Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

8.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54070

⸱

22 Haziran 2016

 ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Toledo College of Medicine and Life Sciences, 2Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Pathophysiology, Southern Medical University (China)

Bu makalede

Özet

Bu mevcut protokol, canlı hayvanlarda nötrofil hazırlamanın dinamik sürecinin izlenmesini sağlamak için floresan raportörler, in vivo etiketleme ve intravital görüntüleme teknikleri kullanır.

Özet

Nötrofiller, insan kan dolaşımında en bol lökositlerdir ve hızlı bir şekilde enflamatuar sitelere alınırlar. Astar nötrofillerin fagositik işlevselliğini artıran önemli bir olaydır. Kapsamlı çalışmalar, H. pylori ve yaralanma içinde mevcut ve nötrofil priming önemini meydana gelmiş olsa da, yok olmuştur, in vivo olarak bu işlemi görselleştirme anlamına gelir. Floresan-konjuge anti-limfosit antijen enjeksiyonu ile elde 2 -) 'de in vivo nötrofil etiketleme emişli bir ölçüsü olarak kullanılır - 1) DsRed reporter sinyalini: Resim protokolü üç yöntemleri birleştirerek yaşayan hayvanlarda priming nötrofil dinamik işlem izlenmesini sağlar 6G (Ly6G) monoklonal antikoru (mAb) ve 3) intravital konfokal görüntüleme. Birkaç kritik adımlar bu protokol katılmaktadırlar: oksazolon kaynaklı fare kulak deri iltihabı, hayvanların uygun sedasyon, anti-Ly6G mAb'nin tekrarlanan enjeksiyonları ve prevgörüntüleme sırasında odak kayması ention. Bir kaç sınırlamalar gibi bir fare sürekli görüntüleme süresi (~ 8 saat) sınırı ve floresein izotiosiyanat-dekstran inflamatuar durumda kan damarlarından sızıntısı olarak, gözlenmemiş olmasına karşın, bu protokolü intravital görüntüleme için temel bir çerçeve sağlar kolayca fare inflamasyon modellerinde diğer bağışıklık hücrelerinin incelenmesi genişletilebilir prime nötrofil davranış ve işlev.

Giriş

Nötrofiller dolaşımda en bol ve kısa ömürlü lökositler bulunmaktadır. Onlar hızla de antimikrobiyal peptidler ve proteazlar 1 içeren granüller ile birlikte reaktif oksijen ve nitrojen ara serbest bırakılması yoluyla profesyonel fagositler hizmet enfeksiyon veya yaralanma sitelerine işe alınırlar. Onların işe sırasında, nötrofiller inflamasyon 2 bir yerinde girişte belirgin gelişmiş fagosit işlevselliği ile sonuçlanan mikrobiyal ürünler, chemoattractants ve inflamatuar sitokinler dahil olmak üzere çeşitli ajanlar tarafından "prime" vardır. Nötrofil hazırlığını mekanizmaları yoğun vitro 3,4 çalışılmıştır; Bununla birlikte, in vivo koşullarında işlemin dinamik kontrolü tarihi mümkün olmamıştır.

Son zamanlarda, intravital görüntüleme görselleştirilmesi ve canlı organizmalarda biyolojik süreçlerin hücresel dinamiklerini miktarının belirlenmesi için önemli bir teknik haline gelmiştir. Intravital görüntüleme geleneksel tek foton uyarma mikroskobu ile (örneğin, konfokal) gerçekleştirilen veya multiphoton mikroskopi 5 yaklaşımlar olabilir. Zamanla, önemli gelişmeler artan görüntü çözünürlüğü, gelişmiş görüntüleme derinliği sağlayan bu teknikle elde edilmiştir, doku fotohasar ve gelişmiş görüntü sabitleme 6,7 azalmıştır. Zamanla hücresel göç ve etkileşim dinamik görselleştirme etkinleştirmek için eşsiz yeteneği göz önüne alındığında, intravital mikroskopi yoğun immünoloji 8 çalışmanın çeşitli alanlarda uygulanmıştır. Intravital görüntüleme daha iyi anlamak ve hayvan modelleri yaşayan hem hücresel ve moleküler düzeyde bağışıklık yanıtlarını contextualize İmmünologlar sağlar.

Son transgenik gelişmeler de knock-in muhabiri fare gibi yaşayan hayvanlarda nötrofil dinamik davranışları izlemek için yararlı araçlar sağlamıştır. Lizozim M organizatörü odaklı gelişmiş yeşil floresan protein knock-infarenin genel ekstravazasyonu, bakteriyel enfeksiyon ve steril bir iltihap 9-15 de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuvar süreçlerde nötrofiller, monositler ve makrofajlar hareketliliğini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Bundan başka, bir sitoplazmik flüoresan rezonans enerji transferi biyosensör ifade eden transgenik fareler, iltihaplı bağırsak 16 içinde nötrofil hücre dışı düzenlenmiş bir mitojen kinaz ve protein kinaz A aktivitelerini inceleyerek içinde kullanılmaktadır. Nötrofillerde floresans ifadesi için yüksek bir özgüllüğü olan bir fare modeli kendisi lenfosit antijen 6G (Ly6G) 17 sentezlenmesi kuple edilir floresan protein tdTomato, hem de Cre rekombinazı üreten Catchup knock-in fare,. Bu modelde aracılığıyla Ly6G eksikliği nötrofil Görselleştirme bu hücrelerin steril ya da bulaşıcı in vivo enflamatuar bağlamlarda çeşitli normal işlevlerini uygulamak olduğunu göstermiştir. DsRed flüoresan s ifade eden transjenik fareninnötrofiller, iltihabik monositler ve aktive makrofajlar içerdiğine inanılmaktadır - - (IL-1β) promoteri (pIL1-DsRed), IL-1β üreten hücrelerin hareketsiz davranışları görselleştirmek için kullanılmıştır interleuikin-1 p fare kontrolü altında genin rotein çıkan iltihaplı cilt 18.

İn vivo markalama iltihaplı dokuların nötrofil hücresel ve moleküler davranışları izlemek için alternatif bir yaklaşım olarak görev yapabilir. Anti-Gr-1 monoklonal antikoru (mAb) floresan etiketli düşük dozlarda intravenöz enjeksiyon, Gr-1 + nötrofillerin ilerlemesini kaskad sonra Staphylococcus aureus 19 ile enfekte edilmiş farenin deri lezyonlarında görselleştirilmiştir. Streptavidin içeren konjugatlarının in vivo uygulama konjuge 705 nm kuantum noktaları ve biyotinile anti-Ly6G mAb özellikle dolaşan nötrofillerin 20 etiket. neutroph bu tür konjugatların Ayrıca, endositozIL veziküller interstisyuma göç nötrofillerde yüksek hızlı vezikül taşıma izleme sağlar. in vivo P-selektin karşı floresans-konjuge antikor Branşman integrin ligand-1 (PSGL-1), L-selektin (CD62L) glikoproteini ile markalama (CD11b bir TNFa kaynaklı inflamatuar modelinde) ve kemokin (CXC motifi) reseptör 2 (CXCR2) erken inflamasyon 21 döneminde oynayan düzenleyici mekanizmalar açığa çıkartılmıştır. Polarize nötrofiller CD11b ve CXCR2, nötrofil göçünü sürücü ve inflamasyonu başlatan reseptörlerinin dağıtılması sonuçlanan aktive trombositler üzerinde CD62L mevcut ile etkileşim uropods PSGL-1-zenginleştirilmiş çıkıntı.

IL-1β hazırlanmış nötrofillerin 22 yükselir imza genlerin biridir. PIL1-DsRed muhabiri farelerde, DsRed floresan sinyalleri (yani., IL-1β promotörünün aktivasyonu) olumlu mRNA ifadesi ve IL-1β protein üretimi, IL-1β ile bağlantılıdır. 18 nötrofil astarlama işlemi izlemek için, intravital mikroskopik bir yöntemi floresans konjuge edilmiş anti-Ly6G mAb ile nötrofillerin in vivo etiketlemeden sonra pIL1-DsRed fare modelinde oksazolon (OX) deri iltihabı indüksiyonu dahil geliştirilmiştir. Bu model ile, çeşitli hastalıkların ve rahatsızlıkların hayvan modellerinde astar nötrofillerin davranış ve işlevini incelemek mümkündür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes göre yapılan ve Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

pIL1-DsRed 1. Farelerin fenotipleme

Not: Yavrular, vahşi tip (WT) C57BL6 fare ile heterozigot pIL1-DsRed fareler üreme tarafından oluşturulur. Üç hafta, dört eski yavrular fenotipleme hazır olarak kabul edilir. Farelerin Submandibuler kanama küçük değişiklikler 23 ile kurulmuş bir protokol izler.

  1. Fare Pups Whole Kan Beyaz kan hücrelerinin izolasyonu
    1. Her 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne heparin 20 ul ekleyin.
    2. kafesten bir yavru kazanır. yavru kimlik etiketi kaydetmek. Submandibuler venden kan toplama önce yavrular uyutmak için gerekli değildir.
    3. Boyun berduş tarafından yavru tutun ve th submandibuler ven delmek5 mm neşter kullanarak e yanak kese. Kan damlaları penetrasyon açısından terlemek, böylece küçük bir delik oluşturmak için yeterli kuvvet uygulamayın. Her yavru için yeni bir iğne kullanın.
    4. Bir heparin içeren mikrosantrifüj tüp yavru başına kan 5 damla - 3 toplayın. Delinen bölgeyi temizleyin ve hemostaz kolaylaştırmak için basınç uygulayın.
    5. Yeni kafese yavru koyun ve hayvan tesis kafesi dönmeden önce 30 dakika boyunca gözlemleyin.
    6. Pozitif ve negatif kontroller olarak, bilinen bir fenotip yetişkin farelerden kan toplamak.
    7. Her bir tüp, girdap tüplerine kırmızı kan hücresi lize tampon 500 ul ekle ve 5 inkübe edin - buz üzerinde 10 dakika.
    8. Her bir tüp içinde hücre süspansiyonları altında fetal sığır serumu (FBS), 500 ul - yavaş yavaş 400 ekleyin. Net bir arayüz üst katman hücre süspansiyonu ve FBS alt tabaka arasında gözlemlenebilir.
    9. Cap tüpleri ve santrifüj örnekleri 5 dakika boyunca 1,500 x g'de.
    10. kürk 1.1.9 - Tekrar 1.1.7 adımlarıther kırmızı kan hücreleri çıkarmak. lizis ilk kez yeterli olup olmadığını tekrar etmeyin. taneleri santrifüjleme sonrası ayırt etmek zor olması gerekir.
  2. Lipopolisakarid (LPS) uyarılması ve Kültür
    1. Tam Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı içinde 200 ul içinde süspanse hücreleri.
    2. tüp sitometri bir akış hücre süspansiyonu aktarın.
    3. tam RPMI 1640 ortamı içinde 990 ul LPS stok çözeltisinin 10 ul (1 mg / ml) karıştırarak çalışma çözeltisi LPS sağlayın.
    4. Hücre süspansiyonunun 200 ul çalışma çözeltisi 10 ug / ml LPS 20 ul ekle.
    5. Kapak borular gevşek ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 4 saat örnekleri inkübe edin.
  3. Akım Sitometri Analizi
    1. flow sitometri için veri toplama programını açın. edinimi örnek öncesinde satın alma şablonu ayarlayın.
    2. araç paletinde Dot-Plot aracını tıklatın. Bir fo çizinyan dağılım (SSC) arsa vs rward dağılım (FSC). Doğrusal ölçeğine FSC ve SSC gerilim parametreleri ayarlayın.
    3. sitometresinin izin FSC ve SSC düşük eşik seçin. sırasıyla, FSC ve SSC için barajı 200 ve 50 uygulayın.
    4. SSC arsa vs FSC içinde, enkaz, kırmızı kan hücreleri ve lenfositler monositler, granülositler ve dendritik hücreleri içerir ve dışlayan bir kapı G1 çizin.
    5. araç paletinde Histogram aracını tıklatın. Bir FL2 (kırmızı floresan kanalı) histogram çizin. Tüm DsRed pozitif olayları kapsar bir kapı çizmek için FL2 sinyallerinin taban çizgisi ve pozitif kontrol örneği ayarlamak için bir negatif kontrol örneği kullanın.
    6. sitometresinin ve Sıvıları Kontrol panelinde, sıvı moduna "RUN" ve akış hızını "HI" (yaklaşık 60 ul / dak) olarak ayarlayın. Her numune için 10.000 olayları edinin.
    7. G1 kapısından DsRed pozitif hücrelerin yüzdesi ölçerek yavru fenotip belirleyin.
2. pIL1-DsRed Farelerde Cilt iltihap İndüksiyon

  1. 100 mg / kg ketamin 10 mg / kg ksilazin ve 1 mg / kg asepromazin ihtiva eden bir anestezik kokteyl intraperitonal (İP) enjeksiyon ile fare anestezisi. Yeterli anestezi fareler ayak tutam arka pençe çekme görünmüyor.
  2. Farenin her iki kulağın arka yüzeyine saç kaldırma krem ​​uygulayın. 1 dakika 30 saniye bekleyin. Su-ıslatılmış pamuk ile kulak yüzeyini silin ve kurumaya bırakın.
  3. mikrometre ile kulak kalınlığını ölçmek ve ayrı bir kafes içinde fare değiştirin. (- 30 dakika ~ 15) anestezi kurtarma kadar gözlemleyin. Epilasyon ürünün neden olduğu deri iltihabı gidermek için daha fazla deney yapılmadan önce fare 3 gün dinlenmeye bırakın.
  4. 1 ml aseton içinde OX 16.7 mg eritilmesi ve zeytin yağı 250 ul OX / aseton çözeltisi 750 ul karıştırarak 1.25% (w / v) oks hazırlayın. 250 & ile aseton 750 ul karıştırılarak araç çözüm hazırlayın# 181; zeytinyağı l.
  5. anestezik kokteyl (2.1) ip enjeksiyon yoluyla fare yeniden uyutmak. daha önce olduğu gibi kulak kalınlığını ölçün.
  6. sağ kulak her iki yüzüne% 1.25 OX 12.5 ul uygulayın. sol kulak her iki yüzüne aseton / zeytin yağı araç solüsyonu 12.5 ul uygulayın.
  7. Tam o, diğer farelerin tarafından kulakları hakaret önlemek orijinal kafeste fare yerini ve hayvan barınağı tesisi dönmek için iyileşene kadar fare kafes arkadaşları ayrı tutun.
    NOT: Epilasyon kulak kalınlığı değişikliği aşağıdaki küçük deri iltihabı neden olabilir. Bu küçük inflamasyon 3 gün sonra çözüldü, normal kulak kalınlığı tarafından teyit edilecektir. 24 saat süre ile topikal uygulama sonrası, OX-muamele edilmiş kulaklar önemli (p <0.01) kıyasla araç çözeltisi, tek başına tedavi edilen kulakları şişme göstermektedir.

pIL1-DsRed Farelerde nötrofil 3. Etiketleme

Not: düşük doz f nötrofillerin in vivo etiketlenmesindeluorescence-konjuge nötrofil özgü mAb yeni geliştirilmiş bir protokol 19 izler. Retro-orbital enjeksiyonları birkaç modifikasyon 24 ile kurulmuş bir protokole göre gerçekleştirilir.

  1. fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 90 ul, 0.5 mg / ml ve Alexa Fluor 647-bağlı anti-Ly6G mAb (klon 1A8) 10 ul seyreltilmesi anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi hazırlayın.
  2. 28 ölçü bir iğne ile, U-100 insülin şırıngaya anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi (50 ug / ml) 100 ul aktarın.
  3. daha önce tarif edilen anestezi kokteyl (2.1) IP enjeksiyonu ile bir yetişkin pIL1-DsRed fare anestezisi. Temiz bir çalışma gemide anestezi fare karın aşağı gelecek şekilde yerleştirin.
  4. Kısmen soketten göz küresinin çıkıntı bir fare göze hafifçe aşağı doğru cilt dorsal basınç ve ventral uygulayın.
  5. Dikkatle retroorbital medial kantus yaklaşık 30 ° 'lik bir açı ile aşağı konik, iğne yersinüs.
    NOT: Operatör sinüse iğne ekler kez baskı, nüfuz ve rahatlamış direnci hissedebilirsiniz.
  6. Yavaş ve yumuşak fare içine solüsyonu (5 ug mAb / fare / enjeksiyon) çalışan anti-Ly6G mAb 100 ul enjekte edilir. iğneyi hızla sökün. kanama az miktarda başarılı bir enjeksiyon göstermektedir.
  7. Hemen sağ ve sol fare kulakları üzerine% 1.25 OX ve araç çözümü uygulayın.
  8. 8 saat sonra, aynı fareye retroorbital enjeksiyon yoluyla taze hazırlanmış anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi (5 ug mAb / fare / enjeksiyon) 100 ul yönetmek.
  9. Hemen görüntüleme önce, kan damarları görselleştirmek 30 mg / ml flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile 100 ul yönetmek için retroorbital enjeksiyon yoluyla dekstran (150 kDa) ile konjüge edilmiş.

pIL-1 DsRed Farelerde Nötrofil Hazırlama 4. intravital Görüntüleme

  1. anestezik kokteyl (2.1) ip enjeksiyonu ile fare anestezisi.0; iken görüntüleme için anestezi altında kuruluğunu önlemek için fare gözlerine veteriner merhem sürün.
    1. PBS eşit hacimde orijinal anestezi kokteyl 500 ul seyreltilmesi ile 1 ml yarım doz anestezi kokteyli hazırlanır.
    2. Bir kelebek 27 gauge iğne ile 1 ml şırınga yarım doz anestezik kokteyl aktarın.
    3. intraperitoneal fare karın içine kelebeğin iğne takın ve bantlama ile karın kelebek kanat düzeltmek.
  2. Görüntüleme aşamasında merkezinde bir cam lamel. yerinde tutmak için lamel kenarlarında bantlayın.
  3. Fare kulağı ventral yüzeyi üzerinde hem de lamel PBS damla yerleştirin.
  4. Pozisyon lamel üzerindeki kulak ile fare anestezi. Ayrıca bant aracılığıyla yerinde tutulan lamel ve bir cam slayt arasındaki kulak sandviç ile, aşağı kulak ucu, dorsal yüzü monte edin.
  5. Çok lazer floresan konfokal mikroskop ve ilgili tüm e-açmaquipment. Ortam ışığı maruziyeti en aza indirmek için oda ışıkları kapatın.
  6. görüntü elde etme yazılımını açın. Boya Listesi menüsünde floresan boyaların tespiti için lazer kanalları seçin.
  7. Mercek aracılığıyla DsRed + hücrelerden kan damarları ve kırmızı sinyaller yeşil sinyallerin gözlem iltihaplı kulak cilt üzerinde odağı ayarlayın.
  8. Tarama 2 us / piksel hızı ve 512 × 512 piksel çözünürlüğe sahip bir hızlı tarama gerçekleştirin. Canlı Görünüm menüsünde her kanal için bir Pseudocolor seçin. sonunu ayarlamak ve tarama konumunu başlatmak için odak düğmesini ayarlayın.
  9. 8 mikro-sn / piksel ve 800 × 800 veya 1024 × 1024 piksel çözünürlük - tarama 4 hızı yavaş taramalar yapar. , Yüksek gerilim ayarlayın kazanç ve doygunluk (kırmızı piksel) kaçınarak sinyallerin yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için her kanalda ofset. Her bir kanalda, sadece birkaç kırmızı piksel olmalıdır.
  10. th tarayarak üç boyutlu görüntü kümeleri oluşturmae kulak cilt, 635 mikron x 635 mikron × 30 mikron (20X objektif), ya da 1270 mikron × stratum korneum yüzeysel başlayan ve x, y, 317 mikron × 30 mikron (40X objektif) × 317 mikron z hacimleri ile aşağıya doğru ilerliyor 2 mikron z-adımlarda 1270 mikron × 50 mikron (10X objektif).
    NOT: stratum korneum epidermisin en dış tabakası olan ve hali hazırda güçlü otofloresan sinyaline göre lokalize edilebilir.
  11. zaman atlamalı görüntüleme deneylerde, kayıt üç boyutlu görüntüler en fazla 8 saat süre ile, her 2 ya da 4 dak.
  12. kelebek iğne ile yarım doz anestezi kokteyl 10 ul - fare anestezi kurtarmak için başlar Aralıklı, seğirmesi bıyıkları gözleme dayalı kaydetti, 5 yönetmek.
    NOT: Anestezi doz dikkatli olun - aşırı doz fare ölüme neden olabilir. Seçenek olarak ise, bir kavanoza inhalasyon anestezisi kısa süreli anestezi ve farenin tatbik edilebilirburun konisi, uzun vadeli görüntüleme için kullanılabilir.
  13. görüntüleme tamamlandığında aşamasından anestezi fareyi çıkarın. Kaseti çıkarın ve farenin karın kelebek iğne çıkarılır. hayvan barınağı tesisi ayrı bir kafes fare dönün.
    NOT: - 3 saat kısa süreli görüntüleme (<1 saat), fareler tamamen 1 hızlı anestezi kurtarmak. 16 saat - Uzun süreli görüntüleme (~ 8 saat), fareler 12 tipik geri kazanım süresi ile yavaşça iyileşir. Böylece, oral su idaresi şiddetli su kaybını önlemek için iyileşme döneminde en az birkaç kez tavsiye edilir.
  14. Süreç görüntüleme veri setleri, tek tek hücrelerin izlemek göç yolları üretmek ve görüntü analiz yazılımı 25 kullanılarak hücre göçü yönünü ve hızını hesaplar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

pIL1-DsRed farelerin tarama akış sitometrisi kullanılarak periferal kan lökositleri tarafından üretilen fenotipik DsRed floresan sinyali göre gerçekleştirilir. LPS uyarımı nötrofiller, monositler ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere 26-28 miyeloid hücrelerinde IL-1β üretimini indüklediği bilinmektedir. Bu durumda, izole edilmiş bir lökosit akış sitometri analizine önce 4 saat LPS ile inkübe edilir. Daha sonra, yolluk bu kapı popülasyonda ölçülür hücre boyutu (FSC) ve iç ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmanın amacı, henüz mevcut tekniklerle yerine olmamıştır yaşayan hayvanların, nötrofil astarlama işlemi izlenmesi için bir teknoloji geliştirmektir. Bu amaca ulaşmak için, üç kurulan yöntemler gerçekleştirilir: deri iltihabı 1) İndüksiyon, IL-1β promotör-tahrikli DsRed raportör farelerde astarlama bir ölçüsü, flüoresan-konjuge anti-Ly6G düşük doz nötrofillerin 2) in vivo olarak etiketleme mAb, ve 3) intravital konfokal mikroskopi görüntüleme. Bu üç yöntemin kombine inflamatuar deri lezyonlarında prime nö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir finansal çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarların teşekkür hakkı yok.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Heparin sodyumAPP İlaçNDC 63323-540-31
ACK parçalama tamponuLonza10-548E
Fetal sığır serumuSigma-AldrichF0926
LipopolisakkaritlerSigma-AldrichL4391
Ketamin hidroklorürHospiraNDC 0409-2051-05
KsilazinLLOYD LaboratuvarıNADA # 139-236
AsepromazinBoehringer IngelheimANADA 200-361
Tüy dökücü kremKilise & Dwight
AsetonFisher ScientificA16P4
OxazoloneSigma-AldrichE0753
Alexa Fluor 647 anti-fare Ly6G antikoruBioLegend127610
U-100 insülin şırıngası, 28 G iğneBD329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDaSigma-Aldrich74817
Kelebek infüzyon seti (27 G iğne)BD387312
FACSCalibur sitometreBD
CellQuest Pro yazılımıBD
Konfokal mikroskopOlympusFV1000
Metamorf YazılımıEvrensel Görüntüleme

Kaynaklar

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
  3. Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
  4. El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
  5. Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
  6. Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
  7. Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
  8. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  9. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  10. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  11. Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
  12. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  13. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
  14. Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
  15. Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
  16. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  17. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  18. Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
  19. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  20. Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
  21. Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
  22. Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
  23. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  24. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  25. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  26. Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
  27. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
  28. Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
  29. Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
  30. Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
  31. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
  32. Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
  33. Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
  34. Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
  35. Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
  36. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  37. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  38. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
  39. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

IL 1 Beta Promot rAnti Ly6G AntikoruOksazolon nflamasyonuAk SitometrisiKonfokal MikroskopiRetroorbital EnjeksiyonFITC Dekstran
IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.