Yöntem makalesi

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü

12.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54045

⸱

27 Haziran 2016

1Department of Pharmacology, University of Virginia

Bu makalede

Özet

Bu makale, Drosophila melanogaster'de yakıt oksidasyonunun ölçümü için eser miktarda spesifik radyoaktif işaretli metabolik substratların sineklere beslendiği bir yöntemi açıklamaktadır. Yakıt oksidasyonundan üretilen solunan radyoaktif işaretli CO2 toplanır ve ölçülür.

Özet

Drosophila genetiği gücü giderek hormon sinyalizasyon ve metabolizma soruların ve bu organizmanın insan hastalık modellerinin geliştirilmesi için uygulanmaktadır. Böyle metabolik oranları gibi parametrelerin ölçümleri için hassas metotlar, meyve sineği gibi küçük hayvanlarda fizyoloji ve hastalığın daha iyi anlaşılmasını götürmek için gereklidir. Burada anlatılan yöntem, glikoz veya yağ asidi olarak 14 C-etiketli yüzeylerde eser miktarda içeren yiyecekleri beslenen yetişkin sineklerin az sayıda yakıt oksidasyonu değerlendirir. Besleme süresi ve herhangi bir ek deneysel manipülasyon sonra, sineklerin, radyo-etiketli CO2 potasyum bikarbonat gibi radyo-etiketli substratlar oksidasyonu sonucunda elde sonra trans nefes verme KOH doymuş filtre kağıdı içeren cam şişelere yerleştirilir mesh başlıklı kısa tüpler aktarılır KHCO 3. Bu radyo-etiketli bikarbonat, sintilasyon sayımı ile ölçülür. Bu aq olduğunuYakıt oksidasyon çalışmaları için, uantitative tekrarlanabilir ve basit bir yaklaşım. Radyo-etiketli glükoz, yağlı asitlerin ya da amino asitlerin kullanılması, besleme ve aç kalma gibi, farklı genetik geçmişlerde, farklı koşullar altında bir enerji metabolizması için bu farklı yakıt kaynaklarının katkı belirlenmesini sağlar. Bu in vivo enerji metabolizmasında ölçmek için kullanılan diğer yaklaşımları tamamlamaktadır ve metabolik regülasyon anlayışı ilerletmek gerekir.

Giriş

Model organizma Drosophila melanogaster çalışma genetik ilkeleri, gelişim süreçleri, büyüme, yaşlanma, davranış, bağışıklık ve insan hastalığı 1,2 anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur. Drosophila genetik ve hücre biyolojik yaklaşımlar sayısız Bu alanlarda ilerleme sürdü. Bununla birlikte, meyve sineği metabolizma çalışması, daha yavaş gelişmiş bir küçük bir hayvan metabolik parametreleri ölçmek zorluklara büyük oranda yer alır. Diyabet gibi insan hastalıklarının araştırılmasında bir model olarak Drosophila kullanarak büyüme ve çeşitli patolojiler için metabolizma katkıları anlamak için ilgi geliştirmek ve bu organizma 3,4 metabolik teknikleri adapte alan itti.

Güvenilir yöntemler artık meyve sineğinin metabolik parametrelerin bir dizi ölçümü için kullanılabilir. Örneğin, gıda alımını değerlendirmek basittir 5 kadar, depolanan trigliseridler ve glikojen, hem de glikoz dolaşımdaki hemolimf düzeyleri ve glukoz 4 iki molekül oluşan bir disakkarittir sinek, trehaloz, büyük sirkülasyon şeker seviyeleri. Metabolik izleyiciler kullanılması gibi depolama formları glikojen ve trigliserid 6 glukoz gibi diyet ve emilen besinlerin dönüşümünden besin emilimi çalışma sağladı. Metabolik oranları meyve oksijen tüketimi 7,8 ve karbondioksit ölçümü üzerinden uçmak (CO 2) üretiminde değerlendirilebilir. sitrik asit döngüsü, diyet ve depolanmış karbonhidrat ve yağ asitlerinin metabolizması türetilir asetil koenzim A (CoA) gibi döngüsü girebilir iki karbon birimleri okside eder. Döngüsünün her turlu bir GTP (veya ATP) her molekülü ve elektron donör FADH 2, NADH üç molekülleri ve atık ürün CO 2 iki molekülleri üretir. CO 2 üretimi canBazal metabolizma hızı tahmin etmek için kullanılabilir. Toplam CO2 üretimi ticari olarak temin edilebilen ya da el yapımı respirometers 9-10,11 kullanımı yoluyla Drosophila belirlenebilir.

Özellikle O 2 tüketimi ölçümü ile birleştiğinde, toplam CO2 üretiminin ölçümü, tüm vücut enerji metabolizmasında değerli bilgiler sağlar. Bununla birlikte, besin tanımlamaz bu önlem adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksitlenmektedir. karbonhidratlar, yağlı asitler ve proteinler: besin maddelerinin üç önemli sınıfı asetil CoA sitrik asit döngüsü, aşağıdaki dönüştürme girebilir. Glukoz-6-fosfat, diyet glukoz veya depolanan glikojen türetilen, asetil CoA oluşturur piruvat dehidrojenaz ile dekarboksile edilir piruvata dönüştürülebilir. daha sonra sitrik asit döngüsü girer asetil CoA SS-oksidasyon verimleri ile diyet veya hafızaya trigliseridlerden türetilen yağ asitlerinin dağılımı. En sonundaAmino asitlerin bir kısmı alfa-ketoglutarat CoA ya ​​da sitrik asit döngüsü ara-asetil, piruvata dönüşümü takip sitrik asit döngüsü girebilir.

bazal ve uyarılmış koşullarında enerji metabolizması Besin özel katkı radyoaktif izleyiciler kullanılarak izlenebilir. Burada sunulan protokol kültür 12,13 yetiştirilen hücrelerde oksidasyon değerlendirmek için kullanılan bir protokol Drosophila kullanım için uyarlanmıştır. Bu yaklaşımda, meyve sinekleri beslenen 14C-radyo işaretli metabolik substratlar (karbonhidratlar, yağlı asitler ya da amino asit) kısa bir süre (saat) diyet ya da uzun süre (gün) darbe, etiketlenmemiş gıda takip ve sonra maruz bırakılmıştır odası bikarbonat gibi solunan CO2 yakalama için potasyum hidroksit (KOH) -saturated filtre kağıdı ihtiva etmektedir. Radyo-işaretli bikarbonat sintilasyon sayımı ile tayin edilebilir. Deney arasındaki radyo etiketli-CO2 üretimi farklılıklarsinekler ark grupları, örneğin genotip arasındaki yakıt metabolizmasında uzun bir hızlı veya içsel farkları boyunca ATP üretimi için farklı yakıt kullanımını yansıtabilir.

Protokol

Radyoaktif Metabolik Alt Tabakalar İçeren Fly Gıda 1. Hazırlık

  1. 2 uCi radyo işaretli substrat (D -glükoz [6- 14C] -glükoz, D [1- 14C] ya da [1- 14C] -palmitic asit, 40 - - 60 mCi / mikrofüj tüpüne, 1 karıştırın 15 ul FD & C 1 numaralı mavi gıda boyası ile mmol) ve H2O 25 ul toplam hacim eşit.
    DİKKAT: Karbon-14 düşük enerji beta yayıcı ve havada kısa bir yelpazesine sahiptir. Ancak, radyoaktif işaretli moleküller veya deneyci tarafından kazara yutulması dökülmesi önlemek için özen gösterin. Gıda şişeler kolayca devrilebilir uçmak; radyo-sıvı formdadır, özellikle devrilme engellemek bir kap içinde barındırmak için emin (1.2 aşama) ya da unsolidified gıda (adım 1.4) de olabilir. Beslenen ediliyor ya da radyo CO 2 küçük miktarlarda nefes başlayacak radyoaktif işaretli substratlar beslenmiş Sinekler. Bu sinekler duman davlumbaz akrilik kutularda muhafaza ve küçük bir tabak KOH ca olmalıdırn CO 2 gaz yıkayıcı olarak kullanılmak üzere kutuya ayarlanmalıdır.
  2. Pipetleyin boş sinek gıda şişenin dibine radyo-etiketli substrat ve mavi boya karışımı tüm (yükseklik: 9.4 cm, genişlik: 2.2 cm).
  3. (- Gıda 10 ml içeren bir flakon için yüksek güç seviyesinde 20 saniye 15) gıda sadece sıvılaştırılmış kadar ısı standart bir mikrodalga fırında yemek uçmak.
  4. Mavi rengin tekdüzelik izleme sıyırınız, girdap hızla radyoaktif işaretli substrat / mavi boya karışımına 975 ul erimiş gıda ekleyin.
  5. 30 dakika - Gıda soğutmak ve 20 RT'de tamamen katılaşmaya izin verin.

Yetişkin Meyve Sinekler 2. Besleme Radyoaktif Metabolik Substratları

  1. Yetişkin anestezisi bir basınç regülatörü ile bir CO2 tankına akrilik bir baza kaynaştırılmış ve bağlı olan, gözenekli poli etilen CO2 anestezi cihazı kullanılarak uçar. / Dk 5 L anestezi cihazının içine CO 2 akış.
    1. aktarım anestezisi(- Şişe başına 30 sinekler n = 15) d radyoaktif işaretli, mavi boyalı gıda içeren flakon uçar. Cap köpük tıpa ile şişeler ve sinekler uyanmak kadar yatay dinlenme. Bir kapaklı akrilik bir kaba aktarın şişeler (180 cm x 180 cm x 240 cm yüksekliğinde).
  2. 2 için radyoaktif işaretli gıda sinekler aktarmadan önce 24 saat - - Kısa vadeli beslenmesi için, 18 için sinekleri açlıktan. 3 saat besleme adımı T o açlık adım önemlidir beslenen sinekler güvenilir kendilerine sunulan yiyecek yeni bir kaynak yemem çünkü . 5 boyunca uzun bir dönem için - 7 gün, sineklerin aç olmak zorunda değildir, ama deneyi sinek yerleştirilmiştir şişelerde radyo-etiketli gıda su içeriği kontrol ve şişeler su eklemek için bir iğne ve şırınga kullanmalıdır kuru gıda ile.
  3. Aktarım, yeni bir şişenin içine "dokunarak" tarafından etiketsiz gıda uçar. 2 Bir başlangıç ​​kovalamaca dönemi - 4 saat sinekleri cuticles gelen radyoaktif işaretli gıda parçacıkları temizlemek için verir ve radyoaktif sindirimini sağlargut kalan Ed yiyecek. Mavi karınlarının aramak için sinek görsel muayene ile bağırsak yoluyla gıda ilerlemeyi izlemek.
  4. Daha sonra, transfer, farklı yiyecek türleri uçan 96 saat genetik 18 ˚C veya 30 ° C'de - - ya da ortam sıcaklıklarında (12 (12 etkilerinin ölçümü için standart yiyecek ya da% 1 agar üzerinde 24 saat solunum üzerinde açlık durumuna karşı beslenen) manipülasyonlar için, örneğin, ısıya duyarlı GAL80 (GAL80 ts) kullanılarak).
    Not: Bu takip süresinin uzunluğu deney gerçekleştirilmiştir ve tecrübesi dahilinde,. Örneğin için, 30 ° C'de 96 saat takip amacıyla GAL80 ts kullanıldığı deneylerde gerekli olabilir, tam GAL4 bağımlı transgen ekspresyonu aktive etmek için.

CO 2 -Collection Aparatı 3. hazırlanması

  1. 14 C-glikoz ya da 14 C-palmitik asit ve tha ile etiketlenmiş sinekler içerecektir inşa "bakla fly" malzemeleri, örgü kaplı tüpler birleştirint atmosfere açık kalacaktır. 25 mm uzunluğunda, yuvarlak dipli tüpler bırakarak, 12 mm x 75 mm polipropilen borular üst 50 mm kesti. 130 mikron naylon mesh 35 mm x 35 mm kareler hazırlayın. Ayrıca, bir teyp dispanser saydam bandı edinin.
  2. CO 2 -Collection aparatları için malzeme birleştirin. Her bölmeyi sinek için 20 ml'lik cam sintilasyon flakon, bir off-orta deliği olan kauçuk üst stoper, iyi üst stoper delikten eklenecek bir merkez, sınıf GF / B cam mikrofiber filtre kağıdı (2.1 cm çapında bir araya daire, 1 mikron gözenek). GF / B filtre kağıdı nedeniyle yüksek ıslak mukavemet ve yüksek yükleme kapasitesi kullanılmaktadır.
  3. Kullanılacağı gün% 5 KOH taze hazırlayın. Sadece adım 3.4 önce katlamak ve de bu lastik En durdurucunun delikten geçirilir merkezine dairesel GF / B filtre kağıdı yerleştirin ve% 5 KOH 100 ul ile doyurulması. Şekil 1'e bakınız.
  4. etiketsiz medya, bir üzerinde inkübasyon (ler) aşağıdakinesthetize CO 2 ile uçar. Fırça naylon mesh ile kesme polipropilen tüpe, kap içine uçar, ve tüp örgü uymak için saydam bandı kullanın. sinekler uyanma ve örgü güvenli tüp yapıştırılmış edilmeden önce kaçan önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. Sinekler eşit sayıda belirli bir deney için her sinek bölmesinde kullanılmalıdır; 10 - Sinek baklada 20 sinekler sintilasyon sayımı (aşağıda adım 4.1) ile ölçüm için yeterli radyoetiketli-CO 2 üretirler.
  5. 20 ml'lik bir cam sintilasyon şişesi uçucu bölmesini aktarın. kauçuk üst tıpa iyi KOH doymuş GF / B filtre kağıdı içeren bir merkez tutan cam şişe kap. cam sintilasyon şişenin dudak üzerinde lastik top stoper geniş üst katlayın. Şekil 1'e bakınız.
  6. Set cam kapaklı, akrilik kap içinde sinekler içeren şişeler ve zaman (2 ila 12 saat iyi çalışıyor) değişen sürelerle inkübe.

Sonuçların 4. Analizi

  1. at4 ml sintilasyon kokteyli ihtiva eden bir 6 ml plastik ışınlama şişeye inkübasyon uncap cam şişeler ve aktarım KOH doymuş GF / B filtre kağıdı sonu.
  2. Gerekirse, depolanan yüzeylerde daha sonra belirlenmesi için -80 ° C'de kuru buz ve mağaza sinek bakla sinekler dondurma. Bu örnekler, radyoaktif ve buna uygun olarak saklanmalıdır unutmayın.
  3. / UCi cpm belirlemek için 0.5 uCi radyoaktif işaretli substrat - arka plan olarak hizmet vermeye kullanılmayan GF / B filtre kağıdı içeren bir ve 0.1 içeren bir iki diğerleri: Ek sintilasyon şişeleri hazırlayın.
  4. üreticinin protokolüne uygun olarak bir parıldama sayacı kullanılarak her numune için cpm ölçün.
  5. Saatte sinek başına pmol 14 CO 2 / bgbm ve pmol 14 CO 2 hesaplayın. Her numune için cpm değeri arka plan cpm çıkarın. düzgün radyoaktif işaretli substrat verilerinden, arka plan düzeltilmiş cpm / numunenin uCi sayılır hesaplayın.
    1. Kullanİmalatçı tarafından sağlanan spesifik aktivite ve radyoaktif olarak işaretlenmiş alt-tabaka radyokimyasal konsantrasyonu (örneğin, 50 uCi / umol ve 0.1 uCi / ml, sırasıyla) pmol / cpm hesaplamak için kullanılır. Pmol 14 CO 2 / numune 14 CO 2 / numune cpm arka plan düzeltilmiş sinek pod verileri dönüştürmek için bu faktör kullanın. Sonra sinek sayısı ve sinek bölmesinde saat sayısına göre bölün.

Sonuçlar

Bir radyoaktif substrat metabolizmasında üretilen nefesle ve tuzak radyoaktif işaretli CO2 miktarı bir sinek bölmesinde sineklerin sayısı yanı sıra hayvanlar CO2 toplama aparatı geçirdikleri zamanın miktarı ile ilişkili olmalıdır. Bunu test etmek için, 18 saat aç bırakıldı gerçekleştirilen 2 st için radyo-etiketli palmitik asit (0.02 uCi / ul Gıda) beslenir ve daha sonra 3 veya 6 saat inkubasyon için 12 ya da 25 hayvan gruplarında radyo işaretli CO2 üretimi için test edildi. 25 sinekler tarafından üretilen CO 2 miktarının 12 sinekler tarafından üretilen neredeyse iki katı miktarı oldu, ve her bir grup için miktar inkübasyon süresi 6 saat (Şekil 2A) 3 saat çıkarılmıştır zaman ikiye katlandı. Pmol 14 CO 2 / sinek / saat her grupta neredeyse eşdeğer oldu.

Oruç ß o tarafından yağ asitlerinin parçalanmasını uyarırxidation; Bu nedenle, yağ asidi oksidasyon CO2 üretimi beslenen hayvanlara kıyasla aç bırakılmış olan hayvanlarda yüksek olmalıdır. Bu durumda olup olmadığını belirlemek için, 18-saat gerçekleştirilen 2 st için radyo-etiketli palmitik asit beslenmiştir aç. Bu kısa besleme puls sonrasında sinekleri, iki gruba ayrıldı ve 3 saat etiketlenmemiş sinek yiyecek ya da% 1 agar aktarılır ve daha sonra 2 saat boyunca bölmeleri kalkan aktarılır. Iki ayrı deneylerde, ß oksitleme aç bırakılmış hayvanlarda artmıştır gösteren gıda (Şekil 2B) üzerindeki takip sinekler kıyasla agar üretilen önemli ölçüde daha radyo-etiketli CO 2 takip sinekler.

figure-results-1
Şekil 1. Ekshale Toplama için cihaz, Radyoaktif CO 2.
radyoaktif işaretli metabolik substratlar tüketilen Sinekler vardırBir "sinek pod" (FP), örgü (M) ile şapkalı bir kesim santrifüj tüpü içine yerleştirilmiş. Uçucu bölmesi 100 ul, doymuş GF / B filtre kağıdı içeren bir merkez de (CW) yerleştirilmesi yoluyla grimsi merkez deliği içeren bir lastik En durdurucu, (S), bir 20 ml'lik bir cam sintilasyon şişesi içine yerleştirilir ve kapatılmış olan % 5 KOH. Nefes verme CO2 KOH ile reaksiyona girer ve bikarbonat gibi filtre kağıdı üzerinde tutulur. Trapped, radyoaktif işaretli CO2 doymuş filtre kağıdının sintilasyon sayımı ile tayin edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Zaman ile 14 CO 2 Üretim İlişkileri ve içinde Sineklerin sayısıFed ve oruç Koşullarına Fly Pod ve Tepki.
(A), radyo etiketli palmitat beslenen sinekler üretilen 14 CO 2 miktarı (n = 12 (açık çubuklar) ya da 25 (kapalı barlar)) bir sinek bölmesine geçirdi ve zaman (3 veya 6 saat test edilen sineklerin sayısı ile ilişkilidir ). Başına sinek temelinde, sinekler 0.99, 1.13, 1.10 ve 1.01 pmol 14 CO 2 / hr (grafik veri olarak doğru sıralamayla aynı sol listelenen veriler) üretti.
(B) gıda kovaladı sinekler daha palmitat daha radyoaktif işaretli okside agarda kovalanan Sinekler. Veriler, iki deneyden ve standart sapma olarak rapor edilir, n = 16-17 sinekler / grup (deney 1); n = 10 sinekler / grup (deney 2). * P = 0.017, Student t-testi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu protokol, yetişkin Drosophila melanogaster spesifik radyo-etiketli substratlar oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntem tarif eder. Bu teknik, basit kantitatif, tekrarlanabilir ve hassas olduğunu ve bunun ATP üretimi için okside besin (ler) tanımlamak için kullanılabilir, çünkü toplam CO2 üretimi ve O 2 tüketimi ölçmek mevcut yöntemleri tamamlar.

Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, belirli radyo-etiketli substratlar oksidasyonu sonucunda serbest CO2 ölçümü toplam CO2 üretimini ölçmek teknikleri tamamlayıcıdır. Toplam CO2 üretimi (V CO2) ve toplam O 2 tüketimi (V O2) bilindiği zaman, metabolizma hızı hesaplanabilir ve oksidasyon yakıt kaynağı solunum değişim oranına göre tahmin edilebilir (V metabolizma hızı tahmin edilebilir CO2 / V O2 = RER). Ne zamankarbonhidratlar özel alt tabaka, rer = 1, ama yağ asitleri özel kaynak, YEK = 0.7, glikoz ve lipit oksidasyon reaksiyonlarının stokiyometri nedeniyle zaman. Drosophila 14 oksijen tüketimini ölçmek için ekipman yokluğunda, oksidatif yakıt kaynağı tespit edilemez. Etiketleme iz bir radyoaktif substrat veya başka miktarları ve radyoaktif olarak işaretlenmiş CO2 üretimi ölçüm oranları ile uçar tarafından Ancak, bir uyaranın sırasında veya etkileri ile ilgili farklı zaman noktalarında belirli bir alt tabakayı okside sineklerin yeteneği hakkında sonuçlar çıkarabiliriz yakıt oksidasyonu üzerindeki mutasyon verilen.

Bu protokol kritik adımlar vardır. dökülmelerini ve araştırma alanlarının kirlenmesini önlemek için radyoaktif maddeleri kullanırken Birincisi, dikkatli olunmalıdır. Adımlarda 2.1 ve 3.4 sırasında sinekler anestezi İkincisi, deneyci uzun süreli CO 2 etkilerinden kaçınmak için hızlı bir şekilde çalışması gerekirmetabolizma ve davranışları üzerindeki poz. 20 sinek bir grup anestezi ve yeni bir şişeye ya da 20 saniye ya da daha az bir uçucu bölmesine aktarılabilir. Bir gıda flakon bir anestezi cihazının transfer olduğunda, şişe gıda yüzeyine yapışmış getting anestezi sinekler önlemek için, yan dinlenmiş olmalıdır. sinekler adım 2.2 olarak birkaç gün boyunca beslenen radyoaktif işaretli gıda olduğunda, deneyci sinekler dehidrasyon duyarlı gıda kurumasına olmadığını sigorta gerekir.

beslenen veya aç karnına önce etiketleme, etiketin seçimi, etiketleme süresi uzunluğu, uçucu bölmesinde süre ve anestezi yöntemi, bu yöntem kullanıldığında sorun giderme ve değişikliğe tabi tutulabilir parametrelerdir. (- 3 saat 2) önceden açlık süresi tabi olmadıkça radyoaktif işaretli gıda önemli miktarlarda tüketmek olası değildir Birincisi, kısa etiketleme dönemlerine tabi sinekler. Etiket c İkincisi, seçimBir tek metabolik fenotipleri hakkında çizebilir sonuçları etkiler. Örneğin, d-radyo işaretli CO2 üretimi [1- 14C] -glükoz, sitrik asit döngüsü ve pentoz fosfat şant vasıtasıyla oksidasyon yansıtabilir D- radyo işaretli CO2 üretimi ise [6- 14C] -glükoz oksidasyon yansıtır sitrik asit döngüsü boyunca sadece 12,15,16. Temel bir amino asit 17,18 için bir radyo-etiketli izleyici ile sinekler besleme proteinlerden türetilen amino asitlerin oksidasyonu değerlendirmek için bir strateji olabilir. Son olarak, radyo işaretli glukoz ile uzun etiketleme süreleri de trigliseritler 19 ve hali hazırda piruvat ile interconverts alanin gibi amino asitler gibi moleküllerin diğer sınıflarına Bu ön-maddesinin dahil olma ihtimalini artırır. Bu moleküllerin 6, bu farklı sınıflara dahil radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir. Gerçekten de, sinekler ayrı kohortlar beslenebilir radAynı şekilde alt tabakaların iolabeled ve daha sonra, örneğin, koşullar 6 saklanır ve beslenen glikojen ve trigliserid kalır ve aç bırakılmış olan uçucu bölmesi deneyler ya da radyo-ölçümü için de kullanılır. Başka bir strateji radyoaktif işaretli diyet besin oksidasyonunu kendileri ve bu besinlerin değil depolama biçimlerini ortaya çıkarmak için muhtemel kısa etiketleme dönemlerini kullanmaktır. Üçüncü olarak, sinekler iki grup, ilk zaman belirli bir miktar üzerinden 14 CO 2 üretimi benzer oranları, ama çok farklı oranlarda sahip olabilmesi de mümkündür. Bu nedenle, sinek bölmesine harcamak uçar süreyi değişen fenotipik varyasyon değerlendirirken değiştirmek için önemli bir parametre olabilir. Son olarak, bu protokol CO 2 anestezi sinek pod cihazı içine sinekler koyarak kısa bir süre kullanımı için çağırır. CO 2 anestezi sinek pod deney boyunca metabolik fonksiyonu etkileyebilir mümkündür. Alternatif birpproach metabolizma hızı 20 etkilemez azot anestezi kullanmaktır.

Yakıt oksidasyon ve metabolizma hızı gibi karmaşık bir sistemi ölçen herhangi tekniği ile olduğu gibi, burada anlatılan yöntem sınırlamaları vardır. Birincisi, alt tabakanın farklı başlangıç ​​miktarları ile testinin CO2 toplama safhasına girecek ve böylece radyoaktif işaretli gıda farklı miktarlarda tüketmek olabilir farklı gruplarda uçar ve mümkündür. Bu büyük örneklem büyüklüğü ile deney yaparak ve topluca sinekler beslenerek bir ölçüde kontrol edilebilir. benzer mavi renkli bağırsaklar radyoetiket tüketilen ve deney kovalamaca kısmına taşınabilirler kısa etiketleme süreler için, uçar. sinekler grupta geri kalan radyo-miktarı da deneyin sonunda ve besleme ve ilk takip süresinin sona ermesinden sonra sinekler ayrı gruplar halinde ölçülebilir. arasında ikinci, aktivite düzeylerisinek bakla sinek grupları farklı olabilir. Bu deneysel olarak belirlenen ve veri yorumlanırken dikkate alınması gerekecektir. Üçüncü olarak, bu teknik, toplam CO2 üretimi, belirli bir beslenme besin veya besin depolama form (lar) sadece üretimini ölçmek değildir. Bu protokol için bir yedek değil ama farklı ve ek bilgi sağlar, çünkü yerine VCO 2 ölçümlerine tamamlayıcıdır.

Burada tarif edilen yöntem, belirli bir metabolik maddelerin eser miktarlarda oksidasyon ürünü olan, radyo-etiketli CO2 nefes verme ölçer. glikoz, yağ asitleri, ya da amino asit - - kullanılan etiket değiştirerek tarafından böyle bir açlık olarak ve farklı genetik geçmişleri farklı fizyolojik koşullar altında metabolizma farklı yüzeylerde katkılarını değerlendirmek için giderek sofistike deneyler tasarlayabilirsiniz. Bu tekniğin gelecekte uygulamaları metabolis ölçülmesini içerirgelişme larva ve pupa aşamaları sırasıyla besin depolama ve arıza, aşırı ile karakterize edilir Drosophila yaşam döngüsü, iki kademeli m.

Açıklamalar

Yazar, rekabet eden herhangi bir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazar, Dr. Mingjian Lu ve Morris Birnbaum'a NIDDK'dan (R21DK089391) yardımcı tavsiyeler ve finansman desteği için teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PALMITIK ASIT, [1-14C] -, 50 & MIKRO; CiPerkinElmerNEC075H050UC
GLUKOZ, D- [6-14C] -, 50 & mikro; CiPerkinElmerNEC045X050UC
Glikoz, D- [1-14C] -, 50 & CiPerkinElmerNEC043X050UC
Drosophila Şişeleri, Dar, PolistirenGenesee Scientific32-116
Yuvarlak Tabanlı Polipropilen Tüpler, 12 x 75 mmFisher Scientific14-959AA
Mesh, nitex naylon, 120 & mikro; mGenesee Scientific57-102
20 ml borosilikat cam sintilasyon şişeleriFisher Scientific03-337-15
Merkez dışı delikli şişe üst durdurucuFisher ScientificK882310-0000
Polipropilen merkez kuyusuFisher ScientificK882320-0000
Whatman GF/B cam mikrofiber filtre kağıdı, daire, 2,1 cm çapFisher Scientific09-874-20
Ecoscint AUlusal TeşhisLS-273
6 ml Push-On/Twist-Off Kapaklı SintilasyonŞişeleri National DiagnosticsSVC-06

Kaynaklar

  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
  4. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  5. Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  6. Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
  7. Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
  8. Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
  9. Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
  10. Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681(2014).
  11. Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
  12. Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
  13. Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
  14. Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
  15. Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
  16. Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
  17. Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  18. Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
  19. Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
  20. Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yak t OksidasyonuSintilasyon Say mPotasyum HidroksitSinek Kabini d zene iKarbon 14 GlikozKarbon 14 Palmitik AsitRespirometri
Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.