Method Article

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

DOI:

10.3791/54025

⸱

June 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optik temizleme teknikleri, dokuların görselleştirilme biçiminde devrim yaratıyor. Bu raporda, daha tutarlı ve daha ucuz sonuçlar veren orijinal Clear Lipid değişimli Akrilamid hibritleştirilmiş Rijit Görüntüleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY) protokolünün modifikasyonlarını açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel olarak, doku görselleştirme, ilgilenilen dokunun seri olarak kesitlenmesini ve görüntülenmesini gerektirmiş, her doku kesitini benzersiz doğrusal olmayan deformasyonlara maruz bırakmış, kişinin merkezi sinir sistemindeki (CNS) hücresel morfolojiyi, dağılımı ve bağlantıyı değerlendirme yeteneğini önemli ölçüde engellemiştir. Bununla birlikte, optik temizleme teknikleri, dokuların görüntülenme şeklini değiştirmektedir. Bu yaklaşımlar, sağlam organ preparatlarının derinlemesine araştırılmasına izin vererek, sağlık ve hastalıktaki dokuların yapısal organizasyonu hakkında muazzam bir içgörü sağlar. Berrak Lipid Değişimli Akrilamid Hibritleştirilmiş Sert Görüntüleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY) gibi teknikler, ışık saçan lipitlerin serbestçe yayılmasına izin verirken önemli biyomolekülleri bağlayan bir matris sağlayarak bu amaca ulaşır. Lipid çıkarılması ve ardından kırılma indisi eşleştirmesi, dokuyu şeffaf hale getirir ve 3 boyutlu (3D) olarak kolayca görüntülenir. Bununla birlikte, orijinal CLARITY protokolünde kullanılan elektroforetik doku temizlemenin (ETC) başarılı bir şekilde uygulanması zor olabilir ve tescilli bir kırılma indeksi eşleştirme çözümünün kullanılması, tekniğin rutin olarak kullanılmasını pahalı hale getirir. Bu rapor, gelişmiş doku bütünlüğü için pasif CLARITY ile daha önce tanımlanmış bir kırılma indisi eşleştirme çözümü olan 2,2'-tiyodietanolü (TDE) birleştiren basit ve ucuz bir optik temizleme protokolünün uygulanmasını göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tam nöroanatomik yapıları görüntüleme yeteneği, sağlık ve hastalıkta beyni anlamak için son derece değerlidir. Geleneksel olarak, 3D görüntüleme, eksenel çözünürlüğü sağlamak ve derin anatomik yapıları görselleştirmek için doku kesiti gerektirir. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü veri kümeleri üretebilir, ancak karmaşık görüntü yeniden yapılandırma teknikleri gerektirir ve çok emek yoğundur. Sonuç olarak, küçük hacimli dokuların görüntülenmesi ile sınırlı kalmıştır1-3. Öte yandan optik kesit alma, floresan etiketli dokuların yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerinin oluşturulması için çok uygundur. Optik kesitleme doğası gereği üç boyutlu olduğundan, bir 3D görü....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kurallarına uygun olarak yapıldı. Thy1 YFP, PLP-EGFP PV-tdTomato farenin Bu deneyler için kullanılmıştır, ama floresan proteinleri eksprese bir farenin başarılı bir şekilde temizlenir ve görüntülenebilir.

1. Doku Hazırlanması

Dikkat: Paraformaldehyde (PFA) ve akrilamid toksik ve tahriş edicidir. Davlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) bu reaktifleri kullanılarak deneyler.

  1. (- 3 dakika ~ 2) solunum sona erene kadar izofluran ~ 1 ml ötenazi odasında hayvan kurban.
  2. (- 10 dakika 5....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynin yapısal organizasyonu görselleştirme morfolojisi ve bağlantı sağlık ve hastalık beyin fonksiyonlarını nasıl etkilediğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Optik takas teknikleri bize cohesively morfolojisi ve bağlantı incelemek için izin sağlam dokularda 3D görüntü hücre popülasyonu için mümkün kılar.

Hücreler beyindeki sinir bağlantı karmaşık bir desen ayrı kızdırmak için bir izin alt popülasyonlar için özel rehberle.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hidrojel gömülü dokularda (pasif CLARITY) pasif takas dokusunun büyük parçalar temizlenmesi için basit ve ucuz bir yöntemdir. Bu yaklaşım, özel ekipman gerektirmez ve kolay bir şekilde, sıcaklık kontrollü sallayıcı içinde gerçekleştirilebilir. Birkaç haftalık bir sürede içinde, örneğin bütün bir beyin ya da spinal kord bile büyük, çok miyelinli dokular, şeffaf ve mikroskopi için uygun olacaktır. Bu rapor, merkezi sinir sistemi doku temizleme odaklanmış olmasına rağmen, pasif AÇIKLIK herhangi bir dokuya uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma cömertçe Nörolojik Bozukluklar ve İnme (NIH / NINDS) hibe 1R01NS086981 ve Conrad N. Hilton Vakfı Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Biz konfokal mikroskobu ile onların çok değerli yardım için Dr Laurent Bentolila ve Dr Matthew Schibler teşekkür ederim. Biz AÇIKLIK forumu (http://forum.claritytechniques.org) katkıda bulunmuş olanlar teşekkür ederim. Biz özellikle bu büyüleyici tekniğini öğretmek onun laboratuvarını açılması için Dr. Karl Deisseroth teşekkür ederim. Yazarlar Beyin Haritalama Tıbbi Araştırma Örgütü, Beyin Haritalama Destekleme Vakfı, Pierson-Lovelace Vakfı, Ahmanson Vakfı, Capital Group Şirketleri ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x fosfat tamponlu salin (PBS)FisherBP399-1tamponları
%32 paraformaldehit (PFA)Elektron Mikroskobu Bilimleri15714-5perfüzyon ve hidrojel
2,2'-tiyodietanol (TDE)Sigma-Aldrich166782-500Gkırılma indisi eşleştirme çözeltisi
%40 akrilamidBio-Rad161-0140hidrojel
%2 bis-akrilamidBio-Rad161-0142hidrojel
VA-044 başlatıcıWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.VA044hidrojel
Borik asitSigma-AldrichB7901temizleme tamponu
Sodyum dodesil sülfat (SDS)FisherBP166-5temizleme tamponu
Sodyum hidroksitFisher55255-1tamponları
Sodyum azidSigma-Aldrich52002-100Gkoruyucu
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500Gtamponlar
HeparinSigma-AldrichH3393-50KUperfüzyon
Sodyum nitratFisherBP360-500perfüzyon
DAPIMoleküler ProblarD1306nükleer leke
99.9 izofluranPhoenix57319-559-06anestezik
Hidrokolorik asitFisherA1445-500tamponları
Cam alt tabakWillcoHBSB-5040Willco yemekleri
Yeniden kullanılabilir yapıştırıcıBostick371351Blu-Tack
Silikon elastomerWorld Precision InstrumentsKWIK-CASTKwik-Cast
Tüy bırakmayan mendilKimberly-Clark34120KimWipe
Fare beyin matrisiRobozSA-2175kesit dokusu
Matris bıçaklarıRobozRS-9887kesit dokusu
Peristaltik pompaCole-Parmer77122-24pefüzyon
Lazer taramalı konfokal mikroskopLeicaSP5mikroskobu
Görüntüleme yazılımıLeicaLAS AFmikroskobu
%

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical ClearingPassive CLARITYMouse Central Nervous SystemTissue TransparencyRefractive Index MatchingLipid RemovalHydrogel PolymerizationConfocal Microscopy2 2 ThiodiethanolImaging Chamber

Related Articles