Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Özet

Burada besleyici hücreler olmadan lentiviral sistemi kullanılarak, hastaya türetilmiş fibroblast benzeri sinoviyositler insan kaynaklı-pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Özet

Olgun somatik hücre yeniden programlama faktörleri tanımlanmış bir dizi kullanarak pluripotent kök hücre benzeri duruma ters çevrilebilir. Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc: Çeşitli çalışmalar, dört Yamanaka transkripsiyon faktörlerini transducing çeşitli somatik hücre tiplerinden kaynaklı-pluripotent kök hücreleri (iPSCs) yarattı. iPSCs çalışma, biyolojik ve klinik araştırmaların kesme kenarında kalır. iPSCs herhangi bir bireyin dokusundan indüklenebilir yana Özellikle, hastaya özel iPSCs, hastalık patobiyolojisi çalışma için öncü bir araç olarak kullanılabilir. Romatoid artrit (RA) eklem kıkırdak ve kemik yapısının bozulmasına sınıflandırılan kronik bir enflamatuar hastalığıdır. Sinovyal hiperplazi RA'da bu sonuçlara yol önemli nedenlerinden veya belirtilerden biridir. Fibroblast benzeri sinoviyositler (FLSs) hiperplastik sinovyumda ana bileşeni hücrelerdir. eklemde FLSs limitlessly sonunda komşu cartil işgal prolifereyaş ve kemik. Şu anda, hiperplastik sinovyum, sadece cerrahi bir prosedür ile çıkarılabilir. Kaldırılan sinovya ortak inflamatuar durumunu yansıtan bir malzeme olarak RA araştırma için kullanılmıştır. RA patogenezinde önemli bir oyuncu olarak, FLSs oluşturmak ve RA hastalarının iPSCs araştırmak için bir malzeme olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, iPSCs oluşturmak için bir RA hastanın FLSs kullanılır. lentiviral sistemi kullanarak, FLSs RA hastaya özgü IPSC oluşturabilir keşfetti. FLSs oluşturulan iPSCs gelecekte daha da RA patofizyolojisinin incelemek için bir araç olarak kullanılabilir.

Giriş

Pluripotent kök hücreler çeşitli klinik ve biyolojik alanlarda yeni nesil platform vardır. Bu hastalığın modelleme, ilaç tarama, ve rejeneratif tıbbi tedavide kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. İnsan Embriyonik Kök Hücreler (hESC) esas çalışma ve pluripotent hücreler anlamak için kullanıldı. Bununla birlikte, insan blastosist imha ile izole edilmiş, HESC çok etik kaygılar ile ilişkilidir. 2007 yılında, Dr. Shinya Yamanaka ve ekibi hücre programlama sürecini tersine insan yetişkin somatik hücre ^1,2 kök hücre geliştirdi. Bu nedenle, HESC farklı olarak, indüklenen-kök hücreleri (iPSCs) etik engel kaçınarak olgun somatik hücrelerinden üretilebilir.

Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc: Genellikle, iPSCs dört ekzojen genlerin verilmesi ile elde edilir. Bunlar Yamanaka faktörleri aslında lentiviral ve retroviral sistemler kullanılarak teslim edilir. İlk iPSCs fare somatik C elde edilmiştirarşın ^3. Daha sonra, bu teknik, insan dermal fibroblastlarında ^1,2 uygulanmıştır. Daha sonraki çalışmalar başarıyla idrar ⁴ kan ^5,6 gibi çeşitli kaynaklardan iPSCs üretilen ⁷ keratinositler, ve çeşitli diğer hücre türleri. Bununla birlikte, bazı somatik yeniden programlama kullanılan edilmemiş hücreler ve hastalık durumunda özel dokularda çeşitli hücre tiplerinin yeniden programlama yetenekleri tarama vardır hala gereklidir.

Romatoid artrit (RA), tüm eklemleri grev ve diğer organlarda otoimmün koşullara yol açabilecek bir hastalıktır. RA gelişmiş dünyada erişkinlerin yaklaşık% 1'ini etkiler. Bu oldukça yaygın bir hastalıktır ve görülme sıklığı her yıl ⁸ artar. Ancak, RA erken evrelerde tespit etmek zordur ve yıkım oncebone zarar kurtarabilirsiniz hiçbir tedavi yoktur oluşur. Ayrıca, ilacın yararını hastadan hastaya farklılık gösterir ve Medic tahmin etmek zorgereklidir ine. Bu nedenle, bir ilaç-tarama yönteminin geliştirilmesi gereklidir ve RA şartlarını yansıtacak bir hücre malzeme gereklidir.

Fibroblast benzeri sinoviyosit (FLSs) RA ^9,10 patogenezinde aktif bir hücresel katılımcı vardır. FLSs de sinovyumdaki olarak adlandırılır eklem kapsülü ve oyuk arasındaki eklem iç yüzeyi bulunmaktadır. eklem yapısını destekleyen ve çevreleyen kıkırdak besinleri sağlayarak, FLSs genellikle eklem fonksiyon ve bakım önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, RA'da FLSs invaziv bir fenotip var. RA FLSs sonunda sonsuz çoğalması ¹⁰ çevreleyen kemik yok, bir kanser gibi fenotip vardır. Bu eşsiz özelliği ile FLSs RA patobiyolojisi yansıtabilir umut verici bir madde olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücreler nadiren üretilir, ve hücreler, in vitro çok geçitler geçmesi gibi hücre fenotipleri değiştirebilir durumlar. Nedenle, hastanın durumunu temsil edebilecek bir araç olarak RA FLSs kullanmak için karmaşık olabilir.

Teorik olarak, RA hasta kaynaklı iPSCs (RA-iPSCs) ilaç tarama ve ileri araştırmalar için ideal bir araç haline gelebilir. Oluşturulan iPSCs kendini yenileme yeteneğine sahip ve tutulan ve in vitro genişletilebilir. Pluripotensin, bu hücreler, RA ve diğer kemik ile ilgili hastalıklar ¹¹ özel araştırma için hücre materyalini katkıda olgun kondrosit ve osteosit soy, ayırt edilebilir.

Bu çalışmada, biz izole etmek ve Yamanaka faktörleri içeren lentiviruses kullanarak FLSs RA-iPSCs oluşturmak için bir ameliyatla çıkarıldı sinovyum ve nasıl dan FLSs genişletmek için nasıl gösterilmektedir.

Protokol

Etik Beyanı: Bu çalışma protokolü Kore Katolik Üniversitesi (KC12TISI0861) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Sinoviyosit İzolasyon ve Genişleme

1. sinoviyosit İzolasyon
   1. cerrahi makas iki çift ve forseps bir çift sterilize edin.
   2. 100 mm çanak sinoviyal doku transferi ve% 1 penisilin / streptomisin içeren fosfat tamponlu tuz, 5 ml (PBS) ile yıkanır.
   3. sarımsı yağ dokusu ve kemik kalıntılarını kesti. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde% 20 Fetal büyükbaş hayvan serumu (DMEM) (FBS) 5 ml 6 yuvalı bir plaka iyi kesilmiş doku transferi ekleyin.
   4. adet tek kullanımlık pipet nüfuz kadar küçük olana kadar makas ile dokuları doğrayın.
   5. 50 ml'lik bir konik tüp doku içeren medya aktarın. 6-çukurlu plaka% 20 FBS ile 5 ml DMEM ilave edilerek kalan malzemenin Hasat ve tüpe aktarın.
   6. buz üzerinde Çözülme kollajenaz. % 0.01'lik bir nihai konsantrasyona kadar kolajenaz ekleyin ve parafilm ile tüp mühür. 4 saat çalkalanarak 37 ° C'de bir su banyosu içinde inkübe edin.
   7. Toplam hacim, 10 dakika boyunca 300 x g'de 50 ml ve santrifüj RT kadar inkübe edildikten sonra,% 20 FBS DMEM ile tüp doldurun.
   8. pelet bozmadan Süpernatantı ve pelet tekrar süspansiyon medya 40 ml ekleyin.
   9. Yineleyin 1.1.10-1.1.11 adımları.
   10. % 20 FBS DMEM, 25 ml pelet yeniden süspanse edin ve dibe çökmesi için doku büyük topaklar bekleyin.
   11. 100 mm tabak süpernatantı aktarın ve 14 gün için% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
2. Sinoviyosit Bakım ve Genişletme
   1. plaka kullanılan ortam atın ve 5 ml PBS ile yıkama hücreleri.
   2. 1 ml PBS / 1 mM EDTA ekleyin ve 2 dakika için% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
   3. yavaşça çanak ve transfe dokununR 15 ml konik bir tüp hücre. 2 dakika boyunca 250 xg'de RT hücreleri santrifüjleyin.
   4. Pelet bozmadan süpernatantı ve% 20 FBS ile DMEM, 30 ml pelletini.
   5. görünür bir artık materyal bırakmadan, 3 x 100 mm yemekleri hücreleri aktarmak.
   6. taze medya her 3 d ile değiştirin. 1 ml PBS / 1 mM EDTA kullanılarak% 80 birleşme hücreleri Böl. Kullanmadan önce geçiş 3 kadar koruyun. Her bölünmüş 3 yemeklerin içine hücrelerin her yemeğin bölün.
      NOT: geçit 3 ulaştıktan sonra, hemen kullanılmalıdır gidiş değildir hücreler dondurularak muhafaza edilebilir.

Lentiviruses kodlayan Yamanaka Faktörler kullanma 2. yeniden programlanması FLSs

1. İletimi (D0)
   1. Büyüme ortamı içinde bir 6-yuvalı plaka oyuk başına tohum 3 x 10 ⁴ hücreleri (DMEM 500 mi,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş). % 5 CO, 37 ° C'de hücreler O / N inkübe2.
   2. 4 ° C'de derin dondurucu ve çözülme ile ilgili Oct4, Klf4 Sox2 ve c-Myc: Ertesi gün, 4 Yamanaka faktörleri içeren lentivirüs bir vial çıkarın. Not: lentivirüs önceki çalışmamızda ^11'de tarif edilen prosedüre göre hazırlanır.
   3. virüs cozundururken, 10 ug / ml heksadimetrin bromür ve 50 ug / ml askorbik asit ihtiva eden (DMEM içinde% 20 FBS artı antibiyotikler) FLS büyüme ortamında bir ortam.
   4. medya değiştirdikten sonra, hücrelere lentivirüs 30 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. enfeksiyon geliştirmek için, 680 x g'de, 30 dakika süre ile 35 ° C 'de plaka santrifüj.
   5. Santrifüj işleminden sonra,% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
2. Yeniden programlanması kadar bakım Görünür olduğunu
   1. 3 gün için, 0.1 mM sodyum bütirat ve 50 ug / ml askorbik asit içeren FLS büyüme ortamı ile günlük olarak ortamı değiştirin.
   2. Sonraki gün, FLS büyüme ortamı içeren bir karışım ile değiştirin ve0.1 mM sodyum bütirat ve 50 ug / ml askorbik asit içeren (1 oranında 1) iPSC ortam.
      Not: iPSC ortamının bileşenleri malzemeleri / ekipman listesi verilmiştir.
3. Koloni Formasyonu için Yarma Hücreleri
   1. Bir vitronektin kaplı 6 oyuklu plaka hazırlanması.
      1. Ca ²⁺ ve Mg ²⁺ olmadan 6 ml PBS 60 ul vitronektini ekleyin. Her bir kuyu, karışımın 2 ml koyun ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe. Not: vitronektin çalışma konsantrasyonu 5 ug / mL'dir.
   2. D5, hücrelerin PBS ile yıkayın.
   3. Hücreleri ayırmak ve 2 dakika için 37 ° C,% 5 _CO2 inkübe 1 ml PBS / 1 mM EDTA.
   4. 2 dakika boyunca 250 xg'de RT hücreleri ve santrifüj hasat edilir.
   5. (9: 3, 1: 6 ve 1: 1), farklı confluencies elde etmek için, 3 farklı oranlarda hücreleri Böl. Hücre pelet ve tekrar süspansiyon Medyanın 900 ul ekleyin. Bir 6- oyuk başına hücre karışımı 300, 150, ve 100 ul eklesırasıyla 9: 3, 1: 6 ve 1 oyuklu plaka 1 oranının elde edilmesi için.
   6. koloniler görünene kadar iPSC medya ile günlük medya değiştirin. Koloniler hakkında D18 sonra görünecektir. Not: Bu aşamada, iPSC koloniler olmayan yeniden programlanması FLSs ile birlikte bulunmaktadır.
4. koloni toplama
   1. oyuklara 500 ul vitronektin ekleyerek 48 oyuklu vitronektin kaplı plaka hazırlanması ve en az 1 saat süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir.
   2. Temiz bir bankta mikroskop yerleştirin ve inkübatör 6-plaka çıkarın.
   3. 48 oyuklu plaka vitronektin çözüm çıkarın ve 10 mM Rho-bağlantılı sarmal bobin ihtiva eden bir protein kinaz (rock) inhibitörü ile takviye edilmiş 500 ul iPSC ortamı eklenir.
   4. Bir 10p pipet kullanarak, koloni çevresinde kesti. 48 oyuklu plakanın bir oyuğuna aldı koloni aktarın.
   5. Birkaç koloniler seçmek sonra, 37 ° C,% 5 CO ₂ inkübe hücreleri.
   6. koloniler büyük eno kadar hücreleri korumakUh transferini. Not: koloni 100X büyütmede inceledi mikroskop görünür alanının, dışarı çıktığında genellikle hücrelerin döktü.

3. İmmünofloresan Boyama

1. Hücre hazırlanması
   1. 12 oyuklu bir plakaya steril 18 mm kapak camı.
   2. serin ve cam kapak durulama PBS 1 ml ekleyin.
   3. 10 ug / ml, vitronektin çözeltinin 1 ml'si ile değiştirin.
   4. en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe plakası.
   5. Günlük ortamının değiştirilmesi, 37 ° C,% 5 _CO2 seviyesinde 7 gün vitronektin kaplı 12 oyuklu plaka ve kültürde vitronektin çözeltisi ve plaka iPSCs atın.
2. Hücre boyama
   1. Kültür ortamı atın ve bir kez PBS ile hücreleri yıkayın.
   2. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile% 0.4 paraformaldehid (PFA) hücreleri saptamak.
   3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği.
   4. permeabilization kaldırPBS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 2 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden çözelti ve blok.
   5. . PBS Tablo 1 'e göre% 2 BSA içeren antikorlar seyreltilir, oda sıcaklığında 2 saat süre ile primer antikorlar ile inkübe hücreleri.
   6. ikincil antikoru (1 seyreltilmiştir: 200) ilave edin ve ışık kaçınarak, oda sıcaklığında 1 saat inkübe hücreleri.
   7. 1 ul / 10 dakika boyunca mL DAPI ile hücrelerin tedavi edin.
   8. antifade reaktif ile kayıcı camın üst kapak camı ve ışığı kaçınarak 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   9. Bir floresan mikroskop ile ifade edin.

4. Gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)

1. Guanidinyum tiosianat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi ¹¹ kullanılarak hücre pelletinden mRNA ekstrakte edin.
2. Ters transkripsiyon ¹¹ kullanılarak toplam mRNA 2 ug cDNA yükseltmek.
3. cDNA tem 2 ul kullanılarak PCR için gerekli bileşenleri karıştırınPlaka ^11.
4. RT-PCR gerçekleştirin ve jel elektroforezi ¹¹ ile sonuçları doğrulayın.

5. Alkali Fosfataz (AP) Boyama

1. 37 ° C'de 5-7 gün süre ile kültür iPSCs, boyamadan önce% 5 _CO2.
2. medya aspire ve 1 dakika boyunca% 4 PFA hücreleri saptamak.
3. fiksatif atın ve 1X durulama tamponu ile hücrelerin yıkayın.
4. AP lekelenmesi için reaktifler hazırlayın. Aşağıdaki oranda reaktifler karışımı: Fast Red Violet: naftol AS-BI fosfat çözeltisi: su = 2: 1: 1 arasındadır.
5. ışık kaçınarak 15 dakika boyunca oda sıcaklığında boyama solüsyonu ile inkübe hücreleri.
6. boyama çözüm atın ve durulama tamponu ile hücrelerin yıkayın.
7. kurumasını önlemek ve parlak alan mikroskop kullanılarak ifadesini doğrulamak için hücrelerin PBS ile örtün.

Sonuçlar

Bu çalışmada, bir lentiviral sistemi kullanılarak FLSs gelen iPSCs oluşturmak için bir protokol açıklar. Şekil 1A FLS izolasyon protokolü basit bir şemasını gösterir. sinovyanın cerrahi olarak çıkarılması ardından, doku cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde doğranmış edildi. Kollajenaz doku kümeleri hücreleri izole etmek için ilave edildi. Hücreler, daha sonraki işlemlerden önce 14 gün boyunca inkübe edilmiştir. Şekil 1B izole ...

Tartışma

iPSCs keşfinden önce, bilim adamları başta farklılaşma ile kök hücre biyolojisi ve diğer hücre soyları incelemek için EKH kullanılır. Ancak, EKH bir erken evre embriyo bir blastosist, iç kitle kaynaklanır. EKH izole etmek için, blastosist tahrip üstesinden gelinemez etik sorunlar yükselterek, kaçınılmazdır. EKH stemness özellikleri ve pluripotensini olsa Ayrıca, bu bireylerden elde edilemez ve bazen de kişisel analizleri ve hastalık taranması için ideal bir araç bulunmaktadır.

2007 yılında, ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 mm Çanak	TPP	93100
6 Kuyulu Plaka	TPP	92006
50 ml Kornik Tüp	SPL	50050
15 mlL Kornikal Tüp	SPL	50015
10 ml Tek Kullanımlık Pipet	Falcon	7551
5 ml Tek Kullanımlık Pipet	Falcon	7543
12 Kuyulu Plaka	TPP	92012
FLS İzolasyon Malzemeleri
Cerrahi Makas
Cerrahi Forcep
DPBS	Yaşam Teknolojileri	14190-144
DMEM	Yaşam Teknolojileri	11995-073
Penisilin Streptomisin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Yaşam Teknolojileri	16000-044
Kollajenaz	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS / 1 mM EDTA	Yaşam Teknolojileri	12604-039
iPSC Üretim Malzemeleri< / güçlü>
DMEM	Yaşam Teknolojileri	11885
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (100x)	Yaşam Teknolojileri	11140-050
β-Merkaptoetanol	Sigma Aldrich	M3148
Polibren	Chemicon	TR-1003-G
Penisilin Streptomisin	Yaşam Teknolojileri	P4333
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC besiyeri bileşeni (500 ml)
Sodyum Bikarbonat	Life Technologies	25080-094	iPSC besiyeri bileşeni (Conc.: 543 μ g / ml)
Sodyum Selenit	Sigma Aldrich	S5261	iPSC medya bileşeni  (Konsantrasyon: 14 ng/mL)
İnsan Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC medya bileşeni (Conc.: 10.7 μ g/ml)
Temel FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC medya bileşeni  (Konsantrasyon: 100 ng/ml)
İnsan İnsülin	Yaşam Teknolojileri	12585-014	iPSC ortam bileşeni (Conc.: 20 μ g / ml)
İnsan TGF ve beta; 1	Peprotech	100-21	iPSC medya bileşeni (Konsantrasyon: 2 ng/ml)
Askorbik Asit	Sigma Aldrich	A8960	iPSC medya bileşeni  (Devamı: 64 μ g / ml)
Polibren	Chemicon	TR-1003
Sodyum Butirat	Sigma Aldrich	B5887
Vitronektin	Yaşam Teknolojileri	A14700
ROCK İnhibitörü	Sigma Aldrich	Y0503
Kalite Kontrol Malzemeleri< / güçlü>
18 mm Kapak	Camı Üstün	HSU-0111580
%4 Paraformaldihit (PFA)	Teknoloji ve Yenilik	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Sığır Serum Albümini (BSA)	Vektör Laboratuvarı	SP-5050
Anti-SSEA4 Antikoru	Milipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antikoru	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antikor	Milipore	MAB4360
Anti-Klf4 Antikoru	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG (H + L) antikoru	Moleküler Prob	A11029
Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan IgG (H + L) antikoru	Moleküler Prob	A11037
DAPI	Moleküler Prob	D1306
Uzatma altın antifade reaktifi	Invitrogen	P36934
Sürgülü Cam, Kaplamalı	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Kloroform	Sigma Aldrich	366919
İzoprilalkol	Kırlangıç 109634
Etanol	Dükkan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Sentez kiti	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polimeraz	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Tampon Ömrü	Teknolojileri	15581-044
yükleme yıldızı	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA merdiven işaretleyicisi	Enzimomik	DM003
Alkalin Fosfataz	Millipore	SCR004