Method Article

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Popülasyon ve aile temelli genetik çalışmalar tipik olarak bir klinik hastalık veya fenotiple istatistiksel olarak ilişkili genetik varyantların tanımlanmasıyla sonuçlanır. Birçok hastalık ve özellik için, çoğu varyant kodlamasızdır ve bu nedenle, gen ekspresyonunu kontrol eden ince, tahmin edilmesi nispeten zor mekanizmaları etkileyerek hareket etmesi muhtemeldir. Burada, kodlama yapmayan varyantları önceliklendirmek ve bunları işlevleri açısından taramak için genel bir stratejik yaklaşım açıklıyoruz. Bu yaklaşım, fonksiyonel genomik veri tabanları kullanılarak hesaplamalı önceliklendirmeyi ve ardından transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler) riskli ve risksiz alellere diferansiyel bağlanmasının deneysel analizini içerir. Genetik varyantların hem elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) hem de DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için, hastalığın veya fenotiple ilgili hücrelerin nükleer lizatındaki faktörleri tanımlamak için sentetik bir DNA oligonükleotidi (oligo) kullanılır. EMSA için, bağlı nükleer faktörleri olan veya olmayan oligonükleotidler (genellikle TF'ler), bir tris-borat-EDTA (TBE) poliakrilamid jel üzerinde denatüre olmayan elektroforez ile analiz edilir. DAPA için, oligonükleotidler manyetik bir kolona bağlanır ve DNA dizisini spesifik olarak bağlayan nükleer faktörler, kütle spektrometresi veya indirgeyici sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve ardından Western blot analizi yoluyla ayrıştırılır ve analiz edilir. Bu genel yaklaşım, herhangi bir hastalık, özellik veya fenotiple ilişkili kodlamayan genetik varyantların işlevini incelemek için yaygın olarak kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıralama ve genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS), aday odağı çalışmaları da dahil olmak üzere genotiplendirme dayalı çalışmalar, ve derin sıralama çalışmaları, istatistiksel bir hastalık, özellik veya fenotip ile ilişkili birçok genetik varyantlar belirledik. Erken tahminler aksine, bu varyantlar (85-93%) en kodlayıcı olmayan bölgelerinde bulunur ve protein 1,2 amino asit dizisini değiştirmezler. Bu kodlayıcı olmayan varyantları işlevini yorumlama ve ilişkili hastalık onları bağlayan biyolojik mekanizmaları belirleyen özellik veya fenotip 3-6 zorlu kanıtlanmıştır. gen ifadesinin - Biz önemli bir ara fenotip için varyantları bağlantı m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çözümler ve Reaktiflerin hazırlanması 1.

  1. EMSA ve DAPA kullanılmak üzere özel DNA oligonükleotid probları sipariş edin.
    1. Kısa oligos tasarım spesifik olmayan bağlanma proteini azaltmak için 30, ve 17 bp'lik endojen genomik sekans ile çevrili merkezi doğrudan özel bir varyantı yer (35-45 baz uzunluğunda çifti (bp) arasında). EMSA oligo için, bir 5 'fluorofor ekleyin. DAPA oligos için, 5 'biotin etiketini ekleyin.
    2. duyu ipliği ve ters tamamlayıcı iplikçik hem sipariş edin. Alternatif olarak, sipariş dubleks (pre-tavlı) oligos. oligos adlandırırken, yerleşmiş bir referans genom üzerinde isimlendirme temel.
      Not: "R....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

lizat kalitesi özelliği açısından bir EMSA veya DAPA ve değişkenliği yaparken Bu bölümde, ne temsilcisi sonuçları verilmektedir. Örneğin, birden çok kez dondurma ve çözme, protein örnekleri denatürasyon neden olabilir öne sürülmüştür. Bu "dondurma-çözme" döngü bağlamında EMSA analizi tekrarlanabilirliğini incelemek için, bir gen varyant farklı iki adet 35 bp'lik oligo belirtilen miktarda çözülmüş ve yeniden dondurulmuştur nükleer lizat tek bir toplu ile inkübe edildi . zamanların

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sıralama ve genotiplendirme teknolojilerindeki gelişmeler büyük ölçüde hastalıkla ilgili genetik varyantları tanımlamak için kapasitemizi gelişmiş olmasına rağmen, bu varyantlar etkilenen fonksiyonel mekanizmaları anlamak için yeteneğimizi kalıyor. Sorunun ana kaynağı olasılıkla gen ekspresyonunu kontrol zor-arası tahmin mekanizmaları etkileyen ilgili kodlama genomunun bölgeler birçok hastalıkla ilişkili varyantları n yer olmasıdır. Burada, biz büyük olasılıkla çok kodlayıcı olmayan varyantları işlevine katkıda ol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol geliştirmedeki katkıları ve yönlendirmeleri için Erin Zoller, Jessica Bene ve Lindsey Hays'e teşekkür ederiz. MTW, kısmen NIH R21 HG008186 ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı'ndan bir Mütevelli Ödülü hibesi ile desteklendi. ZHP kısmen T32 GM063483-13 tarafından desteklendi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Özel DNA OligonükleotidlerEntegre DNA Teknolojilerihttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potasyum KlorürFisher ScientificBP366-500KCl, CE tamponu için
HEPES (1 M)CE ve NE tamponu içinFisher Scientific15630-080
EDTA (0.5M), pH 8.0Yaşam TeknolojileriR1021
Sodyum KlorürFisher ScientificBP358-1NaCl, NE tamponu
Tris-HCl (1M) için, pH 8.0InvitrogenBP1756-100Tavlama tamponu için
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, hücre yıkama için
DL-Dithiothreitol çözeltisi (1 M)Sigma646563İndirgeyici ajan
Proteaz İnhibitörü KokteylThermo Scientific87786TF'lerin Katabolizmasını
Önler Fosfataz İnhibitörü Kokteyli Thermo Scientific78420TF'lerin fosforilasyonunu önler
Nonidet P-40 YedekIBI ScientificIB01140NP-40, nükleer ekstraksiyon için
BCA Protein Test Kiti ThermoScientific23225Protein konsantrasyonunu ölçmek için
Odyssey EMSA Tampon Kiti Licor829-07910Gerekli tüm EMSA tamponlarını içerir
TBE Jeller, %6, 12 KuyuEMSAInvitrogenEC6265BOX
(10x)EMSAThermo ScientificB52
Miltenyi Biotec130-092-318Gerekli tüm DAPA tamponlarını içerir
Licor Odyssey CLxLicorDAPA / EMSA
Antibiyotik-AntimikotikGibco15240-062için önerilen tarayıcı10.000 birim / ml penisilin, 10.000 & mikro içerir; g / ml streptomisin ve 25 & mikro; g / ml Fungizone® Antimikotik
Fetal Sığır SerumuGibco26140-079FBS, kültür ortamı için
RPMI 1640 OrtaGibco22400-071L-glutamin ve 25 mM HEPES içerir
CE, NE ve tavlama tamponu için TBE Tamponu için FactorFinder Başlangıç Kiti için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

Related Articles