Method Article

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

DOI:

10.3791/54025

⸱

June 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optik temizleme teknikleri, dokuların görselleştirilme biçiminde devrim yaratıyor. Bu raporda, daha tutarlı ve daha ucuz sonuçlar veren orijinal Clear Lipid değişimli Akrilamid hibritleştirilmiş Rijit Görüntüleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY) protokolünün modifikasyonlarını açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel olarak, doku görselleştirme, ilgilenilen dokunun seri olarak kesitlenmesini ve görüntülenmesini gerektirmiş, her doku kesitini benzersiz doğrusal olmayan deformasyonlara maruz bırakmış, kişinin merkezi sinir sistemindeki (CNS) hücresel morfolojiyi, dağılımı ve bağlantıyı değerlendirme yeteneğini önemli ölçüde engellemiştir. Bununla birlikte, optik temizleme teknikleri, dokuların görüntülenme şeklini değiştirmektedir. Bu yaklaşımlar, sağlam organ preparatlarının derinlemesine araştırılmasına izin vererek, sağlık ve hastalıktaki dokuların yapısal organizasyonu hakkında muazzam bir içgörü sağlar. Berrak Lipid Değişimli Akrilamid Hibritleştirilmiş Sert Görüntüleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY) gibi teknikler, ışık saçan lipitlerin serbestçe yayılmasına izin verirken önemli biyomolekülleri bağlayan bir matris sağlayarak bu amaca ulaşır. Lipid çıkarılması ve ardından kırılma indisi eşleştirmesi, dokuyu şeffaf hale getirir ve 3 boyutlu (3D) olarak kolayca görüntülenir. Bununla birlikte, orijinal CLARITY protokolünde kullanılan elektroforetik doku temizlemenin (ETC) başarılı bir şekilde uygulanması zor olabilir ve tescilli bir kırılma indeksi eşleştirme çözümünün kullanılması, tekniğin rutin olarak kullanılmasını pahalı hale getirir. Bu rapor, gelişmiş doku bütünlüğü için pasif CLARITY ile daha önce tanımlanmış bir kırılma indisi eşleştirme çözümü olan 2,2'-tiyodietanolü (TDE) birleştiren basit ve ucuz bir optik temizleme protokolünün uygulanmasını göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tam nöroanatomik yapıları görüntüleme yeteneği, sağlık ve hastalıkta beyni anlamak için son derece değerlidir. Geleneksel olarak, 3D görüntüleme, eksenel çözünürlüğü sağlamak ve derin anatomik yapıları görselleştirmek için doku kesiti gerektirir. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü veri kümeleri üretebilir, ancak karmaşık görüntü yeniden yapılandırma teknikleri gerektirir ve çok emek yoğundur. Sonuç olarak, küçük hacimli dokuların görüntülenmesi ile sınırlı kalmıştır1-3. Öte yandan optik kesit alma, floresan etiketli dokuların yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerinin oluşturulması için çok uygundur. Optik kesitleme doğası gereği üç boyutlu olduğundan, bir 3D görüntü hacmi üretmek için kapsamlı bir hesaplama gerektirmez. Bununla birlikte, ışık saçılımı ve doku opaklığı, dokuların optik olarak kesilebileceği derinliği sınırlar. Görüntüleme derinliği, lazer taramalı konfokal mikroskopide yaklaşık 150 μm ve iki foton uyarma mikroskobu4-8 kullanılarak 800 μm'den az ile sınırlıdır.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, yakın zamanda çeşitli optik temizleme teknikleri geliştirilmiş ve daha sonra sağlam dokuların derin mikroskobik görüntülenmesine izin vermek için daha da rafine edilmiştir. Sabit dokuları saydam hale getirmek için benzil alkol ve benzil benzoat (BABB) kullanımı en eski yaklaşımlardan biriydi9. Bununla birlikte, bu yaklaşım, numunelerdeki floresansın söndürülmesi ve yüksek derecede miyelinli yapıların eksik temizlenmesi ile sınırlıydı10. Solventle Temizlenmiş Organların 3D Görüntülenmesi (3DISCO) gibi bu tekniğin iyileştirmeleri, çok hızlı ve eksiksiz doku temizliğine yol açmıştır, ancak yine de floresan sinyallerinde, özellikle sarı floresan proteininde (YFP) hızlı bir kayıptan muzdariptir10. Sca/e11 ve SeeDB12 gibi su bazlı temizleme solüsyonları, floresan sinyalleri korur, ancak yüksek derecede miyelinli dokuları tamamen temizlemez. Şeffaf, Engelsiz Beyin Görüntüleme Kokteylleri ve Hesaplamalı analiz (CUBIC), daha önce geliştirilmiş su bazlı temizleme çözümlerinin sınırlamalarının üstesinden geliyor gibi görünen umut verici yeni bir optik temizleme teknolojisidir13. Diğer optik temizleme tekniklerinin aksine, Clear Lipid Değişimli Akrilamid Hibritleştirilmiş Sert Görüntüleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY)14 beyni, lipitleri bağlanmadan bırakırken proteinlere, nükleik asitlere ve küçük moleküllere yapısal bütünlük sağlayan gözenekli bir matris içine yerleştirir. Lipitler daha sonra elektroforetik olarak çıkarılır ve yaygın olarak bulunan teknikler kullanılarak kolayca görselleştirilebilen ve eşit derecede kolay bir şekilde incelenebilen optik olarak temizlenmiş bir beyinde doruğa ulaşır.

Elektroforetik doku temizleme (ETC), CLARITY'de hidrojel gömülü dokulardan lipitleri çıkarmak için kullanılır, ancak ETC'nin tutarlı bir şekilde uygulanması zor olabilir ve elektroforeze tabi dokular doku distorsiyonu, esmerleşme, floresan kaybı ve antikor reaktivitesi gösterebilir. Pasif lipid temizleme bu sınırlamaları önler, ancak temizleme sürelerinin15-17 artırılmasını gerektirir. Pasif temizleme, mevcut ETC aparatlarının sayısı ile sınırlı olmadığı için çok sayıda numunenin paralel olarak temizlenmesine de izin verir. Paraformaldehit konsantrasyonunun azaltılması ve hidrojelden bis-akrilamidin çıkarılması, daha fazla doku genişlemesi pahasına temizleme hızında büyük artışlara yol açmıştır16. Orijinal CLARITY tekniğinde kullanılan kırılma indisi eşleştirme çözümüne daha ucuz alternatifler geliştirilmiştir17-19. 2,2'-tiyodietanol (TDE), lipid giderimi sırasında meydana gelen doku genişlemesinin bir kısmını tersine çeviren ucuz ve hızlı bir beyin temizleme maddesidir18. Bu rapor, hidrojel gömülü dokunun pasif olarak temizlenmesini ve fare merkezi sinir sisteminin optik olarak temizlenmesi için oldukça tekrarlanabilir ve ucuz bir protokol üretmek için orijinal CLARITY tekniğine kırılma indisi eşleştirme çözümü olarak TDE'nin kullanımını içerir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kurallarına uygun olarak yapıldı. Thy1 YFP, PLP-EGFP PV-tdTomato farenin Bu deneyler için kullanılmıştır, ama floresan proteinleri eksprese bir farenin başarılı bir şekilde temizlenir ve görüntülenebilir.

1. Doku Hazırlanması

Dikkat: Paraformaldehyde (PFA) ve akrilamid toksik ve tahriş edicidir. Davlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) bu reaktifleri kullanılarak deneyler.

  1. (- 3 dakika ~ 2) solunum sona erene kadar izofluran ~ 1 ml ötenazi odasında hayvan kurban.
  2. (- 10 dakika 5), kan dokulardan temizlenir kadar ~ 5 ml ayarlanmış bir peristaltik pompa kullanımı / dak intrakardiyak, 4 ° C de perfüzyon çözeltisi (Tablo 1) ile fare perfüze edilmesi için.
  3. Fiksatif çözüm için perfüzat değiştirin (Tablo 1)(- 10 dakika 5), ​​4 ° C'de, boyun ve kuyruk anlamlı katılaşana dek.
  4. perfüzyon End ve hayvan başını kesmek. Dikkatle ilk kafatası çevreleyen bağ dokusu çıkarılması ve sonra da kafatasının ventral yüzeyinden kemik kaldırılması ve 20 de açıklandığı gibi, (Şekil 1a) beynini kaldırarak kafatası beyin teşrih.
    Not: beyincik flocculonodular lobları ve koku ampuller çevreleyen kemiğin çıkarılması için özel bakım verir.
    1. Nazikçe omurilik ve vertebral kolon arasında ince bir keskin makas ucu sokarak ve 21 de açıklandığı gibi, uzak bireysel omurga segmentleri keserek vertebra sütundan omurilik parçalara ayır.
  5. plastik bir fare beyin matrisi içine yerleştirerek ve bir matris bıçak ile orta hat boyunca keserek beyin Hemisect.
  6. santrifüj küvet 50 ml ayırmak için her yarımkürede ve omurilik ekleES ~ hidrojel çözeltisi (Tablo 1) 40 ml. Bu noktada ileri kapaktan alüminyum folyo ile tüpler sonraki tüm adımları sırasında fluorophores korumak için.
  7. yumuşak 7 gün boyunca (~ 30 rpm) çalkalayarak 4 ° C'de hidrojel örneğini içeren tüp inkübe edin.

2. Polimerizasyon

  1. Santrifüj tüpü içinde ~ hidrojelin 25 ml numune ve koruyucu, ~ hidrojelin 25 mi atın.
  2. kapağı çıkarmadan ve kurutucu kavanoza santrifüj tüpü yerleştirilmesi ve bir vakum kavanozu bağlayarak örnek oksilenlendirilmesi. çözüm ve form kabarcıklar çıkmaya çözünmüş gazlar izin için en az 10 dakika süreyle vakum uygulamak. Yavaşça kabarcıklarını çıkarmak için sallayın.
  3. 3 dakika - 2 üzerinde% 100 azot gazı ile desiccator kavanoza vakum değiştirin. basıncı (kurutucu kavanozun üst açılabilir kez) eşitleyen sonra, hızlı bir şekilde oksijen reintroduction önlemek için tüp kap.
  4. PolimerPolimerizasyon işlemi tamamlanana kadar, 3 saat için 37 ° C su banyosu içinde örnek tüpü yerleştirerek hidrojel ize. Polimerize hidrojel jel benzeri bir kıvam (Şekil 1b) alacak. Not: üst polimerleşmemiş hidrojel az miktarda kabul edilebilir.
  5. Daha sonra, santrifüj tüpüne gelen polimerize örneği kaldırmak örnekten fazla hidrojel kesip bir spatula kullanın.
  6. silip bir tüy bırakmayan üzerinde örnek yerleştirerek ve yavaşça örnek üzerinde polimerize hidrojel, sadece ince bir tabaka geride bırakarak, sürtünme ve üzerinde doku yuvarlayarak kalan hidrojel çıkarın.

3. Lipit Kaldırma

Not: Lipid temizlenir doku kırılgan, dikkatli olun. tüp boşaltırken örnek kaybetmemek için bir hücre süzgeç kullanın. Ayrıca, örnek kırılma indisini uyumlu hale işlemi sırasında ters olabilir şişen, ancak, temizleme işlemi boyunca şişer.

Dikkat: Sodium dodesil sülfat (SDS) ve borik asit tahriş edicidir. Davlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) ile onları kullanan deneyler.

  1. Temiz bir 50 ml santrifüj tüpüne polimerize örnek aktarın ve tampon (Tablo 1) temizleme 45 ilave edin. hafifçe çalkalanarak 45 ° C (~ 30 rpm) inkübe edilir. kimyasal atık içine kullanılan takas tampon dökülen ve taze takas tampon ~ 45 ml ekleyerek ilk 7 gün boyunca günde tampon değiştirin. florofor korumak için alüminyum folyo ile kaplanmış numunelerin içeren santrifüj tüplerini muhafaza edin.
  2. 3 gün - ilk 7 gün sonra, her 2 40 ° C ve döviz takas tamponu de örnek kuluçkaya yatmaktadır. Tüm lipidler çözünmüş ve doku şeffaflık (Şekil 1c) ulaşıncaya kadar takas devam edin. Bir fare beyin yarımkürede 6 hafta ve 2 - - Bir omurilik için 4 hafta Bu 4 olacak.
  3. Doku temizlendikten sonra, aktarmakYeni bir 50 ml santrifüj tüpüne numune ve kalıntı SDS kaldırmak için 24 saat boyunca hafif bir çalkalama (~ 30 rpm) 40 ° C'de PBST (Tablo 1) 4 kez yıkayın.

4. Moleküler Boyama

Dikkat: 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole dihidroklorür (DAPI) tahriş edici ve davlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) ile yapılmalıdır kullanan herhangi deneyler olduğunu.

  1. Temiz bir 15 ml santrifüj tüpüne örnek transferi ve 1 x PBST içinde 1 ug / ml DAPI, pH 7.5 ile doldurun. 24 saat oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. florofor korumak için alüminyum folyo ile kaplanmış numunelerin içeren santrifüj tüplerini muhafaza edin.
  2. en az 6 saat / yıkama için oda sıcaklığında PBST içinde 3 kez yıkanır.

5. Refraktif İndeks Eşleştirme

Dikkat: sh 2,2'-Thiodiethanol (TDE) tahriş edicidir ve herhangi deneyler onu kullananDavlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) ile yapılabilir ould.

  1. Temiz bir 15 ml santrifüj tüpüne örnek aktarın ve% 30 1 x PBS içinde (hac / hac) TDE, pH 7.5 ile doldurun. 24 saat boyunca hafifçe çalkalanarak 40 ° C (~ 30 rpm) inkübe edilir.
  2. 1 x PBS, pH 7.5 içinde% 63 (h / h) TDE Exchange% 30 TDE. yumuşak, 24 saat boyunca çalkalanarak 40 ° C'de inkübe edin.
    Not: Örnek, yaklaşık orijinal boyutuna geri çekilmek olacaktır.
  3. düz ve temiz bir yüzey üzerine numunenin kalınlığından sadece biraz daha düzgün bir çapa sahip bir silindirin içine yeniden bir yapışkan parça döndürün.
  4. açık uçlu daire yeniden kullanılabilir yapışkan silindiri Lay (~ üst kısmında küçük bir açıklığı olan 25 mm iç çap) 40 mm cam alt çanak. düzeltmeler yapılması gerekiyorsa, cam silindir kaldırmak ve bir jilet ile kesti.
  5. ile yeniden yapıştırıcı ile cam arasında bir sızdırmazlık oluşturmak için bir P1000 pipet kullanınsilindirin dış kenarı etrafında yuvarlayarak.
  6. Yeri ~ 100 ul% 63 cam tabak üzerine TDE ve yeniden yapıştırıcı daire içinde cam yüzeyini kapsayacak şekilde yayıldı.
  7. Bir spatula ile dikkatlice kabarcıkları oluşturmak için özen çemberin ortasında numuneyi.
  8. hemen ardından tekrar kullanılabilir yapıştırıcı üzerinde 40 mm yuvarlak cam kapak yerleştirin, doğrudan numune üzerine% 63 TDE başka 100 ul pipetle.
  9. cam kapak örneği ile temas yapmış kadar indeksi, orta ve iki elin yüzük parmağı kullanarak, dikkatli dairenin çevresinde basın.
  10. Yavaş yavaş bir yüzeye karşı duran dik konuma cam alt yemek getirmek Çözelti en küçük açıklığı ulaşana kadar daha sonra bir pipet yardımıyla% 63 TDE ekleyin. ücretsiz bir çözüm camına damla kalmaması pipet kapalı kuru silin bir tüy bırakmayan kullanın. odasında kabarcıkları önlemek için, pipet tüm yol boş asla.
  11. içinküçük açma, daire içine ve kapalı bir odasını oluşturmak için silikon elastomer ekleyin. o görüntüleme önce kurumaları için 5 dakika bekleyin.

6. Mikroskopi

Dikkat: konfokal, tek düzlem aydınlatma ve ışık levha mikroskopi kullanılan lazerler çok güçlü ve körlüğe neden olabilir. lazerler kullanan herhangi deneyler geniş eğitimden sonra ve büyük bir dikkatle ve uygun göz koruması ile yapılmalıdır.

  1. Bir lazer tarama konfokal mikroskop sahnede iç numune ile görüntüleme odasına yerleştirin.
  2. görüntüleme yazılımı açın (Malzeme Tablo). Argon uyarma lazer açmak için, daha sonra programın lazer simgesinin üstündeki yapılandırma sekmesini tıklatın. lazer güç ve% 30 slayt ölçekli taşımak için argon yanındaki kutuyu işaretleyin. işaretçi yavaşça seçilen pozisyona ısınmak gözlemleyin.
    1. üstündeki acquire sekmesine dönün. Büyük kutusuna "Işın Yolu Ayarları &# 34; / Yük gitmek kutusu ayarı kaydetmek ve görüntü YFP (527 nm) için uygun bir dalga boyu kanalı seçmek için açılır menüyü seçin.
  3. kanal ayarları kutusunun altında: "Mevcut nesne objektif" etiketli kırmızı köprü bularak görüntüleme için uygun hedefleri seçin. sekmesini tıklayarak mevcut tüm hedefleri açılır ve bir seçim taret otomatik olarak dönecektir.
    1. Kullanım amaçları (örn., 10X), büyük bir çalışma mesafesi ile (doku kalınlığından daha büyük, yansıması için, örneğin 11 mm) ve geniş bir sayısal açıklık (örn., 0.3) düzlem resim çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak ve en aza indirmek için optik kesit kalınlığı.
  4. 1024 x 1,024 "biçim" denilen toplama matriks ayarlamak için pencereyi, ya da objektif lateral çözünürlük sınırı için uygun bir değer: "çözünürlük XY" açık, açılır menüler sol sütun üzerinde. (Mümkün olduğunca düşük yakınlaştırma faktörünü ayarlamak gibi., 10,7).
  5. Aynı pencerede, buna göre bireysel olarak etiketli menüleri aşağı bırakarak 8 hat ortalama ve 1 çerçeve ortalama parametreleri ayarlayın. hızlı elde edilmesi için yüksek bir sinyal-gürültü oranı ve küçük değerler için büyük değerler kullanın.
    Not: 8 hat ortalamaları ve 1 kare ortalama yaklaşık 4 saat içinde bir fare beyin yarımkürede yüksek kaliteli görüntüler elde edecektir.
  6. sahne kontrollerini kullanarak örnek bulun. temsili bir alan görünür sonra, kazanç ve ofset ayarlayın.
    kazanç ve doku tipi, fluorophores dayalı ölçüde değişecektir ofset ve / veya anatomik özellik görüntülü Not:. YFP için kazanç için 780 760 den ve -1.0 ofset için -1.5 değerleri ayarlayın.
  7. "Karo tarama" seçin ve ilgi bölgenin sınırlarını belirleyin. z-yığının Set alt ve üst sınırları elde edilecek. Amaç optik bölüm çözünürlük sınırına dayalı optik bölümün kalınlığı ayarlayın.
    Not: Bir amaç enoptik bölüm çözünürlük sınırı öncelikle sayısal açıklık ile tanımlanır. otomatik olarak objektif bir değer uygun olan hesaplar en mikroskop kontrol yazılımı kullanılmaktadır. 0.3 sayısal diyafram ile 10X objektif için bu yaklaşık 11 mikron olacaktır.
  8. edinimi başlatın.
    Not: Bu, birden çok saat sürebilir.
  9. özel ilgi bölgelerinden daha yüksek büyütme hedefleri kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüler toplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynin yapısal organizasyonu görselleştirme morfolojisi ve bağlantı sağlık ve hastalık beyin fonksiyonlarını nasıl etkilediğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Optik takas teknikleri bize cohesively morfolojisi ve bağlantı incelemek için izin sağlam dokularda 3D görüntü hücre popülasyonu için mümkün kılar.

Hücreler beyindeki sinir bağlantı karmaşık bir desen ayrı kızdırmak için bir izin alt popülasyonlar için özel rehberle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hidrojel gömülü dokularda (pasif CLARITY) pasif takas dokusunun büyük parçalar temizlenmesi için basit ve ucuz bir yöntemdir. Bu yaklaşım, özel ekipman gerektirmez ve kolay bir şekilde, sıcaklık kontrollü sallayıcı içinde gerçekleştirilebilir. Birkaç haftalık bir sürede içinde, örneğin bütün bir beyin ya da spinal kord bile büyük, çok miyelinli dokular, şeffaf ve mikroskopi için uygun olacaktır. Bu rapor, merkezi sinir sistemi doku temizleme odaklanmış olmasına rağmen, pasif AÇIKLIK herhangi bir dokuya uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma cömertçe Nörolojik Bozukluklar ve İnme (NIH / NINDS) hibe 1R01NS086981 ve Conrad N. Hilton Vakfı Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Biz konfokal mikroskobu ile onların çok değerli yardım için Dr Laurent Bentolila ve Dr Matthew Schibler teşekkür ederim. Biz AÇIKLIK forumu (http://forum.claritytechniques.org) katkıda bulunmuş olanlar teşekkür ederim. Biz özellikle bu büyüleyici tekniğini öğretmek onun laboratuvarını açılması için Dr. Karl Deisseroth teşekkür ederim. Yazarlar Beyin Haritalama Tıbbi Araştırma Örgütü, Beyin Haritalama Destekleme Vakfı, Pierson-Lovelace Vakfı, Ahmanson Vakfı, Capital Group Şirketleri Hayırsever Vakfı, William M. ve Linda R. Dietel Hayırsever Fonu ve Northstar Fonundan cömert destek için minnettarız . Bu yayında bildirilen araştırma da kısmen Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi tarafından ve Ulusun Başkanlığınca desteklenenÖdül numaraları C06RR012169, C06RR015431 ve S10OD011939 altında Sağlık al Enstitüleri. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x fosfat tamponlu salin (PBS)FisherBP399-1tamponları
%32 paraformaldehit (PFA)Elektron Mikroskobu Bilimleri15714-5perfüzyon ve hidrojel
2,2'-tiyodietanol (TDE)Sigma-Aldrich166782-500Gkırılma indisi eşleştirme çözeltisi
%40 akrilamidBio-Rad161-0140hidrojel
%2 bis-akrilamidBio-Rad161-0142hidrojel
VA-044 başlatıcıWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.VA044hidrojel
Borik asitSigma-AldrichB7901temizleme tamponu
Sodyum dodesil sülfat (SDS)FisherBP166-5temizleme tamponu
Sodyum hidroksitFisher55255-1tamponları
Sodyum azidSigma-Aldrich52002-100Gkoruyucu
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500Gtamponlar
HeparinSigma-AldrichH3393-50KUperfüzyon
Sodyum nitratFisherBP360-500perfüzyon
DAPIMoleküler ProblarD1306nükleer leke
99.9 izofluranPhoenix57319-559-06anestezik
Hidrokolorik asitFisherA1445-500tamponları
Cam alt tabakWillcoHBSB-5040Willco yemekleri
Yeniden kullanılabilir yapıştırıcıBostick371351Blu-Tack
Silikon elastomerWorld Precision InstrumentsKWIK-CASTKwik-Cast
Tüy bırakmayan mendilKimberly-Clark34120KimWipe
Fare beyin matrisiRobozSA-2175kesit dokusu
Matris bıçaklarıRobozRS-9887kesit dokusu
Peristaltik pompaCole-Parmer77122-24pefüzyon
Lazer taramalı konfokal mikroskopLeicaSP5mikroskobu
Görüntüleme yazılımıLeicaLAS AFmikroskobu
%

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
  3. MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
  4. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
  5. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
  6. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
  7. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
  8. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
  9. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  12. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  15. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
  16. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
  17. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  18. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808(2015).
  19. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  20. Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848(2012).
  21. Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580(2015).
  22. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
  23. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical ClearingPassive CLARITYMouse Central Nervous SystemTissue TransparencyRefractive Index MatchingLipid RemovalHydrogel PolymerizationConfocal Microscopy2 2 ThiodiethanolImaging Chamber

Related Articles