapmak ve MTZ fotokatalitik bozulmasını önlemek için alüminyum folyo kullanın.
  7. 1 L PEM tampon hazırlayın. 30.2 g PIPES, 0.74 g EGTA ve 0.12 g damıtılmış su içinde MgSO 4 eritin. NaOH ile pH 7 ayarlayın. damıtılmış su ile 1 L son hacim getirin.

Larva Zebra balığı 2. Hazırlık

  1. [Tg (fabp10a: CFP-NTR) kadar ayarlayın çiftleşme GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] Tg (Hand2: EGFP) ile 15,17 yetişkin zebrafish çiftleşme tanklarda 13 yetişkin zebrafish PD24 modeli. zamanlanmış çiftleşme yapmak için bölücüler kullanın.
  2. d kaldırve ertesi sabah ivider balık kesinti olmadan çiftleşmek için izin verir. 2 saat sonra sistem su süzme ve embriyo orta ile 100 mm Petri kapları içine embriyo transfer ederek Hasat embriyolar.
  3. Petri kabı başına en fazla 100 embriyolar tutun. Bir stereomikroskop altında, bir cam pipet kullanarak döllenmemiş yumurta kaldırmak. 28 ° C 'de embriyolar büyümeye ve pigment gelişimini inhibe 10 saat sonrası gübreleme (HPF) sonra,% 0.003 arasında nihai bir konsantrasyona kadar feniltiyoüre (PTU) ekleyin.

Larva Zebra balığı 3. Etanol, Metronidazole Tedavi ve Karaciğer Rejenerasyon

  1. % 1.5 oranında bir nihai konsantrasyona kadar embriyo ortamı içine etanol ekleyerek, taze EtOH çözeltisi hazırlayın. PTU katmayın.
  2. 56 80 hpf Petri kabı başına 20 ml etanol çözeltisi ile embriyolar davranın. Etanol buharlaşmasını önlemek için naylon ile Petri kapları örtün.
  3. Sıralama dışarı [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 sup>; Tg (Hand2: EGFP) 80 hpf CFP denklem ile tespit edilen benzer karaciğer boyutu PD24 modeli] larva. EtOH-tedavi larvaları sıralarken bu sonraki EtOH / MTZ tedavi ile yüksek mortalite oranına neden olur, çünkü Tricaine kullanmayın. Petri çanağı başına 30 embriyo yoğunluğunda sıralanmış larva tutun.
  4. % 0.1 DMSO içinde embriyo orta taze 15 mM MTZ hazırlayın. % 1.5 oranında bir nihai konsantrasyon yapmak MTZ çözeltisine EtOH uygun miktarda ekleyin. 28 ° C'de 24 saat boyunca bir Petri tabağı başına 20 mi EtOH / MTZ çözelti içinde larva inkübe edin. ışıktan korumak için EtOH konsantrasyon ve alüminyum folyo ile korumak için naylon ile Petri kapları örtün.
  5. Tedavi sonunda, taze embriyo ortam ile yeni bir Petri tabaklara larva aktarılarak EtOH / MTZ uzaklaştırın. embriyo orta ile larva 3 kere yıkayın ve PTU olmadan 20 ml embriyo ortamda saklayın.
  6. floresan gözlemlemek, hepatositlerin tama yakın ablasyon ile larvaları dışarı sıralamak için80X bir büyütmede CFP filtreli bir epifluorışıma mikroskop altında. karaciğerde az OBP floresan Başarılı ablasyon sonuçları ve önemli ölçüde azalır karaciğer hacmi.
  7. EtOH / MTZ-tedavi larva ölümü önlemek için, sıralama için Tricaine kullanmayın. immün için larva Fix (bölüm 5'e bakınız) ya da daha fazla analizler için 28 ° C'de Petri kutularına sıralanan larva tutun.

EtOH / MTZ-tedavi Larva Zebra balığı 4. Kimyasal Ekranlar

  1. DMSO içinde 10 mM stok, kimyasal ihtiva eden 96 oyuklu plakalar getirmek ° C derin dondurucuda -80 (Ticari kimyasal kütüphanelerin ayrıntıları için Materyaller listesine bakınız). kimyasalların fotokatalitik bozulmasını önlemek için alüminyum folyo ile örtün. hafif sallama ile oda sıcaklığında stok solüsyonları çözülme.
  2. 96 yuvalı plakalar içinde 50 uM (nihai konsantrasyona kadar embriyo ortamı ile 10 mM stok çözelti seyrelti kimyasal çözüm hazırlanması: İlk screen; 1.5 ml tüpler: yeniden test). Kontrol larvaları embriyo orta DMSO eşit konsantrasyonları ile muamele edildi.
  3. ya da 96 gözlü (ilk ekran),% 1.5 EtOH / 15 mM MTZ ile muamele edilmiş ve yukarıda belirtildiği gibi kriteri edildi tama yakın hepatosit ablasyonu veya 24-iyi ile transfer larvaları (tekrar test) plakaları bir yoğunlukta embriyo orta ile doldurulmuş kuyu başına 5 larva. Her kimyasal için yinelenen kuyu kullanın.
  4. Embriyo Ortamı çıkarın ve 250 ul (96 oyuklu plakalar) ya da her bir 500 ul (24-iyi levha) kimyasal çözeltiler ya ekleyin. alüminyum folyo ile kapak plakaları ve 28 ° C'de 50 saat boyunca larva davranın. günlük kimya-iliklerine larvaları kontrol edin ve bireysel kuyulardan herhangi bir ölü larva kaldırın.
  5. kimyasal muamele sonunda 80x büyütmede CFP filtreli bir epifluorışıma mikroskop altında CFP eksprese eden hepatositlerin sayısını ve / veya yoğunluğunu dikkate alınmalıdır. Fotoğraf canlı larva gösteren gelişmiş veya azaltmakd numarası ve / veya kayıtları için bir dijital kamera ile CFP ifade eden hepatositlerin yoğunluğu.
  6. 5. bölümünde açıklandığı gibi konfokal görüntüleme için formaldehit fiksasyon larvaları koruyun.
  7. Başlangıç ​​ekranında hepatosit rejenerasyonu kolaylaştırmak kimyasallar yeniden test etmek, 4,1-4,5 ( 'yeniden test') 'de açıklanan prosedürlere en etkili konsantrasyonunu bulmak için yüksek ve düşük konsantrasyonlarda kendi gücünü incelemek.

5. Larva Zebra balığı Fixation, immün ve Konfokal Görüntüleme

  1. % 0.02 nihai konsantrasyona Tricaine ekleyerek larvaları anestezisi. 1.5 ml tüp 10-15 larva transferi ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez yıkanır. PBS çıkarın ve 4 ° C'de O / N düzeltmek için PEM tamponu içinde taze hazırlanmış% 2 formaldehid 1 ml.
    DİKKAT: Formaldehit tahriş olmasına neden olur ve bir insan kanserojen olduğu bilinmektedir. Kimyasal bir davlumbaz olarak taşıyınız.
  2. wa düzgün ve daha sonra çözüm sabitleme atınOda sıcaklığında PBS ile SH 3 kez. Sabit larvalar birkaç güne kadar 4 ° C 'de PBS içinde tutulabilir. Bir sonraki adıma geçmeden hemen daha iyi immün sonuç verir.
  3. Dikkatlice stereomikroskop altında bir 55. forseps kullanarak karaciğer alanı kaplayan sarısı ve cilt kaldırmak.
  4. Permeabilize ve Blok tamponu blok larvaları (% 4 sığır serum albümini ve% 0.3 PBS içinde Triton X-100), O / N 4 ° C'de.
  5. 1 bir seyreltme tavşan anti-kollajen I antikor ile inkübe: 100 Blok tamponu O'da / N 4 ° C'de. Yıkama tamponu (PBS içinde% 0.3 Triton X-100) her biri 15 dakika için 5 kez yıkayın.
  6. 1 bir seyreltmede AlexaFluor 647 konjüge edilmiş eşek anti-tavşan antikoru inkübe: 200 Blok tamponu O'da / N 4 ° C'de. Yıkama tamponu, 15 dakika için her 5 kez yıkayın. Daha sonra bir kez PBS ile yıkayın.
  7. Yavaşça sol lateral yüzü yukarı bakacak şekilde bir cam pipet ve yönlendirmek sabit larvaları kullanılarak cam slaytlar larva transferi. Aşırı PBS kullanarak Kimwipes çıkarın. montaj medya bir damla ekleyinoje ile ve mühür cam kapak. İletken konfokal görüntüleme hemen büyük ölçüde tavsiye edilir.
  8. görüntü yakalamak için 40X / 1.3 yağ lens ile donatılmış bir konfokal sistemi kullanın. % 20-50 lazer gücünü kullanın. 1 mikron aralıklarla Z yığın görüntüleri yakalayabilir.

Yetişkin Zebra balığı 6. hazırlanması

  1. [Tg (fabp10a: CFP-NTR) kadar ayarlayın çiftleşme GT1; Tg: çiftleşme tanklarda (Tp1 mCherry) jh11] 15,17 yetişkin zebrabalıkları. Hasat sistem suyu süzme ve embriyo orta ile 100 mm Petri kapları içine embriyo transferi ile ertesi sabah embriyolar.
  2. Petri kabı başına en fazla 100 embriyolar tutun. Bir stereomikroskop altında, bir cam pipet kullanarak döllenmemiş yumurta kaldırmak. 28 ° C 'de embriyolar büyümeye ve pigment gelişimini inhibe 10 HPF sonra% 0.003 arasında nihai bir konsantrasyona kadar PTU ekleyin.
  3. 4 dpf'e, larvaları uyutmak ve sıralamak için Tricaine kullanın [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] larva. taze embriyo orta birkaç kez değiştirerek Tricaine yıkayın. Onlar dakikada 18 başına 120-180 atım normal kalp hızı elde edene kadar larva 28 ° C'de kurtarmak için izin verin.
  4. Standart prosedür 19 dayalı 6-12 aylık sınıflarına larva kaldırın.

Yetişkin Zebra balığı 7. Etanol, metronidazol tedavisi ve Karaciğer Rejenerasyon

  1. 6-12 aylık [Tg (fabp10a: CFP-NTR) transfer GT1; Tg: Bir net kullanarak çiftleşme tanklara (Tp1 mCherry) jh11] yetişkin zebrabalıkları. tank başına en fazla 10 balık bir yoğunlukta balık tutmak.
  2. % 1 bir son konsantrasyona sistemi su EtOH eklenerek taze bir EtOH çözeltisi hazırlayın. Her tankta 500 ml EtOH solüsyonu ile erişkin balık davranın ve bir 28 ° C inkübatör onları korumak.
  3. günlük taze EtOH çözeltisi Transfer yetişkin balık, ıskarta ölü balık pervanebiyolojik tehlike olarak Erly. Sürekli MTZ tedavisinden önce 72 saat boyunca hayvanları tedavi.
  4. % 0.1 DMSO içinde sistemi su taze 10 mM MTZ çözeltisi hazırlayın. 28 ° C inkübatör MTZ çözeltisi önceden ısıtın. 28 ° C 'de 8 saat süre ile 1 L'geçişi tankında 500 mi MTZ çözeltisi ile balık tedavi alüminyum folyo ile ışıktan koruyunuz.
  5. tedavi sırasında saatlik gözlemleyin ve derhal ölü balık kaldırın. biyolojik tehlike olarak düzgün ölü balık atın. MTZ Tedavi sonunda, iki sefer taze olarak sistem, su hayvanları aktarılarak MTZ yıkayın.
  6. hayvanlar 28 ° C'de bir kuluçka kurtarmak ve onları korumak için izin verin. Yem ve analizler için zaman noktaya kadar günlük taze sistem su balık transferi.

8. Yetişkin Zebra balığı Karaciğer Fixation, immün ve Konfokal Görüntüleme

  1. % 0.02 Tricaine yetişkin balık anestezisi ve 15 dakika buzlu su içinde euthanize. Pat balık kağıt havlu üzerinde kuru ve diseksiyon mat üzerine yerleştirin.
  2. Daha önce olduğu gibi cilt ve kasların kaldırarak gastrointestinal organları Açığa 20 nitelendirdi. anal yüzgeç geri posteriora balık kenarı boyunca sonra operculum'un anal yüzgeç gelen karın boyunca cilt ve altta yatan kas kesmek için makas kullanın ve.
  3. 15 ml konik tüp içinde balık koymak ve bir kez PBS ile yıkayın. PBS çıkarın ve 4 ° C'de O / N düzeltmek için PEM tamponu içinde taze hazırlanmış% 2 formaldehid 4 ml.
  4. düzgün bir çözelti sabitleme atın ve oda sıcaklığında 3 kez PBS ile yıkayın. Sabit örnekler birkaç gün 4 ° C'de PBS içinde tutulabilir. Bir sonraki adıma geçmeden hemen daha iyi immün sonuç verir.
  5. özofagus keserek balıkların vücut boşluğunda karaciğer ile tüm gut teşrih. % 4 bir kesit kalıpta agaroz düşük erime gastrointestinal organlar gömün.
  6. Ön ucundan başlayarak, buz gibi soğuk PBS 50 um aralıklarla enlemesine bölüme numunelerin kesilmesi için bir vibratome kullanın. sn transfer# 1 boya fırçası kullanılarak PBS ile 6 oyuklu plaka leri.
  7. Permeabilize ve Blok tamponu O blok bölümleri / N 4 ° C'de.
  8. 1 bir seyreltme tavşan anti-kollajen I antikor ile inkübe: 100 Blok tamponu O'da / N 4 ° C'de. 5 kez, 15 dakika yıkama tamponu ile her bir yıkama.
  9. 1 bir seyreltmede AlexaFluor 647 konjüge edilmiş eşek anti-tavşan antikoru inkübe: 200 Blok tamponu O'da / N 4 ° C'de. Yıkama tamponu ile ve bir kez PBS ile 5 kez, her biri 15 dakika yıkanır.
  10. Yavaşça 1. boya fırçası kullanarak cam slaytlar bölümleri aktarmak. , Kimwipes kullanarak aşırı PBS kaldırmak montaj medya bir damla ekleyin ve oje ile mühür cam kapak. İletken konfokal görüntüleme hemen şiddetle önerilir.
  11. görüntü yakalamak için 40X / 1.3 yağ lens ile donatılmış bir konfokal sistemi kullanın. % 20-50 lazer gücünü kullanın. 1 mikron aralıklarla Z yığın görüntüleri yakalayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 larva zebrafish bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modelinin gelişimini gösterir. EtOH için Zebra balığı larvaları sergilemek için bir protokol optimize etmek için, öncelikle EtOH toksisitesini değerlendirildi. 2,5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) larvaları eşzamanlı 24 saat EtOH / MTZ muamele edilir, 24 saat için EtOH konsantrasyonu% 1,% 1.5 ya da% 2 maruz bırakıldı. Neredeyse bütün larvalar kolajen gibi hücre dışı matris proteinleri nadir birikimi ile az fibro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hatta I kolajen fibril tipi de dahil olmak üzere ECM proteinlerinin önemli bir miktarı mevcudiyetinde olması, HPC hepatositler olarak yeniden oluşturmak için yetkinlik korumak düşündüren, EtOH / MTZ tedavi edilen geri kazanılması karaciğerlerinde HPC aracılı hepatosit rejenerasyonu görülmektedir. EtOH, sadece tedavi HPC aktivasyonunu 15 uyarmadı ise MTZ sadece tedavi anlamlı ECM ​​proteinlerinin birikmesini artmamıştır. Kombine EtOH / MTZ tedavisi kullanarak, biz fibrotik karaciğerde HPC odaklı rejenerasyon a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Biz yazının eleştirel okuma Alem Giorgis teşekkür CHS için GTEC (2731336 ve 1411318), NIH (K01DK081351) ve NSF (1354837) hibe tarafından kısmen desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kalsiyum sülfat hemihidrat (CaSO4)AcrosAC385355000
Magnezyum sülfat (MgSO4)EMDMX0075
1,4-Piperazindietansülfonik asit (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -
N, N, N ve asal;, N ve asal; -tetraasetik asit (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
EtanolSigma-AldrichE7023200 geçirmez
FormaldehitFisher ScientificF79-500
Metronidazol (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-fenil-2-tiyoüre (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-amino benzoik asit etil ester (Trikain)Sigma-AldrichA5040
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tabletiAmrescoE404Bir tableti 100 ml damıtılmış su ile çözün
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Sığır serum albüminiFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Düşük erime noktalı agaroz AmrescoBP165
Kök Hücre Sinyalizasyon Bileşik KütüphanesiSelleck ChemicalsL210010  DMSO
ActiProbe-1K KütüphanesindeTimtecActiProbe-1K10  DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729'dakiDMSO ile 10  'ye çözün; mM
CHIR-99021Selleck KimyasallarıS2924DMSO ile 10 ° C'ye kadar çözün; mM
Anti-Kollajen I antikoruAbcamab23730İmmün boyama için 1:100'de kullanın, balıkla reaksiyona girer
AlexaFluor 647 Eşek anti-tavşan IgG (H + L)Moleküler ProblarA31573İmmün boyama için 1:200'de kullanın
Montaj ortamı (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
100 mm Petri kabıVWR25384-088
24 kuyulu plakaVWR10062-896
ForsepsGüzel Bilim Araçları11255-20Dumont #55
Cam slaytVWR48312-00375x25 mm
Kapak camıVWR48366-04518 mm
Streç filmFisher Scientific22305654
Alüminyum folyoFisher Scientific1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
VibrotomLeicaVT1000 S
Stereo mikroskopLeicaM80
Epifloresan mikroskobuLeicaM205 FA
Confocol mikroskopZeissLSM700
mM stoğu mM stoğu

Kaynaklar

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
  5. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  6. Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
  7. Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
  8. Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
  9. Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
  10. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  11. Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
  12. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
  14. Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
  15. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
  16. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  17. Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
  18. Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
  19. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  20. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  21. Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
  22. Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
  23. Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
  24. Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
  25. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  26. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  27. Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137(2013).
  28. Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
  29. Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
  30. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
  31. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
  32. Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
  33. Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Zebra Bal Hepatosit RejenerasyonuHepatik Progenit r H crelerKimyasal Tarama ProtokolTip Bir Kolajen BirikimiEpifloresan MikroskopiKonfokal G r nt leme AnaliziYa Asidi Ba lay c ProteinMTZ Tedavi ProtokolZebra Bal Karaci er Modeli
Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.