Aşırı ekstraselüler matriks proteinlerinin birikmesi ile sürekli fibroz siroza yol açar. Alkol kötüye kullanımı, ciddi karaciğer hastalığının ana nedenlerinden biridir. Alkolün neden olduğu yaralanma üzerine hepatosit rejenerasyonunu teşvik etme mekanizmalarını ve stratejilerini incelemek için etanolün neden olduğu bir zebra balığı fibrotik karaciğer modeli oluşturduk.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre dışı matriks (ECM) protein birikiminin devam etmesi ile sürekli karaciğer fibrozu, karaciğerin hücresel yeterliliğini kaybetmesine neden olarak hepatosellüler disfonksiyon ile siroza yol açar. Birden fazla karaciğer hakaretleri arasında, alkol kötüye kullanımı karaciğer yetmezliği ve hepatosellüler karsinom gibi önemli sağlık sorunlarına yol açabilir. Bununla birlikte, alkole yanıt olarak hepatositleri rejenere eden endojen hücresel kaynakların kimliği düzgün bir şekilde araştırılmamıştır. Ayrıca, az sayıda çalışma, alkolün neden olduğu yaralanma üzerine hepatosit rejenerasyonunu etkili bir şekilde modellemiştir. Yakın zamanda, zebra balığında hepatik progenitör hücrelerin (HPC'ler) fibrojenik uyaran varlığında neredeyse tam hepatosit kaybı üzerine hepatositlere yol açtığı etanol (EtOH) ile indüklenen bir fibrotik karaciğer modeli oluşturmayı bildirdik. Ayrıca, bu modeli kullanan kimyasal ekranlar aracılığıyla, hepatosit rejenerasyonunu artıran çok sayıda küçük molekül belirledik. Burada, EtOH ile indüklenen bir fibrotik karaciğer modeli geliştirme ve bu modeli zebra balıklarında kullanarak kimyasal taramalar yapma prosedürlerini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu protokol, hepatositin fibrotik karaciğerde nasıl rejenere olduğunun moleküler ve hücresel mekanizmalarını tanımlamak için kritik bir araç olacaktır. Ayrıca, bu yöntemler in vivo kronik karaciğer hastalığı için yeni terapötik stratejilerin potansiyel keşfini kolaylaştıracaktır.
Giriş
Karaciğer ana parankimal hücre tipi olan hepatosit 1, dikkate değer yenilenmesi kapasitesine rağmen, kronik karaciğer yetmezliği, hepatik progenitör hücre (HPC) bağlı yenilenme 2 giden, bu yeteneği bozar.
Kronik karaciğer hasarı özellikle alkol bağımlılığı, kronik hepatit C virüsü (HCV) enfeksiyonu 3 ve non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAYKH) 4 türetilmiştir. Bu hücre-dışı matrisi (ECM) proteinlerin birikmesiyle ilişkilidir sürekli karaciğer fibrozu, yol açar. Kalıcı ECM birikimi sonradan yüksek morbidite ve mortalite ile siroz sonuçlanan bir fibröz skar dokusu 5 oluşturarak s....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Zebra balığı kaldırdı ve Teknoloji Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Georgia Institute of tarafından onaylanan Ulusal Sağlık Enstitüleri ve ölçütlerini karşılayan standart bir protokol kullanılarak yetiştirilmiş.
Çözümler 1. hazırlanması
- embriyonik / larva zebrafish korumak için (dönüşümlü 'embriyonun orta' ile kullanılır) 20 L yumurta suyu hazırlayın. Damıtılmış su, 250 ml 1.5 gr CaSO 4 ve 6 gr anında okyanus deniz tuzu çözülür. 20 L distile su ve ajitasyon dolu bir damacana içine dökün.
- 1 L 'nin Hazırlanması 1-fenil-2-tioüre (PTU) stok çözeltisi (20x). 1 L damıtılmış su içinde 0.6 g PTU toz eritilir. bi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 larva zebrafish bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modelinin gelişimini gösterir. EtOH için Zebra balığı larvaları sergilemek için bir protokol optimize etmek için, öncelikle EtOH toksisitesini değerlendirildi. 2,5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) larvaları eşzamanlı 24 saat EtOH / MTZ muamele edilir, 24 saat için EtOH konsantrasyonu% 1,% 1.5 ya da% 2 maruz bırakıldı. Neredeyse bütün larvalar kolajen gibi hücre dışı matris proteinleri nadir birikimi ile az fibro.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hatta I kolajen fibril tipi de dahil olmak üzere ECM proteinlerinin önemli bir miktarı mevcudiyetinde olması, HPC hepatositler olarak yeniden oluşturmak için yetkinlik korumak düşündüren, EtOH / MTZ tedavi edilen geri kazanılması karaciğerlerinde HPC aracılı hepatosit rejenerasyonu görülmektedir. EtOH, sadece tedavi HPC aktivasyonunu 15 uyarmadı ise MTZ sadece tedavi anlamlı ECM proteinlerinin birikmesini artmamıştır. Kombine EtOH / MTZ tedavisi kullanarak, biz fibrotik karaciğerde HPC odaklı rejenerasyon a.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma Biz yazının eleştirel okuma Alem Giorgis teşekkür CHS için GTEC (2731336 ve 1411318), NIH (K01DK081351) ve NSF (1354837) hibe tarafından kısmen desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kalsiyum sülfat hemihidrat (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnezyum sülfat (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazindietansülfonik asit (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) - N, N, N ve asal;, N ve asal; -tetraasetik asit (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 geçirmez |
| Formaldehit | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazol (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoik asit etil ester (Trikain) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tableti | Amresco | E404 | Bir tableti 100 ml damıtılmış su ile çözün |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Sığır serum albümini | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Düşük erime noktalı agaroz | Amresco | BP165 | |
| Kök Hücre Sinyalizasyon Bileşik Kütüphanesi | Selleck Chemicals | L2100 | 10 DMSO |
| ActiProbe-1K Kütüphanesinde | Timtec | ActiProbe-1K | 10 DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729'daki | DMSO ile 10 'ye çözün; mM |
| CHIR-99021 | Selleck Kimyasalları | S2924 | DMSO ile 10 ° C'ye kadar çözün; mM |
| Anti-Kollajen I antikoru | Abcam | ab23730 | İmmün boyama için 1:100'de kullanın, balıkla reaksiyona girer |
| AlexaFluor 647 Eşek anti-tavşan IgG (H + L) | Moleküler Problar | A31573 | İmmün boyama için 1:200'de kullanın |
| Montaj ortamı (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri kabı | VWR | 25384-088 | |
| 24 kuyulu plaka | VWR | 10062-896 | |
| Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11255-20 | Dumont #55 |
| Cam slayt | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Kapak camı | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Streç film | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Alüminyum folyo | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotom | Leica | VT1000 S | |
| Stereo mikroskop | Leica | M80 | |
| Epifloresan mikroskobu | Leica | M205 FA | |
| Confocol mikroskop | Zeiss | LSM700 |
Kaynaklar
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
