Method Article

Gelişim ve karakterizasyonu İn Vitro Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca 2+] I Ve Nitrik Oksit Üretimi

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip sergiler. mikroakışkan cihazların geliştirilmesi iki yılda mühendis tarafından benimsemiş olmasına rağmen, onların biyolojik uygulamalar sınırlı kalır. Biyolojik uygulamalar tarafından onaylanmış bir daha fizyolojik ilgili in vitro mikrovasküler modeli alanını ilerletmek ve in vivo ve in vitro çalışmalar arasında boşlukları doldurmak için önemlidir. Burada, uzun vadeli bir perfüzyon yeteneğine sahip bir mikroakışkan cihaz kullanarak kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı prosedürler mevcut. Ayrıca konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak AT [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) üretiminin, agonist ile uyarılan değişiklikleri nicelik uygulamaları göstermektedir. oluşan mikrovasküler netSürekli perfüzyon ile iş EC arasında iyi gelişmiş kavşaklar gösterdi. dağıtım-cadherin VE statik kültürlü AK mono tabakaları daha sağlam mikrodamarlar gözlenen yakın oldu. EC geçici bir artış ATP'ye bağlı [Ca2 +] i ve NO üretimi kantitatif kültürlenmiş mikro damarların özelliğe geçerli bir hücre seviyeleri ölçülmüştür. Bu mikroakışkan cihaz EC, geleneksel statik 2B kültürlerinde daha vivo hücre kültürü ortamı daha yakın hale getirir, iyi kontrol edilen, fizyolojik olarak uygun akış altında büyümesine izin verir. Mikrokanal ağ tasarımı çok yönlü ve üretim süreci basit ve tekrarlanabilir. Cihaz kolayca yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan konfokal ya da geleneksel mikroskopik sisteme entegre edilebilir. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından oluşturulan çünkü En önemlisi, bu yaklaşım nasıl araştırmak için yararlı bir araç olarak hizmet verecekpatolojik hasta örneklerinden değişmiş kan bileşenleri insan ECS etkileyen ve klinik konularda bilgi sağlar. Aynı zamanda ilaç taraması için bir platform olarak geliştirilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip 1,2 sergilemektedir. Mikroakiskan teknolojisi, istenen akış koşulları altında büyümek, özellikle damar EC'ler için, kültürlenmiş hücreler için bir fırsat sağlar geometrik kısıtlı mikro (alt milimetre) kanallar 3 ile hassas bir şekilde kontrol sıvısı sağlar. Bu özellikler, geleneksel statik 2B hücre kültürlerinde daha etkin in vivo hücre kültürü koşulları daha yakın hale. Onlar mikroakışkan cihazlar vaskülatürlerden fark....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

  1. Bir SU-8 50 Ana Kalıp Standart Fotolitografi İmalatı
    1. Spin-kaplama öncesi silikon gofret temizleyin. 15 dakika boyunca, izopropil alkol (IPA) ve ardından 15 dakika boyunca aseton ile çıplak 2 inç silikon gofret durulayın. 1 saat süre ile 150 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde yerleştirerek gofret kurutmak. Dehidrasyon sonra, oda sıcaklığında, gofret soğutulur.
    2. Spin-kat SU-8 fotorezist ile silikon gofret. gofret üzerine 2 ml SU-8 ışığa ekleyin. 30 saniye için 300 dev / san hızlanma 1.000 rpm, ardından 10 saniye boyunca 100 rpm / saniye hızlanma 500 rpm e gofret rampası. (İlave video 1'e bakınız)
    3. Ön ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bölümde, bu protokol ile geliştirilen kültür mikrovasküler ağı ile elde edilen sonuçların bazılarını gösterir. Mikrokanal deseni üç seviyeli dallanma ağı (Şekil 1A) 'dir. Bu tasarımda, dört 100 mikron genişliğinde kızı kanallarına yine iki 126 mikron genişliğinde kanallar ve dalları içine 159 mikron genişliğinde anne kanal dalları. 3D sayısal simülasyon Bu mikro ağı içinde kesme stresi üç farklı seviyede gösterir 0.35 ul / dak akış hızı (Şekil 1B), al.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı protokoller mevcut, AK kavşak ve F-aktin dağıtım hücre iskeleti karakterizasyonu ve AT'nin kantitatif ölçümler [Ca2 +] i ve bir mikroakışkan cihaz kullanarak NO üretimi. Perfüze mikroakışkan cihaz in vivo mikrovasküler geometri ve kayma akış koşulları yakın simülasyon sağlayan bir in vitro model sağlar. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından oluşturulabilir, bu yaklaşım hasta örnekleri.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir rakip çıkarları veya çakışan çıkarları var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından desteklenen HL56237, Diyabet, Sindirim Ulusal Enstitüsü ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü DK97391-03, Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1227359 ve EPS-1003907) verir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
AsetonFisher ScientificA929
Biyopsi yumruğuMiltex33-31 AA
Sığır AlbüminiMP Biyomedikaller810014
Sığır Beyin Özü (BBE)LonzaCC-4098
ÖrtüSlip Fisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
Eşek anti-Keçi IgG (H + L) İkincil AntikorYaşam teknolojileriA-11055
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokGibco14190-250
DRAQ5 (çekirdek boyama) Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi4084
Endotel Hücre Büyüme Takviyesi (EKGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
Fetal Sığır SerumuGibco16000-044
FibronektinGibcoPHE0023
Fluo-4Yaşam teknolojileriF-14201
Domuz derisinden elde edilen jelatinSigma-AldrichG1890-100G
Gentamisin (50 mg / ml)Gibco15750-078
Cam lamelFisher Scientific12-548B
Cam Pasteur pippetteVWR14672
Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzuSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES Tamponlu Tuzlu Su ÇözeltisiLonzaCC-5024
İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler)LonzaCC-2517
İzopropil alkol (IPA)VWR89125
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030-081
Memeli Zil Çözeltisi Bileşeni
NaCl (132 mM)Fisher ScientificS671-3
KCl (4.6 mM)Fisher BilimselP217-500
CaCl2 ve orta nokta; 2H2O (2,0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 ve orta nokta; 7H2O (1.2 mM)Fisher ScientificM63-500
Glikoz (5.5 mM)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5.0 mM)Fisher ScientificS233-500
Hepes Tuzu (9.1 mM)Research Organics6007H
Hepes Acid (10.9 mM)Research Organics6003H
MCDB 131 Kültür OrtamıYaşam teknolojileri10372-019
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710
Phalloidin (F-aktin boyama)Sigma-AldrichP1951
Fosfat Tamponlu Salin Yaşam teknolojileri14040-133
Polidimetilsiloksan (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
NeşterExel Int29552
Scotch bant3M34-8711-3070-3
Silikon gofretVWR14672
SU-8 fotorezistMicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 geliştiriciMicroChemY020100
doku kültürü şişeleriSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Kimya KitabıT6878
Tripsin Nötrleştirici çözeltisiGibcoR-002-100
Tripsin/EDTA Çözeltisi (TE)GibcoR-001-100
BoruCole-ParmerPTFE mikro delikli boru, 0.012 "ID x 0.030" OD
VE-cadherinSanta Cruz BiyoteknolojiSC-6458
Ekipmanın Adı<strong>CompanyKatalog NumarasıYorumlar/Açıklama
Biosafety Laminer başlıkNuAireNU-425 Sınıf II, Tip A2
CCD kameraHamamatsuORCA
Konfokal mikroskopLeicaTCS SL
KurutucuBel-ArtF42022
Ocak GözüWenescoHP-1212
İnkübatörForma Scientific3110
Isotemp fırınBarnstead3608-5
Litografi tezgahKarl SussMA6 Kontakt Litografi
Optik mikroskopNikonL200 ND & CCD kamera için Diaphod 300
DeklanşörSutter InstrumentLambda 10-2
Plazma temizleyiciPVA TePla/Harrick plazmaM4L/PDC-32G
Spin kaplayıcıBrewer ScienceCee 200X
Şırınga pompa sistemiHarvard Aparatı703005
Yazılımın adı ŞirketKatalog NumarasıYorumlar/Açıklama
CAD yazılımıAutodeskAutoCAD 2015
CFD simülasyon yazılımıCOMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Görüntüler NO üretimi için elde edilir ve analiz edilir Üniversal GörüntülemeMetafloru

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

Related Articles