Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

8.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54026

⸱

9 Haziran 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

Bu makalede

Özet

Glioblastoma multiforme'nin hasta kaynaklı ksenogreftleri, 3D insan biyojel kültür sistemi kullanılarak canlı mikrotümörlere minyatürleştirilebilir. Bu in vivo benzeri 3D tümör testi, kinom analizi de dahil olmak üzere ilaç yanıt testi ve moleküler profilleme için uygundur.

Özet

Kanserleri modellemek için hastadan türetilmiş ksenogreftlerin kullanılması, kanser biyolojisi ve ilaç duyarlılığı hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ancak, zaman alıcı, pahalı ve emek yoğundurlar. Bu engellerin üstesinden gelmek için, birçok araştırma grubu kanser hücrelerinin küresel kültürlerine yöneldi. Yararlı olsa da, tümör sferoidleri veya agregatları, in vivo olarak bulunan hücre-matris etkileşimlerini tekrarlamaz. Bu nedenle, hücre dışı bir matris iskelesi kullanan üç boyutlu (3D) kültür yaklaşımları, araştırma için daha gerçekçi bir model sistemi sağlar. Subkutan veya intrakraniyal ksenogreftlerden başlayarak, tümör dokusu, kanser kök hücre nörosferlerine benzer şekilde tek hücreli bir süspansiyona ayrışır. Bu hücreler daha sonra çok sayıda mikrotümör oluşturmak için insan kaynaklı bir hücre dışı matris olan 3D insan biyojeli içine gömülür. İlginç bir şekilde, mikrotümörler yaklaşık bir ay boyunca yüksek canlılıkla kültürlenebilir ve 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) gibi standart sitotoksisite testleri kullanılarak ilaç yanıt testi için kullanılabilir ve Calcein-kullanılarak canlı hücre görüntüleme. Ayrıca, immünohistokimya yoluyla analiz edilebilir veya burada da ayrıntılı olarak açıklanan dizi tabanlı yüksek verimli kinom profilleme gibi moleküler profilleme için hasat edilebilirler. Bu nedenle 3D mikrotümörler, in vivo tümör biyolojisini geleneksel yaklaşımlardan daha yakından kopyalayabilen çok yönlü, yüksek verimli bir model sistemini temsil eder.

Giriş

En sık rastlanan primer intrakranial malign beyin tümörleri evre III astrositom ve Evre IV glioblastoma multiforme (glioblastoma veya GBM) bulunmaktadır. ABD 1-3 GBM için geçerli tedavilerle 15 ay - Bu tümörler 12 arasında ortalama bir yıllık sağkalım yoksul prognoz sunuyoruz. Çok modelli tedaviler temozolomid (TMZ) ve kinaz hedefli ajanlar da dahil olmak üzere cerrahi, radyasyon ve kemoterapi yer alıyor. Kinaz sinyal sık Epidermal Büyüme Faktörü reseptörü (EGFR), Trombosit Türevli Büyüme Faktörü Alıcısının (PDGFR) artışlar sinyal, artan Fosfatidil-inositol-3 kinaz (PI3K) ve amplifikasyon ile tümör alt-veya aktive mutasyonlar da dahil olmak üzere, GBM'de düzensiz olan Vasküler Endotel Büyüme Faktörü Alıcısının (VEGFR) hem de diğer kinaz tahrik yollar 4-6 ile anjiyojenik sinyal destekleyici tümörü. Vitro ve in vivo modelleri sık sık bu temsili değişiklikleri kaybetmek Güncel 7. Buna ek olarak, genetik profilleme genetik ve epigenetik değişiklikler her zaman hedefleme ajanları çoğu kinaz doğrudan hareket protein aktivite düzeyi, değişiklik tahmin yok ve eylem diğer mekanizmalar ile tedaviler nerede hareket edebilirler gerçeğini yansıtıyor olabilir beklenen faydalar teklif yok dolaylı olarak.

sonsuza pasajlandı edilebilir geleneksel ölümsüzleştirdi hücre hattı uzun nedeniyle bakım ve tekrarlanabilirlik kendi kolaylığı uyuşturucu testi için standart olmuştur. Ancak, bu model hızlı orijinal tümörden önemli ölçüde farklıdır hücrelerin büyümesi için seçer yüksek besin (ve yapay) bir büyüme ortamına muzdarip. Bunun gibi, hastanın mevcut olduğu gibi daha karmaşık tümör biyolojik sistemi yansıtacak daha gerçekçi bir model sistemlerinin geliştirilmesinde önemli bir ilgi olmuştur. Tümör ksenogrefleri farelerde yetişen bir primer tümörün ( "xenoline," hasta-türevi xenograftlarının veya PDX) yazarlara doğrudan geliştirilenOnlar daha güvenilir klinik başarısını tahmin etmek. 8 daha yansıtıcı biyoloji rağmen keçe gibi de özellikle kanser tedavi ortamında bir daha yansıtıcı bir model sistem, bu modeller pahalıdır ve kurmak ve sürdürmek zordur. Ayrıca, yüksek verimli çalışmalar için uygun değildir. Gerek daha daha doğru genetik belirteçleri vekil değil, birincil tümörlerde moleküler değişikliklerin yansıtmak ve profil ve kinaz aktivitesinin doğrudan önlemler kullanarak bu modelleri test biyolojik modellerin geliştirilmesi, açıktır.

Iki-boyutlu (2B) tek tabakalı kültürler farklı olarak, 3 boyutlu veya çok-hücreli deney modelleri daha fazla fizyolojik olarak ilgili son noktaları 9-11 sağlayabilir kabul edilmektedir. Ortak 3D kültür matris kaplı mikrotaşıyıcılar ve hücre sfero oluşumunu içeren yaklaşımlar. Tümör Sferoidler spinner şişesi, PHEMA plaka kullanarak ve bırak teknikleri asılı hücresel toplama yoluyla elde edilebilir. t Sınırlamalarhese yaklaşımlar şunlardır: bazı hücreler karışık hücre tipleri ile istikrarlı parçacıklarının, değişkenliği büyüme ve zorlukları oluşturmak için yetersizlik. Seçenek olarak ise, bir çok sentetik (hidrojel polimer) ve Engelbreth-Holm-Swarm matrisler 3D kültür için geliştirilmiş olan fare sarkom den (EHS) matris, bovin kolajen) 12-14 çalışmalar hayvan türevi. Farenin EHS matrisi yaygın olarak kullanılan, ancak in vitro ve in vivo 15 hücre büyümesini ve farklılaşmasını teşvik ettiği bilinir.

3D tümör biyolojisi çoğaltmak için, bir insan biyomatris sistemi Dr. Raj Singh ve ark., 16 tarafından geliştirilmiştir. Doğal, büyüme faktörü içermeyen insan BioGel birden fazla hücre tipleri uzun süreli yetiştirme destek 3D kültür iskeleleri (boncuklar, diskler) izin verir. 3D insan BioGel kültür tasarımları bir dizi tümör büyümesi, yapışma, anjiyogenez ve işgali özelliklerini incelemek için kurulmuştur. Avantajları ve insan BIOGEL özellikleri ortak karşılaştırıldığındafare EHS jeller Tablo 1 ve Tablo 2'de özetlenmiştir.

Kaynak: İnsan Amnions (toplanan doku)
Patojen içermeyen, IRB muaf / onaylı
ECM doğa: Sigara denatüre BIOGEL (GLP-üretim)
Anahtar
bileşenleri: 		Col-I (% 38), laminin (% 22), col-IV (% 20), col-III (% 7), entactin ve HSPG (<% 3)
GF-serbest: Saptanamaz EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-anjiyogenik, toksik olmayan)

Tablo 1: Ortak EHS Gels karşılaştırıldığında İnsan BIOGEL özellikleri.

İnsan BIOGEL EHS jeller
Doğal insan matris Sulandırılarak fare matrisi
Kontrollü hücre büyümesi farklılaşma hücre büyümesini ve farklılaşmasını teşvik edebilir
Fizyolojik gen ekspresyonu Değişken gen sentezleme
3D doku gibi kültür modeli Plaka tabanlı kültürü modeli

Tablo 2: Ortak EHS Gels karşılaştırıldığında İnsan BIOGEL avantajları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm ksenograft tedavi değerlendirmeler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokole glioblastoma için ortotopik tümör modeli kullanılarak yapılmıştır.

Hasta türetilen GBM Xenograftlarında Hücreleri 1. İzolasyon

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. 5 mg / ml steril filtre bir konsantrasyona, steril su içinde kolajenaz-re-oluşturmaktadır. -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler halinde saklayın (nihai konsantrasyon 100 mi enzim çözeltisi içerisinde 50 ug / ml).
    2. 2 ml 100 ug Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) çözündürülür steril fosfat tamponlu tuz (PBS) bulunur. 100 ul (5 ug / 100 ul), 10 ng / ml'lik son bir konsantrasyon için, -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın.
    3. 2 ml 100 ug FGF-P, steril PBS içinde çözülür. 100 ul (5 ug / 100 ul), 10 ng / ml'lik son bir konsantrasyon için, -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın.
    4. Neurobasal Med aşağıdaki bir 500 ml şişe ekleIA (NBM) Tam NBM hazırlanması: 10 ml B-27 ek vitamin A olmadan 5 mi N2 takviyesi, 100 ul EGF 100 ul fibroblast büyüme faktörü (FGF) -Basic, 5 mi, amfoterisin B, 0.5 ml gentamisin, 5 mi L-glutamin.
    5. birleştirerek yeni enzim çözeltisinin hazırlanması: 98.5 ml PBS, 1 mi kolajenaz-1, 0.5 mi 10x tripsin / EDTA ile yıkandı ve 0.22 um gözenekli filtreden süzülerek sterilize edilir.
    6. Hazırlama ya da küçük bir hacmi, steril ve Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), kalsiyum veya magnezyum olmaksızın% 7 cenin sığır serumu (FBS) ile 1X PBS ile / F12 hücre kültür ortamı elde edin.
  2. tümör Ayrıştırma
    Not: Daha önce ele gelen bir tümör kitlesi için sağ etek içinde tümör hücreleri enjekte edilmiş ve izin verilen Atimik nu / nu fare, bu prosedür gereklidir. Burada gösterilen örneklerde, hastanın türetilmiş ksenograft GBM hücrelerinin, JX10 ve JX12 17 kullanılır.
    1. % 2 klorheksidin püskürtülerek çalışma alanını sterilize ve çalışma alanı zekâ kurmaktek kullanımlık mandren, forseps, neşter, cam Petri kabı, enzim çözeltisi, PBS ve klorheksidin (Şekil 2A bakınız) da dahil olmak üzere h gerekli aletleri / gereçler.
    2. bir kanadını tümör barındıran fare / fareler Euthanize. % 30 CO 2 kullanılarak CO 2% 20 / dk deplasman oranı hedefliyoruz. Fare solunum tutuklama gösterir sonra, yaklaşık 1 dakika (genellikle 3 dakika toplam) için CO 2 akışını sağlamak. Fareler bölmesinden çıkarılır ve servikal dislokasyon ikincil ötanazi teyidi olarak gerçekleştirilir. Cildi sterilize etmek için% 3 klorheksidin ile hayvan püskürtün.
    3. Fare sabit tutarken, yapmak yarı dairesel deri kesi ~ tümör kitlesi için kranial başlayan ve etrafında fare göbek doğru incising ve 11. bıçak ile steril tek kullanımlık neşter kullanılarak tümör kitlesi (yan implante tümör) 1.5 cm kaudal ucu.
    4. kesi kaudal ucunda hafif çekiş parmaklarını kullanarak tümör kitlesi üzerindeki deriyi yansıtır ve daha sonra cilt üzerinde itmektümör dokunmadan en iyi erişim için tümörün yükseltmesine yüzey (Şekil 2B bakınız).
    5. Yavaşça periton duvar ve deriden serbest tümör kütlesi (Şekil 2C bakınız) için forseps ile künt diseksiyon kullanın.
    6. steril cam Petri kabı ve düzgün karkas atmak ve bir kenara bu araçların koyun (kıyma esnasında kırılma önlemek için plastik yemekleri KULLANMAYIN) için forseps ile Aktarım tümör kitlesi.
    7. Steril araçların yeni bir dizi kullanın nekrotik doku ve membranöz konak bağ dokusu kapsayan tümör tümör dokusu debridman (11. bıçak, yarı kavisli forseps ile neşter).
    8. bir karıştırma çubuğuna sahip olan steril havalandırılmış-tripsinize şişede 15 mi enzim çözeltisi yerleştirin ve kaputu yavaş karıştırma başlatıldı.
    9. (Dökmek veya PBS ile durulayın için şırınga kullanabilirsiniz) aşırı kan çıkarmak için steril PBS ile 5 kez - steril bir cam Petri kabındaki, hasat tümörler 3 yıkayın. Yavaşça çanak ve pipetlemeyin eğin veya yıkama malzemesi aspire. kıyma finely iki # 11 neşter bıçak kullanarak (Şekil 2D bakınız).
    10. 3 kez - yavaşça yukarı ve aşağı kıyılmış tümör ve pipet 2 enzim çözeltisi 14 ml ekleyin. Aktarım şişede tripsinize-havalandırılmış ve 20 dakika boyunca yavaş yavaş karıştırılmıştır. Aşama 1.2.11 tripsin etkisiz hale getirmek için, her 1.5 ml FBS eklenerek 5 ila 50 ml konik tüp hazırlayın.
    11. 20 dakika sonra tripsinize şişeye hücre çözeltisi 14 ml toplar ve FBS ile bir tüp ekleyin. şişe ve karıştırmaya devam etmek için 14 ml taze enzim çözeltisi ekleyin.
    12. Santrifüj oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 150 x g'de hücreler toplandı ve süpernatan atılır. , Pelet tam NBM 45 ml ekleyin hafifçe karıştırın ve serum çalkalamak için santrifüj tekrarlayın. 5ml tam NBM pelet yeniden askıya ve buz üzerinde tutun.
    13. Buz üzerinde, tek bir konik bir tüp içinde Hasat hücreleri birleştiren 5 hasat toplam tekrar hücre hasat adım.
    14. 50 ml konik bir tüp üzerine 40 mikron hücre süzgeci yerleştirin. Hazırlık tO ile DMEM / F12 +% 7 FBS, 10 ml geçen ve daha sonra 10 ml PBS ile yıkanarak süzgeç hücre.
    15. Yavaş yavaş o (Şekil 2M bakınız) aracılığıyla damla izin süzgeç hücre süspansiyonu ekleyin. Yavaşça herhangi vakum kırmak ve asma hücreler serbestçe geçmesine izin vermek için her yeni ek arasında hücre süzgecinden sekmesini kaldırın (Şekil 2N bakınız).
    16. Yukarıda süzüldü hücre süspansiyonu santrifüj. tam NBM 10 ml yeniden askıya ve% 0.04 numuneler Tripan mavisini ve hemasitometre kullanarak canlı hücreler toplam sayısını belirlemek için sayım. microtumor nesil kadar buz üzerinde hücreleri tutun.

2. Alternatif Doku Ayrıştırma Protokolü

  1. Doku ayıracı ve parçalanma sistemi otomatik.
    1. Program "Tümör _02_02" basın başlangıç ​​seçin ve 32 saniye çalıştırın, hücresel dissociator içine parçalanma tüp yerleştirin. Transfer borusu, 40 dakika için 37 ° C inkübatör, yer döndürücüye.
    2. Santrifüj oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 150 x g'de hücreleri süspanse edildi ve süpernatant atılır. hücreler santrifüj birlikte, hücre süspansiyonu işlemi için de reaktifler ayarlayın. 10 mi serumsuz NBM ve yavaşça çiğnemek süspansiyonu ekleyin.
    3. 30 x 10 6 canlı hücreleri (~ 0.3 mi) - Santrifüj işleminden sonra, ~ 10 ihtiva eden bir hücre pelletini elde edin. (Şekil 2O) 10 mi serumsuz NBM pelet yeniden kullanıma. dışlama testi ile canlı hücreler belirlenmesi (Adım 3.2.2 bakınız).

3. Microtumor Nesil

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. 1.1.4 gibi tam NBM hazırlayın ve iç protokol uyarınca (3 mg / ml HDHG) nötralize Yüksek Yoğunluklu insan BIOGEL (HuBiogel) hazırlar. Benzer BioGel matrisler de kullanılabilir.
  2. Microtumor üretimi ve kültür
    1. buz üzerinde tam NBM tek bir hücre süspansiyonu gibi taze ayrışmış PDX hücre elde.
    2. hücreyi su Mixtripan mavisi çözeltisi (PBS içinde% 0.4) ve eşit hacimde spension tripan mavisiyle çıkarma 18 ile hücre sayısı ve yaşama kabiliyetinin saptanması için hemasitometre kullanarak analiz eder. 50.000 hücreleri üretmek için gerekli hacim / Kaldır microtumor hacim = (50,000 hücre / tümör * # tümörler) / (canlı hücre / 1 ml saymak) ve taze bir konik tüp içine koyun nerede.
    3. Oda sıcaklığında, 8 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj ile hücreler konsantre edilir. Süpernatant atılır ve FBS içinde 1 kısım hücreleri ve 4 parça HDHG bir oranı ile buz gibi soğuk çözelti ile HDHG hücre pelletini.
    4. microtumors (2 mm'lik boncuklar 50,000 hücre içeren) üretmek için (hidrofobik kaplama ile), 96-pin çelik plaka üzerine iğneli hücre HDHG karışımı başına 10 ul dağıtmak için bir elektronik çok kanallı pipet kullanın.
    5. Boncuk gelate 15 dakika boyunca doku kültür inkübatörü (37 ° C, nemlendirilmiş,% 5 CO2,) içinde 3B tümör boncuk yerleştirin.
    6. jelleşme sonra (10 u microtumors aktarmak, Elektronik çok kanallı pipet ve özel iğne cihazını kullanmak sureti ile NBM içeren özel bir süspansiyon kültürü odasının (50 mi) ya da büyük hacimli kültür kabı (10 cm L)).
    7. 1 sonra - doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 günlük, 50 ul NBM / oyuk pipet dağıtma geniş ağız kullanarak yerine çeşitli deney ve analiz protokolleri içeren 96-çukurlu kültür plakalarına microtumors aktarın.
  3. İlaç Tedavisi ve microtumors Bakım
    1. uyuşturucu testi için son konsantrasyonları seçin.
      Not: İlaç 2B kültür etkinliği bilinen durumunda, seçme 2x orta dozu konsantrasyonu IC50 üzerinde ve altında 5 doz seviyesi toplam seri seyreltmeler 3 kat seçin. IC50 2B, kültürdeki ilaç 9 uM Örneğin, 54 uM, ve ilaç testleri için nihai konsantrasyon olarak 162 uM 2 uM, 6 uM, 18 uM seçin.
    2. dimetil sulfoxi komple NBM 2x ilaç dozlama çözeltisi hazırlayınde (DMSO) stok. 5 doz, 3 kat seri seyreltme hazırlanması için% 1 DMSO ortam içinde dozlama çözeltisi ile seyreltilir.
    3. % 0.5 nihai bir DMSO konsantrasyonu elde etmek için iyi bir deney plakalarında 50 ul ihtiva eden microtumor Dozaj çözeltisi 50 ul ekle. 3.3.1 belirlenen her ilaç dozunda her tekrarında (örneğin, 4) için tekrarlayın.
    4. 37 ° C kültürleri bakımı,% 5 CO2, 1 nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörü - 14 gün. Yukarıdaki gibi medya ve ilaç çözeltisinin yenileyerek, haftada iki kez yem kültürleri.

4. Morfolojik ve Microtumors Fenotipik Analizi

  1. Standart canlı hücre boyama kullanarak microtumors hücre morfolojisi belirleyin.
    1. DMSO Calcein-AM 1 mM stok hazırlayın. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
    2. İstenen kültür aralıklarında (1, 7 ve 14 gün) 'de, 1 uM nihai konsantrasyon 96 oyuklu plakaya (Ca / Mg) olmadan PBS içinde hazırlanmış Calcein-AM çözeltisi ilave edilir.
    3. tasarlamak2X, 4X bir floresans mikroskobu kullanılarak 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör ve görüntüdeki 20 dakika ve 10X (eksitasyon: 450-490 nm bant geçiş emisyon: 515 nm uzun geçiş, 500 nm dikroik) .
  2. Microtumor Büyüme / çoğalma deneyi
    1. 12 mM stok hazırlamak için (Ca / Mg) olmadan PBS içinde MTT toz eritilir. -20 ° C'de steril filtre, kısım ve depolamak.
    2. İstenen kültür aralıklarında (1, 7 ve 14 gün), 100 ul kültür hacmi başına 96 oyuklu plaka MTT çözeltisi 20 ul ekle. doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 saat inkübe edin.
    3. 0.01 M HCl içinde% 10 SDS taze lizis çözeltisi hazırlayın ve plakalar kültür hacmine eşit miktarda ekleyin. gece boyunca 37 ° C inkübatör kapalı inkübe edin.
    4. Çok-plaka okuyucusu kullanılarak 570 nm'de absorbansı okumak.
  3. Kinomic Analiz Microtumor hazırlanması
    1. Pro 100x her 100 oranı: 4 ° C'ye ön soğutma ve daha sonra, bir 1 ekleyerek liziz tamponutein Fosfataz İnhibitör (ÜFE) ve 100x Protein Proteaz inhibitörü (PI). İyice karıştırın ve buz üzerinde tutmak.
    2. Transferi üç 1.5 ml mikrosantrifüj tüp her birine 2 microtumors. Süpernatantı ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca, her bir tüp ve parçalanmasıyla ppi ve PI ihtiva eden liziz tamponu 40 ul ekle.
    3. Pipet örnekleri şiddetle tümör boncuk kırmak için. kinomic analize kadar -80 ° C 'de, 4 ° C ve mağaza örnekleri 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin.

Microtumors 5. Kinomic profil

  1. Protein Tirosin Kinaz (PTK) profil
    1. Çözülme reaktifler (10x Protein Kinaz (PK) tampon ve% 2 sığır serum albümini (BSA)) profil pozisyon # 2'de şırıngaya 4 ° C Yük PK tampon (300 ul 10x PK tampon hazır 2.7 mi DH 2 O) platformu.
    2. softw içinde örnekleri annotating, kinaz tahlil yazılım programını açın ve PTK protokol dosya ve basın 'BAŞLAT' yüktarama cips sonra program vardır. Daha sonra profil platformu ve yük% 2 Sığır Serum Albümin (BSA) 25 ul dizi başına ve üzerine yerleştirin cips adım engelleme yazılım kontrollü bir protokol başlamak için YÜK basın.
    3. 10 mM adenozin trifosfat (ATP) yapmak için 54 ul dH 2 O ile 100 mM ATP stokunun 6 mcM sulandırmak. Yazılım 3'üncü ve son yıkama adımı (ekranda görünür) başladığında, lizat 15 ug dH 2 O ile 28 ul kadar getirdi getirmek karıştırın ve diziye ekleyin.
    4. (En fazla 12 numuneler için) PTK ana karışımı (MM) hazırlayın. (Zaten 60 ul 10x BSA içerir) (DTT) ditiotreitol sulandırmak ve PTK-MM1 tüp, 6 ul DTT ve 60 ul 10x PK çözümü eklemek için 32.6 ul dH 2 O ekleyin.
    5. Daha sonra 126 PTK-MM1 ul, 60 ul PTK katkı ve eklemek görünür kinaz tahlil yazılımı 'Load' istemi kadar bekleyin 60 ul 10 mM MM2 ATP (4.5 ul PY20 FITC antikoru tümbölenleştirildi önceden içerir) ve karıştırın.Her bir numune lizat tüp ve pipet karışımı 5 kez bu PTK ana karışımı 16 ul ekleyin.
    6. kapak camının temiz olduğundan emin olun ve sonra 35 ul lizat / dizi, yakın atlıkarınca kapağının ve basın YÜK butonuna başına ana karışımı ekleyin.
  2. Serin / treonin kinaz (STK) profil:
    1. Çözülme Reaktifler 4 ° C'ye kadar (10 x PK tampon maddesi, 10 x STK tampon ve% 2 BSA). Yük PK tampon şırınga pozisyon # 1, 1:10 ve STK tampon şırınga pozisyon # 2'ye (2.7 ml dH 2 0 300 ul) içine (2.7 ml dH 2 0 300 ul).
    2. tarama cips sonra program dahilinde örnekleri annotating, kinaz tahlil bilgisayar yazılım programı açın ve STK protokol dosyasını ve START tuşuna basın yükleyin. profil platformu ve yük daha sonra 25 dizi başına% 2 BSA ul ve yazılım kontrollü protokol engelleme adımı başlamak için YÜK basın üzerine yerleştirin cips.
    3. 54 ul dH 2 O ile 100 mM ATP 6 mcM seyreltin Final (3.) yıkama adımı karışımı sırasındaLizat 2 mikrogram ve dH 2 O ile 32.6 ul getirmek, mix ve diziye ekleyin.
    4. STK-MM1 tüp 70 ul 10x PK ekle (7 ul 100x BSA içerir), ve daha sonra STK-MM1 tüp 42 ul dH 2 O ekleyin: STK master karışım yapın.
    5. sonra kinaz deneyi yazılımı 'Load' istemi kadar bekleyin: STK-MM1 18 ul 10 mM ATP ekleyin ve her bir örnek lizat 9 ul MM1 ekleyin. İyice karıştırın.
    6. cam kapak temiz olduğundan emin olun ve 35 ul lizat / dizi, yakın atlıkarınca kapağının ve basın YÜKÜ başına ana karışımı ekleyin.
    7. Final (3.) Yıkama Adım sırasında (3.03 ul STK primer antikor karışımı içerir) DMAB tüp 1.05 ul STK-FITC ikincil antikor ekleyin DMAB 39,6 ul AB Buffer ekleyin eklemek 356,0 ul dH DMAB 2 O, her diziye DMAB 30 ul ekleyin ve basın YÜK .
  3. Kinomic Veri 19,20 analizi
    1. Açık analiz yazılımı ve Görüntü Analizi App yükleyin. Select görüntü PTK veya STK verilerine seçeneğini makale numarası eşleşen dizi düzeni dosyası (STK PTK için 86312 ve 87102) için barkodlu ve zaman damgalı tüm dizi görüntüleri içeren klasör ve yük daha önce dizi açıklama dosyası oluşturulur.
    2. tüm görüntülerin doğru gridding doğrulayın ve App ölçeklendirme Poz Süresi çalıştırın. İstatistiksel pozlama / eğim log2 dönüştürülmüş değerleri karşılaştırmak ve ön yıkama kinetik eğrileri 19-21 ile onaylayın.
    3. Yukarı kinazlar 22,23 koşulları arasında değişmiş kinomic profilleri sorgulamak için yukarı kinaz tahmin yazılımı çalıştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz 3D BioGel kültür sistemi birden fazla hücre tiplerinin uzun vadeli büyüme ve fonksiyonunu destekler olduğunu göstermiştir. Bu ortak bir proje, hasta türetilmiş GBM xenolines (PDX) microtumors yüzlerce üretmek için kullanılır. Ayrılan hücreler (3 x 10 5) ya da Neurospheres (40-50) BioGel boncuklar (2 mm) içine gömüldü ve hızlı jelleşme sonra bir NB-ortam dolu özel biyoreaktör kültürlenir. Hücresel canlılığı (Calcein-AM), büyüme profili (MTT) ve kinomic faaliyet dizisi taban...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

protokolü içinde kritik adımlar ağırlıklı nesil yanı sıra ilaç dozajı ve bakım microtumor ilgilidir. microtumor boncuk kırılgan ve kolayca yırtılmış olduğu için, son derece dikkatli bir tahlil ve bakım gelişim evreleri, hem de ihtiyaç vardır. Bir hata Bu işlemlerden birini sırasında oluşursa, deneysel yorumlama uzantısı veya deneylerin gereksiz tekrarını hatta veri dışlanmasını neden tehlikeye girebilir.

Değişiklikler ve sorun giderme, özellikle microtumor geliştirme sürecinin, microtumor bo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

R.S. ve R.S.S. Vivo Biosciences'ın çalışanlarıdır. JCA, kısmen UAB Kinome Core tarafından finanse edilmektedir.

Teşekkürler

, Beyin Tümörü SPORE ödülü (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) ve SBIR sözleşmesi (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026): NIH R21 hibe (C. Willey, CA185712-01 PI) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kollajenaz-I Sigma-AldrichCO130
Tripsin EDTA (10x)İnvitrojen15400-054  
Neurobazal-AYaşam Teknolojileri10888-022
N-2 TakviyesiYaşam Teknolojileri17502-0481x son konsantrasyon
B-27 Takviyesi, A VitaminiYaşam Teknolojileriolmadan 12587-0101x nihai konsantrasyon
Rekombinant İnsan FGF-temelYaşam TeknolojileriPHG026610 ng/ml nihai konsantrasyon
Rekombinant İnsan EGFYaşam TeknolojileriPGH031510 ng/ml nihai konsantrasyon
L-GlutaminCorning Cellgro Mediatech25-005-CI2 mM nihai konsantrasyon
FungizoneOmega ScientificFG-702.5 & mikro; g / ml nihai konsantrasyon
Penisilin StreptomisinOmega ScientificPS-20100 U / ml Penisilin G, 100 & mikro; g / ml Streptomisin nihai konsantrasyonu
GentamisinYaşam Teknolojileri15750-06050 ng / ml nihai konsantrasyon
MTTYaşam TeknolojileriM6494, PBS'de 5 mg / ml'ye hazırlanır ve steril filtrelenir, kuyuda 1 mg / ml
MTTFisherBP166, 0.01 'de% 10'a hazırlanır; M HCl, kuyuda %5
HClFisherA144SI-212, 0.01 'ye hazırlanmış; SDS'li M,
CalceinLife TechnologiesC1430kuyusunda 5 mM DMSO stokunda, 2  &mikro; PBS boyama solüsyonunda M, 1  &mikro; M kuyuda
Halt' s Protein Fosfataz İnhibitörü kokteyli Pierce ThermoScientific78420MPER'de 1:100 oranı 
Halt'ın Protein Proteaz İnhibitörü  Pierce ThermoScientific87786MPER
Memeli Protein Ekstraksiyon Reaktifinde (MPER)Pierce ThermoScientificPI78501
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
DMSOFisherBP231kalsein ve bileşiklerinin
çözünmesi için Fosfat Tamponlu Salin Ca/MgLonzaolmadan17-517QMiliQ ultra saf su ile 1 kata seyreltilmiş ve steril filtrelenmiş (hücre kültürü için)
Dulbecco'nun Ca / MgCorning Cellgro Mediatech20-030-CVSalin, MiliQ ultra saf su ile 1 kata seyreltilmiş (ön fiksasyon yıkaması için)
% 10 Nötr Tamponlu FormalinProtokolü032-060
Tripan MaviPierce ThermoScientific15250-061
Yüksek Yoğunluklu HubiogelVivo BiosciencesHDHG-5
Halt'ın Protein Fosfataz İnhibitörüPierce78420
Halt'ın Protein Proteaz İnhibitörüPierce87786
Memeli Protein Ekstraksiyon Reaktifi (MPER)Thermo Scientific78501
Protein Tirozin Kinaz (PTK) Dizi Profil Oluşturma çipiPamGene86312
PTK kinaz tamponuPamGene36000300 & mikro; l 2.7 & nbsp'de 10x PK tampon stoğu; ml dH2O, PTK reaktif kiti için katalog numarası
ATPPamGene36000PTK reaktif kiti için katalog numarası
PY20- FITC-konjuge antikorPamGene36000PTK reaktif kiti için katalog numarası
PTK Katkı MaddesiPamGene32114
PTK-MM1 tüp (10x BSA)PamGene36000PTK reaktif kiti
için katalog numarasıSerin/Treonin Kinaz (STK) Dizi Profil Oluşturma çipiPamGene87102
STK kinaz tamponuPamGene32205STK reaktif kiti için katalog numarası
STK Birincil Antikor Karışımı (DMAB tüpü)PamGene32205STK reaktif kiti için katalog numarası
FITC-konjuge İkincil AntikorPamGene32203
STK-MM1 tüpü (100x BSA)PamGene32205STK reaktif kiti için katalog numarası
STK Antikor TamponuPamGeneSTK reaktif kiti için32205
Ekipman
#11 Bıçaklar, sterilFisher3120030
#3 neşter sapları, sterilFisher08-913-5
100 mm cam Petri kaplarıFisher08-748D
Yarı kavisli forsepsFisher12-460-318
Tripsindirme şişesiFisher10-042-12B
Manyetik karıştırıcıFisher14-490-200
3/4" karıştırma çubuğuFisher14-512-125
BD hücre süzgeci Fisher# 352340
BD 50 ml Santrifüj tüpüFisher# 352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 kinomik analiz yazılımıPamGene
Evolve Kinaz Test YazılımıPamGene
UpKin App yazılımı (yukarı akış kinaz tahmini)PamGene
gentleMACS AyrıştırıcıMiltenyi Biotec130-093-235
Döner Hücre Kültürü Sistemi (RCCS)10 ml tek kullanımlık HARV ileSyntheconRCCS-D
lizis tamponu için SDS MTT lizis tamponu için 1:100 oranı) , , ile Fosfat Tamponlu katalog numarası

Kaynaklar

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388(2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B nsan BiyojeliMikrot m r K lt rHasta Kaynakl KsenogreftlerT m r DisagregasyonuH cre S zgeci FiltrasyonuCanl H cre G r nt lemeMTT Analizi
Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.