Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Gelişim ve karakterizasyonu

8.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54014

⸱

19 Mayıs 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Özet

In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip sergiler. mikroakışkan cihazların geliştirilmesi iki yılda mühendis tarafından benimsemiş olmasına rağmen, onların biyolojik uygulamalar sınırlı kalır. Biyolojik uygulamalar tarafından onaylanmış bir daha fizyolojik ilgili in vitro mikrovasküler modeli alanını ilerletmek ve in vivo ve in vitro çalışmalar arasında boşlukları doldurmak için önemlidir. Burada, uzun vadeli bir perfüzyon yeteneğine sahip bir mikroakışkan cihaz kullanarak kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı prosedürler mevcut. Ayrıca konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak AT [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) üretiminin, agonist ile uyarılan değişiklikleri nicelik uygulamaları göstermektedir. oluşan mikrovasküler netSürekli perfüzyon ile iş EC arasında iyi gelişmiş kavşaklar gösterdi. dağıtım-cadherin VE statik kültürlü AK mono tabakaları daha sağlam mikrodamarlar gözlenen yakın oldu. EC geçici bir artış ATP'ye bağlı [Ca2 +] i ve NO üretimi kantitatif kültürlenmiş mikro damarların özelliğe geçerli bir hücre seviyeleri ölçülmüştür. Bu mikroakışkan cihaz EC, geleneksel statik 2B kültürlerinde daha vivo hücre kültürü ortamı daha yakın hale getirir, iyi kontrol edilen, fizyolojik olarak uygun akış altında büyümesine izin verir. Mikrokanal ağ tasarımı çok yönlü ve üretim süreci basit ve tekrarlanabilir. Cihaz kolayca yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan konfokal ya da geleneksel mikroskopik sisteme entegre edilebilir. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından oluşturulan çünkü En önemlisi, bu yaklaşım nasıl araştırmak için yararlı bir araç olarak hizmet verecekpatolojik hasta örneklerinden değişmiş kan bileşenleri insan ECS etkileyen ve klinik konularda bilgi sağlar. Aynı zamanda ilaç taraması için bir platform olarak geliştirilebilir.

Giriş

In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip 1,2 sergilemektedir. Mikroakiskan teknolojisi, istenen akış koşulları altında büyümek, özellikle damar EC'ler için, kültürlenmiş hücreler için bir fırsat sağlar geometrik kısıtlı mikro (alt milimetre) kanallar 3 ile hassas bir şekilde kontrol sıvısı sağlar. Bu özellikler, geleneksel statik 2B hücre kültürlerinde daha etkin in vivo hücre kültürü koşulları daha yakın hale. Onlar mikroakışkan cihazlar vaskülatürlerden farklı modellemek için kullanılır ve mekanik ve / veya kimyasal uyarılara AT yanıtları incelemek için zaman son derece önemlidir.

statik hücre kültürü, biyomedikal f adaptasyon ve Mikroakiskan uygulama üzerinde mikro ağı gösterdiği avantajlara rağmenield sınırlı kalır. Son gözden tarafından bildirilen bu alanda (% 85) yayınların çoğunluğu mühendislik dergilerinde 4 hala. mikroakışkan cihazların performansı çoğu biyolog gibi Transwell tahlil ve bu minyatürize cihaza makro ölçekli kültür çanak / cam slayt olarak mevcut tekniklerle geçiş için yeterli inandırıcı olmamıştır. Mikroakiskan ileriye bu alanı taşımak için disiplinler arası işbirliklerini gerektiren multidisipliner bir alandır. Bu teknik makalenin amacı, biyolojik uygulama ve mikroakışkan mikrodamarlar işlevsel doğrulama sağlarken, disiplinler arasındaki bilgi farkının azaltılması ve biyologlar tarafından fabrikasyon prosedürleri anlaşılır hale getirmektir. görüntülenmiştir deneysel protokoller mikroakışkan cihazlar ve mühendis ve biyolog arasında yakın bir işbirliğini temsil biyolojik yarar, hem de imalat içerir.

Biz son zamanlarda bazı bildirildiMikroakışkan cihaz 5 ile in vitro mikrovasküler ağını kullanarak biyolojik uygulamalar. uygun istenilen kayma gerilmesini mikrokanal ağı boyutlarını tasarım ve uygulamak için, bir sayısal model yakından akış profili tahmin etmek bilgisayarlı akışkan dinamik yazılımı ile inşa edilmiştir. Örneğin, bir araya gelerek konfluens mikro serpildi Primer insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), sürekli perfüzyonla 3-4 gün içinde, mikrokanalın tüm iç yüzeylere sahiptir. Uygun bir bariyer oluşturulması, statik hücre kültürü koşulları altında ve bozulmamış mikrodamarlar oluşan kıyasla VE-cadherin boyamasıyla gösterilmiştir ve daha. Bireysel perfüze sağlam mikrodamarlar 6-8 geliştirilen deneysel protokolleri uygulayarak, kantitatif EC değişiklikleri ölçülen [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) floresan içinde olan adenozin trifosfat (ATP) cevaben üretimigöstergeleri ve konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu. EC agonist kaynaklı artışlar [Ca2 +] i ve NO üretimi mikrodamar geçirgenliği 6-15 inflamatuar medyatör ile endüklenmiş artışından kaynaklandığını için gerekli olan hücre içi sinyaller olarak bildirilmiştir. Önceki bazı çalışmalarda DAF-2 DA yüklü mikroakışkan cihazlar 16,17 görüntülerini gösterdi rağmen, uygun çözünürlük ve veri analizi henüz 18 elde etmemişti. Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışma endotelyal agonist kaynaklı dinamik değişim [Ca2 +] i ve NO üretimi kullanan mikroakışkan tabanlı sistem ilk nicel ölçümlerini göstermektedir.

Imalat teknikleri birkaç mikron mikrokanallar aşağı imal ve in vivo mikrovasküler geometrileri taklit etmek karmaşık desenleri gelişmesini sağlamak için esnekliğe sahip. Burada dallanma üç seviyeleri ile tipik bir mikrokanal ağı sundu. Buağ mikroimalat temiz oda ve yumuşak litografi gerçekleştirilir fotolitografi kombinasyonu ile imal edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

  1. Bir SU-8 50 Ana Kalıp Standart Fotolitografi İmalatı
    1. Spin-kaplama öncesi silikon gofret temizleyin. 15 dakika boyunca, izopropil alkol (IPA) ve ardından 15 dakika boyunca aseton ile çıplak 2 inç silikon gofret durulayın. 1 saat süre ile 150 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde yerleştirerek gofret kurutmak. Dehidrasyon sonra, oda sıcaklığında, gofret soğutulur.
    2. Spin-kat SU-8 fotorezist ile silikon gofret. gofret üzerine 2 ml SU-8 ışığa ekleyin. 30 saniye için 300 dev / san hızlanma 1.000 rpm, ardından 10 saniye boyunca 100 rpm / saniye hızlanma 500 rpm e gofret rampası. (İlave video 1'e bakınız)
    3. Ön fırında 30 dakika boyunca 95 ° C'de 10 dakika, daha sonra yumuşak bir fırında 65 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde gofret.
    4. Spin-kaplı paslanmaz çeliğin bir filmin maskesi tasarlanmış desen dönüştürmek için UV ışınlarına maruz kalma kullanın. film maskesi gibi ince şeffaf film desen yazdırın. üstüne bir film maske yerleştirinışığa kaplı-spin ve 300 mJ / cm2 dozda UV maruz. (İlave video 2'ye bakınız)
      Not: Bu protokol, mikrokanal ağı deseni (159 mikron genişliğinde anne kanalları dört 100 mikron genişliğinde kızı kanallarına dallanma) CAD yazılımları ile tasarlanmıştır. Filmde desen net bir alan olarak gösterir ve filmin geri kalanı siyah mürekkep ile kaplıdır. SU-8 negatif fotorezist olduğundan, UV maruz fotorezist kısmı çapraz olacak ve kalıp geliştirme (adım 1.1.6) sırasında solvent çözünmez hale gelecektir. geliştikten sonra, bu çözülmeyen kısım tasarlanmış ağ deseni çoğaltılacak ve bir ana kalıp olarak hizmet vermektedir.
    5. Mesaj fırında 1 dakika, 10 dakika boyunca, sonra 95 ° C, 65 ° C 'de sıcak bir plaka üzerinde ortaya gofret.
    6. ana kalıp geliştirin. çözücü olarak kullanın SU-8 geliştirici un çapraz bağlı fotodirencin kaldırmak için. 3 dakika SU-8 geliştirici gofret daldırın ve IPA ile durulayın1 dakika karıştırıldı.
    7. IPA durulama sonra hiçbir beyaz bir çizgi oluşumu (non-tedavi fotorezist kalıntısı) kalmayıncaya kadar bu gelişen döngüsü 2-3 kez tekrarlayın. Yavaşça nitrojen gazı ile gofret kurulayın ve mikroskop altında desen küçük özelliklerini incelemek. Gerekirse ek gelişmekte döngüleri tekrarlayın.
    8. Sert 15 dakika boyunca 150 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde gofret fırında.
  2. yumuşak Litografi
    1. El ile bir ağırlık iki parça polidimetilsiloksan (PDMS) elastomer (taban ve sertleştirici) karıştırın. 10: 1 oranındadır.
    2. Gazlardan, 15 dakika boyunca, bir ev tipi vakum ile bağlı bir desikatör PDMS karışımı ile gerçekleştirilmektedir. fotorezist ana kalıp üzerinde PDMS çözüm Cast. PDMS kalınlığı giriş / çıkış boru istikrarlı bir tutma sağlamak için fazla 3 mm olması gerekir. Gazlardan, 15 dakika boyunca daha PDMS ve gerekirse azot gazı ile kalan hava kabarcıklarını çıkarmak. 3 saat 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde döküm PDMS Cure.
    3. yüzeyini temizleyinBir kapaklar ve plazma temizleyici (30 sn plazma tedavisi) ile cam lamel. 30 sn 500 devir / sn hızlanma hızında 4,000 rpm ramping cam lamel Spin-kat un tedavi PDMS (0.5 ml). En az 30 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde PDMS spin kaplı lamel Cure.
    4. Kes ve ana kalıp tedavi PDMS serbest bırakın. Daha sonra bir giriş ve ana kanal uzak ucunda bir 1 mm çapındaki bir delik zımba ile bir çıkış oluşturur.
    5. PDMS spin kaplı cam lamel cihazı Bond. PDMS yüzeyleri oksitlenmesi ve 1 dakika süre ile ve plazma ile lamel. oksijen plazma muamelesinden sonra, yapışma yüzeyi deiyonize su (Di su) bir damlacık yerleştirin ve iki parçayı yerleştirin. sürekli bir bağlantı sağlamak için 30 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde cihazı pişirin.

figure-protocol-1
Ek Video 1 (Sağ indirmek için tıklayın).

figure-protocol-2
Ek Video 2 (Sağ indirmek için tıklayın).

2. Endotel Hücre Tohum ve Kültür

  1. Cihaz Sterilizasyon ve Fibronektin Kaplama
    1. oksidasyondan giriş / çıkış çevresinde en PDMS yüzeyinin hidrofobik özelliği korur. giriş etrafında PDMS yüzeyini kaplayan ve oksidasyonu önlemek için kapaklar küçük çizgili çıkış. Bu prosedür doldurma aşamasında (2.1.3) sırasında cihazın üst yüzeyi üzerinde her yayılmasını distile su önleyebilir.
    2. oksijen plazma fo ile PDMS cihaz tedaviR5 dakika, böylece yüzeyi hidrofilik olacak şekilde değiştirin mikrokanal sıvı akışını kolaylaştırmak ve doldurma prosedürü (2.1.3) 'de bindirme kabarcık önler.
    3. girişten DI suyla cihazı doldurmak için bağlı bir iğne veya bir pipet ile bir şırınga kullanabilirsiniz. çıkışında kartı DI su (30-50 ul), bir damla olana kadar doldurmaya devam edin. Mikrokanallı içinde sıkışıp kabarcıklar olup olmadığını kontrol etmek mikroskop altında cihazı inceleyin. Bir kağıt mendille giriş ve çıkışında aşırı su damlacığı çıkarın.
    4. laminer biyo-güvenlik başlığı içinde, 3 saat içinde en az UV ile bir petri ürünü sterilize. , Buharlaşmayı önlemek PDMS ince bir parça ile giriş / çıkış karşılamak için çanak içinde ıslak kağıt mendil koymak ve Parafilm çanak sarın.
    5. Coat fibronektin cihaz. (Buzdolabı / ml fibronektin gece boyunca 100 ug ile kat daha sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile ilk önce cihaz yıkayın4 ° C). girişinde bir çözelti damla yerleştirin ve daha sonra bir ev tipi vakum, bir iğne ya da bir pipet ile bir şırınga ile çıkışında negatif bir basınç oluşturur.
    6. Hücre kültür ortamı cihazı doldurun. Hücre kültürü ortamını yüklemeden önce 3 kez elle PBS ile cihazı durulayın. 37 ° C'de bir kuluçka cihazı ısıtın.
  2. EC Tohum ve Uzun Vadeli Perfüzyon
    Not: geleneksel statik 2D AK kültürü ile karşılaştırıldığında, sürekli perfüzyon ile in vitro mikrovasküler ağ modeli daha yakın in vivo koşullara hücre kültür ortamı yaptı. Bu protokolde ortaya konulabilir, in vitro mikro-damar ağı iki hafta kadar muhafaza edilebilir. iyi kontrol perfüzyon sürekli besin doldurmak atıkları kaldırmak ve aşırı izdiham AT tek tabaka önleyecektir. Bu nedenle, farklı physiologica altında cep ve hemodinamik ortamı taklit eden, daha uzun süreli çalışmalar uzatılabilirL ve patolojik durumlar.
    1. % 8 dekstran (ağırlıkça mol 70,000) ile HUVEC kültür ortamı birincil HUVECler (MCDB 131) karıştırın. dekstran ortam yükleme viskozitesini arttırır ve daha iyi bir hücre ekim sonucu elde etmek için kullanılır. Tavsiye hücre yoğunluğu yaklaşık 2-4 x 10 6 hücre / ml 'dir.
    2. cihazın içine hücreleri tohumu. giriş üzerinde bir hücre 10-20 ul damlacık yerleştirin. Her iki cihaz eğerek ya da kılcal eylem çıkışında bir cam Pasteur pipeti kullanarak yumuşak bir akış tanıtmak. Başarılı bir hücre yükleme için temel akış hızı küçük kanalları içinde en az 1 mm / sn kontrol etmektir.
    3. hücre tohumlama kontrol edin. İlk tohumlama sonra, mikroskop altında tohumlama durumunu kontrol etmeden önce 15-20 dakika (37 ° C'de% 5 CO 2 nemlendirilmiş atmosfer) Cihazı kuluçkaya yatmaktadır. Gerekirse arzu edilen bir hücre yoğunluğu elde etmek için ek hücre yükleme yapar.
    4. Yavaşça (37 hücre kültür ortamı ile yıkayın cihazı° C) dekstran kaldırmak için. Kültür (37 ° C'de% 5 CO2) bir kuluçka makinesi içinde, ilk 6 saat akış yokluğunda cihazı.
    5. Uzun vadeli perfüzyon için boru bağlantısı kurmak. hareket etmesini önlemek için bir petri çanağı içine cihazı kaydet. giriş ve çıkış boru eklemeler için Petri kabı kapağına küçük delikler oluşturun. hücre kültür ortamı perfüzyon için bir iğne ile bir şırıngaya giriş boru bağlayın. Bir atık toplayıcıya çıkış tüpünü bağlayın.
      Not: Yer cihaz ve bir hücre kültürü inkübatör atık toplayıcısı, inkübatör dışında bir perfüzyon pompası yerleştirerek ve uzun giriş boru ile cihazla bağlayın. perfüzyon oranı deney tasarımı ile belirlenir. Bu cihazda, 0.35 ul / dk'lık bir perfüzyon oranı ve 1-2 din / cm2 arasında bir kesme stresi aralığı kullanın. Bu perfüzyon koşul altında, HUVECler yaklaşık 3-4 gün içinde izdiham ulaşmak.

3. Benmmunofluorescent Boyama

  1. 30, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında durulama 1x PBS ardından 4 ° C'de dakikada, ve 30 dakika için bloke% 1 BSA,% 2 paraformaldehit perfüzyon cihazı ECS sabitleyin. Hücre kültürü için kullanılan ile aynı olan bir perfüzyon oranı kullanın.
  2. % 0.1 Triton X-100 ile antikor boyama için sabit ECS geçirgenliği. etikete 5-7 dakika süreyle Triton cihazı serpmek-VE kaderin ve etiket F-aktin 3 dk.
  3. cihazın içine antikorlar yükleyin. Önceki çözümler yıkamak için 15 dakika süreyle 1x PBS ile cihazı serpmek. El ile 2 ug / ml (toplam hacim 20-50 ul) konsantrasyonda cihaza VE-cadherin (anti-keçi) karşı birincil antikor yükleyin. 4 ° C'de bir buzdolabı içinde gece boyunca cihazı tutun. 45-60 dakika boyunca 7 ug / ml konsantrasyonunda da bir şırınga pompası ile ikincil antikoru (eşek anti-keçi) serpmek.
  4. AK F-aktin Etiket Phalloidin ile. 1x PBS Besin cihazı serpmekEl 7-10 dakika boyunca Phalloidin (10 ug / ml) yüklemeden önce R15 Min.
  5. Etiket AK çekirdekler (Malzeme Listesine bakınız).
  6. 1X PBS ile durulayın cihaz ve görüntüleme kadar 4 ° C 'de muhafaza.

Endotel 4. Floresans Görüntüleme [Ca2 +] i

  1. albümin ile cihaz (10 mg / ml), 37 ° C'de 15 dakika boyunca -Ringer çözümünü serpmek. Bu hücre kültürü için kullanılan aynı perfüzyon hızı kullanın. Albümine Ringer çözeltisi tüm bileşenlerin konsantrasyonları Malzeme Listesi açıklanmaktadır.
  2. EC [Ca 2 +] i fluo-4 AM görüntüleme için konfokal sistem kurmak. Ca 2+ görüntüleme için bir konfokal mikroskobik sistemi kullanın. uyarma için bir argon lazer (488 nm) kullanın ve 510-530 nm emisyon bandı ayarlayın. 512 x 512 tarama formatında: (0.95, suya daldırma NA) bir 25X amacı ile görüntüleri toplamak. her i yığınının 2 um z adım ve bir tarama aralığı kullanın20 saniye mages.
  3. albümine Ringer solüsyonu ile lümen fluo-4 AM yıkamak, ardından 37 ° C'de 40 dakika boyunca Fluo-4 AM (5 uM) ile cihaz serpmek.
  4. fluo-4 yüklü mikrodamarlar görüntü kazanır. 10 dakika boyunca temel görüntü toplayın. ATP (10 uM) ile cihaz serpmek ve 20 dakika floresan yoğunluğu (FI) değişiklikleri kaydeder.

Nitrik Oksit Üretim 5. Floresans Görüntüleme

  1. 15 dakika boyunca, albümin-Ringer çözeltisi cihazı serpmek. Hücre kültürü için kullanılan ile aynı olan bir perfüzyon oranı kullanın.
  2. ATP kaynaklı nitrik oksit üretimini ölçmek için floresan görüntüleme sistemi kurmak. Bir 12-bit dijital CCD kamera ve nitrik oksit ölçümü için bilgisayar kontrollü bir çekim ile donatılmış bir mikroskop kullanarak. Işık kaynağı olarak 75 W bir ksenon lambasını kullanarak.
    Not: bir girişim filtresi (480/40) ve dikroik ayna DAF-2 DA için uyarılma ve emisyon dalga boyu seçinbir band geçiren bariyer ile (505 nm) (535/50 nm). görüntüleri toplamak için: 20X objektif lens (0.75 NA) kullanın. photobleaching en aza indirmek için, parazit filtrenin önüne bir nötral yoğunluk filtresi (0.5 N) pozisyonuna ve 0.12 sn pozlama süresini sınırlamak.
  3. DAF-2 DA (5 mcM) hücreleri yükleyin. 37 ° C'de yaklaşık 35-40 dakika boyunca DAF-2 DA cihazı serpmek. İlk yüklemeden sonra DAF-2 floresan yoğunluğu (FI DAF) ve temel kaydedin.
    Not: DAF-2 DA deney 7 boyunca perfüzat sürekli mevcuttur.
  4. DAF-2 görüntüleri toplamak. 5 dakika boyunca FI DAF temel kaydedin. ATP (10 uM) ile cihaz serpmek ve 1 dakika aralıklar ile 30 dakika boyunca görsel imajı. Aynı odak düzlemi hücrelerin aynı grup tüm görüntüleri toplayın.

6. Veri Analizi

  1. Elle tek tek hücre düzeyinde toplanan görüntülerden çıkarları (ROI) bölgeyi seçin. HerYG floresan anahat gösterilebilir bir hücrenin teker teker alanı kaplamaktadır.
  2. Arka plan floresan çıkarma ve her ROI ortalama FI hesaplayın.
  3. EC ATP kaynaklı değişiklikleri ölçmek [Ca2 +] i ve NO üretimi. (FI 0 albümin-Ringer perfüzyon sırasında ortalama bazal FI ATP eklemeden önce olduğu FI / FI 0 * 100) Flu-4 FI değişiklikleri hesaplayarak EC [Ca 2 +] i ATP kaynaklı değişiklikleri ölçmek eksi ölçülür arka plan. Zamanla FI DAF ilk diferansiyel dönüşüm yaparak YOK üretim hızını ölçmek.
    Not: FI DAF zaman ders süresi ile kümülatif NO üretimini temsil eder. Bu nedenle, NO üretim hızı bazal ve ATP koşulları uyarılmış hem altında FI DAF profiline göre hesaplanır. Veri analizi ve deneysel prosedürler ayrıntıları daha önce yayın 7'de tarif edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu bölümde, bu protokol ile geliştirilen kültür mikrovasküler ağı ile elde edilen sonuçların bazılarını gösterir. Mikrokanal deseni üç seviyeli dallanma ağı (Şekil 1A) 'dir. Bu tasarımda, dört 100 mikron genişliğinde kızı kanallarına yine iki 126 mikron genişliğinde kanallar ve dalları içine 159 mikron genişliğinde anne kanal dalları. 3D sayısal simülasyon Bu mikro ağı içinde kesme stresi üç farklı seviyede gösterir 0.35 ul / dak akış hızı (Şekil 1B),

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı protokoller mevcut, AK kavşak ve F-aktin dağıtım hücre iskeleti karakterizasyonu ve AT'nin kantitatif ölçümler [Ca2 +] i ve bir mikroakışkan cihaz kullanarak NO üretimi. Perfüze mikroakışkan cihaz in vivo mikrovasküler geometri ve kayma akış koşulları yakın simülasyon sağlayan bir in vitro model sağlar. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından oluşturulabilir, bu yaklaşım hasta örnekleri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir rakip çıkarları veya çakışan çıkarları var.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından desteklenen HL56237, Diyabet, Sindirim Ulusal Enstitüsü ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü DK97391-03, Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1227359 ve EPS-1003907) verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ATPSigma-AldrichA2383
AsetonFisher ScientificA929
Biyopsi yumruğuMiltex33-31 AA
Sığır AlbüminiMP Biyomedikaller810014
Sığır Beyin Özü (BBE)LonzaCC-4098
ÖrtüSlip Fisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
Eşek anti-Keçi IgG (H + L) İkincil AntikorYaşam teknolojileriA-11055
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokGibco14190-250
DRAQ5 (çekirdek boyama) Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi4084
Endotel Hücre Büyüme Takviyesi (EKGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
Fetal Sığır SerumuGibco16000-044
FibronektinGibcoPHE0023
Fluo-4Yaşam teknolojileriF-14201
Domuz derisinden elde edilen jelatinSigma-AldrichG1890-100G
Gentamisin (50 mg / ml)Gibco15750-078
Cam lamelFisher Scientific12-548B
Cam Pasteur pippetteVWR14672
Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzuSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES Tamponlu Tuzlu Su ÇözeltisiLonzaCC-5024
İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler)LonzaCC-2517
İzopropil alkol (IPA)VWR89125
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030-081
Memeli Zil Çözeltisi Bileşeni
NaCl (132 mM)Fisher ScientificS671-3
KCl (4.6 mM)Fisher BilimselP217-500
CaCl2 ve orta nokta; 2H2O (2,0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 ve orta nokta; 7H2O (1.2 mM)Fisher ScientificM63-500
Glikoz (5.5 mM)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5.0 mM)Fisher ScientificS233-500
Hepes Tuzu (9.1 mM)Research Organics6007H
Hepes Acid (10.9 mM)Research Organics6003H
MCDB 131 Kültür OrtamıYaşam teknolojileri10372-019
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710
Phalloidin (F-aktin boyama)Sigma-AldrichP1951
Fosfat Tamponlu Salin Yaşam teknolojileri14040-133
Polidimetilsiloksan (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
NeşterExel Int29552
Scotch bant3M34-8711-3070-3
Silikon gofretVWR14672
SU-8 fotorezistMicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 geliştiriciMicroChemY020100
doku kültürü şişeleriSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Kimya KitabıT6878
Tripsin Nötrleştirici çözeltisiGibcoR-002-100
Tripsin/EDTA Çözeltisi (TE)GibcoR-001-100
BoruCole-ParmerPTFE mikro delikli boru, 0.012 "ID x 0.030" OD
VE-cadherinSanta Cruz BiyoteknolojiSC-6458
Ekipmanın Adı<strong>CompanyKatalog NumarasıYorumlar/Açıklama
Biosafety Laminer başlıkNuAireNU-425 Sınıf II, Tip A2
CCD kameraHamamatsuORCA
Konfokal mikroskopLeicaTCS SL
KurutucuBel-ArtF42022
Ocak GözüWenescoHP-1212
İnkübatörForma Scientific3110
Isotemp fırınBarnstead3608-5
Litografi tezgahKarl SussMA6 Kontakt Litografi
Optik mikroskopNikonL200 ND & CCD kamera için Diaphod 300
DeklanşörSutter InstrumentLambda 10-2
Plazma temizleyiciPVA TePla/Harrick plazmaM4L/PDC-32G
Spin kaplayıcıBrewer ScienceCee 200X
Şırınga pompa sistemiHarvard Aparatı703005
Yazılımın adı ŞirketKatalog NumarasıYorumlar/Açıklama
CAD yazılımıAutodeskAutoCAD 2015
CFD simülasyon yazılımıCOMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Görüntüler NO üretimi için elde edilir ve analiz edilir Üniversal GörüntülemeMetafloru

Kaynaklar

  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
  3. Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
  4. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
  5. Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797(2015).
  6. He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
  7. Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
  8. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  9. He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
  10. Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
  11. Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
  12. He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
  13. He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
  14. Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
  15. Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
  16. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
  17. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
  18. D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
  19. Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
  20. Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
  21. Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
  22. Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
  23. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
  24. McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
  25. Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
  26. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  27. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  28. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
  29. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
  30. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025(2014).
  31. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
  32. Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  33. Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
  34. Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
  35. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
  36. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Endotel HücreleriMikroakışkan CihazKayma AkışıKalsiyum GörüntülemeKonfokal MikroskopiFloresan MikroskopiVE-cadherin BoyamaATP Stimülasyonu
Gelişim ve karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.