Yöntem makalesi

Çizgili Deneyi Disosiye Hipokampal Nöronlar kullanarak Protein Substrat çekici veya itici Aktivite Eğitim için

10.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54096

⸱

19 Haziran 2016

 ,  ,  , 
1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Bu makalede

Özet

Akson kılavuz molekülleri, nöronal göçü ve hedeflenen büyüme konisi navigasyonunu düzenler. Kılavuz moleküllerin nöronları çekme veya itme yeteneğini değerlendirmek için güçlü bir yöntem olan şerit tahlili sunuyoruz. Bu protokolde, FLRT2'nin kültürlenmiş hipokampal nöronları itme yeteneğini göstererek şerit testini gösteriyoruz.

Özet

Büyüyen aksonlar, uçlarında büyüme konisi olarak adlandırılan oldukça hareketli bir yapı geliştirir. Büyüme konisi, aksonal büyümede gezinmek için hücre dışı çevresel ipuçlarıyla iletişim kurar. Netrin, yarık, semaforin ve efrinler, akson üzerindeki reseptörlere ve ko-reseptörlere bağlandıktan sonra aksonları çekebilen veya itebilen bilinen kılavuz moleküllerdir. Aktive edilmiş reseptörler, büyüme konisinde nöronun yapısını ve hareketini değiştiren çeşitli sinyal moleküllerini başlatır. Burada, bir kılavuz molekülün nöronları çekme veya itme yeteneğini değerlendirmek için bir şerit testi için ayrıntılı protokolü açıklıyoruz. Bu yöntemde, E15.5 farelerinden ayrışmış hipokampal nöronlar, fibronektin ve lösin açısından zengin transmembran protein-2 (FLRT2) ektodomaininin alternatif şeritleri ve kontrol immünoglobulin G (IgG) fragmanı kristalize edilebilir bölge (Fc) proteini ile işlenen laminin kaplı kaplar üzerinde kültürlenir. Hem aksonlar hem de hücre gövdeleri, 24 saatlik kültürden sonra FLRT2 kaplı şerit bölgelerinden güçlü bir şekilde itildi. Tau1 ile immünoboyama, nöronların ~% 90'ının, FLRT2-Fc kaplı şeritlere (~% 10) kıyasla Fc kaplı şeritler üzerinde dağıldığını gösterdi. Bu sonuç, FLRT2'nin bu nöronlar üzerinde güçlü bir itici etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bu güçlü yöntem sadece birincil kültürlenmiş nöronlar için değil, aynı zamanda nöroblastlar gibi çeşitli diğer hücreler için de geçerlidir.

Giriş

Akson rehberlik yeni oluşan nöronlar sinir sistemi 1,2 geliştirilmesi sırasında hedef aksonları göndermek süreçtir. Gelişmekte olan aksonlar büyüme konisinin denilen kendi ucunda son derece hareketli yapısını taşıyacak. büyüme konisinin aksonun yolunu gezinmek için hücre dışı ipuçları algılar. Rehberlik gibi yarık, semaforin'in olarak moleküller, ve ephrins, çekmek ya da akson 1,3,4 üzerinde uygun reseptörleri ve ko-reseptörleri ile etkileşim bağlı olarak aksonlar dağılmasına neden olabilir. aktive reseptörler akson ve büyüme konisi hareketler için onun iskelet organizasyonunu etkileyen büyüme konisinin sinyalleri aktarmak.

Çeşitli yöntemler, çekici madde ve itici moleküllerin etkisini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Kemo-çekiciler ve kovucular bir degrade konsantrasyonuna sahip büyüme / kültür ortamı içine uygulanabilir (örn., Dunn odası veya μ-slaytlar) mikro-p yüksek konsantrasyonlu noktada 5,6,ipette (örn., torna deneyi) 7 ya da banyo uygulaması (örn., büyüme konisi çöküşü deneyi) 8,9 ile homojen bir konsantrasyonda.

Diğer yöntemler, bir kemo-çekici ya da kovucu bir alt-tabaka 10-12 kadar bir plaka yüzeyi üzerinde kaplandığı bir şerit deneyi ya microcontact baskı (μCP) içerir. Thestripe tahlil başlangıçta civciv retino-tectal sisteminde 13 topografik haritalama analiz etmek 1987 yılında Bonhoeffer ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. Orijinal yöntem çizgili ve örgülü matrisleri kullanarak polikarbon Nucleopore membranlar üzerine kaplama proteinlerine bir vakum sistemi gereklidir. Sonraki sürümlerinde, rekombinant proteinleri doğrudan dar yarık silikon matrisler 14,15 kullanarak çizgili desen bir kültür plaka yüzeyinde basıldı. Son zamanlarda, çeşitli araştırma grupları başarıyla akson rehberlik molekül faaliyetleri 16-21 analizine bu şerit tahlil uyguladık.

Burada ayrışmış hipokampal nöronlar için akson rehberlik moleküllerinin çekim ya da itme ölçen bir şerit testi için ayrıntılı protokol mevcut. Özellikle, bu yöntem, minimal donatılmış laboratuvar ortamlarında uygulanabilir. Bu tahlil için, flüoresan bir alt-tabaka ve bir kontrol proteini sırayla değişen şeritler 90 mikron aralıkları olan bir silikon matris kullanarak plastik tabak üzerinde oluşturulan ve laminin ile kaplanmış. Bizim gösteri, E15.5 farelerin hipokampal nöronlar fibronektin ve lösin zengin transmembran protein-2 (FLRT2) ve Fc proteini 21 kontrol rekombinant ekto şeritler alternatif kültüre edildi ayrışmış. Kültür 24 saat sonra, akson ve nöronların hücre gövdeleri hem güçlü FLRT2 çizgili itilir edildi. Bir anti-Tau1 antikorla boyama FLRT2 itici güçlü olduğunu göstermektedir, nöronların% 90 FLRT2-Fc ile ~% 10 ile karşılaştırıldığında, Fc kaplı bölgelere nm yayıldığını gösterdihipokampal nöronlar 21 işlevi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan denekleri Prosedürleri Tıp Hamamatsu Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

Matris 1. Hazırlık

  1. Bir mikrodalga fırında ya da 5 dakika boyunca sıcak bir plaka üzerinde 4-8 silikon matris kaynatın ve onları laminer akış (çizgili yüzü yukarı) altında 1 saat boyunca tamamen kurumasını bekleyin.
    Not: Aşağıdaki prosedürler laminer akış altında yapılmalıdır.
  2. basınçlı hava üfleyin veya matrislerin çizgili tarafında herhangi bir tozu çıkarmak için şeffaf yapışkan bant kullanın. temiz çizgili tarafı tutmak bu yüzden sıkıca levha yüzeyine yapışabilir.
  3. Dikkatle bir parmak (; şerit tarafı aşağı çanak başına bir matrisin) ile bastırarak 6 cm plastik tabaklar üzerine matrisler yerleştirin. matris ve çanak arasındaki hava kabarcıkları kaçının. kültür çanak alt tarafında şeritler konumunu işaretleyin.
  4. matris eklemek için başarısız olursa, adım 1.2 tekrarlayın.

Nöron Kültürü 2. Çizgili Üretimi ve Laminin Kaplama

  1. floresan etiketli bir araya getiren proteini hazırlamak Fc-etiketli protein (10-50 ug / ml) ve bir flüoresan dye- karıştırılarak (25 ul enjeksiyon [Aşama 2.2] ya da 100 ul yerleşim yöntemi [Aşama 2.2.1] için her biri için her biri) konjüge edilmiş anti-insan Fc antikoru (1 oran 3: 30-150 ug / ml) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı.
  2. 22-G şırınga kullanarak, matrisin tarafında küçük bir delikten geçen basamak (2.1) 'de hazırlanan yeniden birleştirici proteinin 25 ul enjekte (Şekil 1A, 1C'de oklar ve 1 E).
    1. Seçenek olarak ise, matrisin üst açıklığına yeniden birleştirici proteinin 100 ul koyun ve çok küçük delikten çözeltisi aspire yaklaşık yarısı (Şekil 1A, 1C ve 1E oklar), yeniden birleştirici proteinin çizgili bölgelerinde kalır.
  3. 30 mi için çanak inkübebir hücre kültür inkübatörü içinde 37 ° C de n.
  4. Matrisin tarafında bulunan küçük bir delikten üst yarık (Şekil 1B) ve aspirat içine PBS 300 ul yerleştirin (Şekil 1A, C ve E oklar) bekâr rekombinant proteinleri uzaklaştırmak için. proteinler kuruyacak, çünkü tamamen PBS aspire etmeyin. İki kez bu adımı yineleyin. (3 kez toplam)
  5. Alternatif bir kaplama oluşturma tüm şerit alanı kapsayacak şekilde, (Fc 10-50 ug / ml) dikkatli bir şekilde kontrol proteini ~ 100 ul yeri hemen matrisini ve. Daha sonra, hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika süreyle etiketlenir inkübe edin.
  6. PBS içinde ~ ile birlikte, bulaşık yüzeyi ile 20 ug / ml laminin 100 ul PBS ile üç kez, kapla yıkanmasından sonra.
    Not: Laminin katılaşmasını önlemek için buz üzerinde çözdürülmelidir.
  7. Hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de 1 saat süre ile çanak inkübe edin.
  8. PBS ile çanak Yüzeye üç kez yıkayın ve kültür medi ekleyinum. Kullanılana kadar 37 ° C'de bir% 5 CO2 inkübatörde kültür ortamı ile kaplanmış bir tabak yerleştirin.

E15.5 Fare Embriyolar 3. Kültürleme Hipokampal Nöronlar

  1. servikal dislokasyon ile anne Euthanize ve üç E15.5 embriyolar izole.
  2. sagittally makas ile baş orta hatta deri ve kafatası kesin ve küçük bir kaşık kullanarak beyin kaldırmak. Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 3 ml ihtiva eden bir 60 mm Petri kabı dikkatlice beyin aktarın.
  3. Bir neşter kullanılarak, korteks, hipokampus ve striatum (Şekil 2A) de dahil olmak üzere hemisfer kesip. Daha sonra, dikkatli bir şekilde meninks kaldırarak hipokamp bölgesinin teşrih ve buz (Şekil 2B-C), HBSS çözeltisi 2 ml ihtiva eden bir 15-ml santrifüj tüpüne parçalara hipokampal dokuların aktarın. 8 tabağın nöronları kültürünün oluşturulması için yeterli olan bir tüp içinde 3 embriyolar, 6 hipokampları toplayın.
  4. H Değiştirtripsin / EDTA solüsyonu (2 mi) ve bir su banyosu içinde 15 dakika boyunca 37 ° C'de tüp inkübe ile BSS çözeltisi.
    Aspire HBSS santrifüj olmadan ve tüp eğerek HBSS çözüm süzün yok: Not.
  5. fetal sığır serumu (FBS), 500 ul ekleyerek tripsin aktivitesi etkisiz hale getirir.
  6. 5 dakika boyunca 100 x g'de karışımı santrifüjleyin. Süpernatantı ve kültür ortamına 2 ml pelet yıkayın. bir kez daha bu adımı yineleyin.
  7. Pipetleyin büyük bir delik ile 1.000 ul ucu kullanarak kültürü ortamında yukarı ve aşağı hippocampi 10 kez doku ayırmak (-ucu kesilmiş).
  8. Bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için aşağı düzenli (kesilmemiş) 1000-ul ucu değiştirin ve ayrışmış doku yukarı pipetlemeyin ve.
  9. Bir 80-100 mikron örgü hücre süzgecinden geçirerek tek hücre ayırın.
  10. 5 dakika boyunca 150 xg'de süzülür tek bir hücre süspansiyonu santrifüj.
  11. aspire Süpernatantı ve pell tekrar süspansiyonve kültür ortamının 2 ml (nöronlar).
  12. yoğunluk ve yaşama kabiliyetinin saptanması için tripan mavi boyama ile bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. stripes.The süspansiyonu, her resim grubu dikkatle tüm şerit bölgeyi kapsayacak şekilde yerleştirilmelidir daha sonra, kültür ortamı 150 ul 10.000 nöronlar plaka.

Anti-Tau1 Antikor kullanılarak Hücre Organları ve İmmünofloresan Boyama tarafından Aksonlar 4. Görselleştirme

  1. kültür, 24 saat sonra, yapışkan hücreleri bozmadan orta aspire ve önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehit (PFA) /% 4 sakroz, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında / PBS ile nöronların düzeltin.
  2. PBS ile plaka Yüzeye 3 kere yıkayın. İstenirse, gerekli antikor miktarını azaltmak için çizgili bölgenin etrafında bir daire çizmek için bir su itici kalem kullanın.
  3. 5 dakika için% 0.3 Triton X-100 / PBS ile nöronlar geçirgenliği.
  4. % 3 eşek serumu ve% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden bloklama çözeltisi ile nöronların inkübe4 ° C 'de% 1 eşek serumu içinde /% 0.1 Triton X-100 / PBS O / N: bir anti-Tau1 antikoru (200 1) ile kuluçkalandı ve ardından 30 dk.
  5. PBS ile plaka Yüzeye 3 kere yıkayın. % 1 sığır serum albümini (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS ile 30 dakika için bir florofor konjuge edilmiş anti-fare IgG antikoru ile nöronların inkübe edin.
  6. PBS ile plaka Yüzeye 3 kere yıkayın. antifade çözüm 50 ul kullanarak 18 mm x 18 mm cam kapak ile çizgili bölgeyi kaplayın. görüntüleme ile müdahale hava kabarcıkları, kaçının.
  7. GFP ve RFP ve 1000-msn pozlama süresi (Şekil 3) için, örneğin uygun sistemi kullanılarak floresan mikroskop, x10 objektif lens, filtre setleri ile floresan görüntüleri elde edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

E15.5 farelerde ayrışmış hipokampal nöronlar kaplandı ve floresan kontrol Fc (Şekil 3A-C) veya etiketli olmayan kontrol Fc ile sırayla değişen FLRT2-Fc (Şekil 3B-F) etiketli çizgili 24 st için kültürlenmiştir. Her iki durumda da, nöronlar toplanmış ve demetler halinde bunların aksonları genişletilmiş. Kontrol Fc / Fc şeritler, nöronlar floresan etiketli ve etiketsiz çizgili eşit olarak dağıtıldı ve rastgele yönde (Şekil 3A-C) aksonları g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol E15.5 fare hipokampus rekombinant protein ve ayrışmış nöronlar kullanan bir şerit deneyi anlatır. Bu deney, bir çizgili kalıp yerleştirilir ilgi konusu bir rekombinant proteinin nöronların, itici, çekici, ya da nötr yanıtların etkin gözlem sağlar. Bu protokolün bir büyük avantajı, özel matrisleri, bir vakum sistemi gerektirir, geleneksel yönteme kıyasla bir protein ile doğrudan plastik bir kaba yüzeyi üzerine yazdırılma şeritler, üretilmesi için basit bir yöntem ve bir Nucleopore membran 20 21. Pr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (23700412, 25122707 ve S.Y.'ye 26670090) Bilimsel Araştırma Hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 ml santrifüj tüpüViyola 1-3500-01
%4 Paraformaldehit (PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Keçi anti-insan IgG antikoruThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Eşek anti-fare IgG antikoru ThermoScientificA-21203Seyreltme 1/500
Anti-Tau1 antikoruChemiconMAB3420Seyreltme 1/200
AntifadeThermo ScientificP7481Alternatif montaj ortamı kullanılabilir
B27 takviyesiThermo Scientific17504-044Seyreltme 1/50
Sığır serum albüminiSigma01-2030-2
Hücre süzgeci 100 umBD Falcon352360
Santrifüj makinesiKubota2410
Kapak camı 18mmx18mmMatsunami18x18 mm No. 1
DAKO kalemDAKOS2002Alternatif su itici kalem kullanılabilir
Tek kullanımlık neşterTüy2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
Fluorecent mikroskopNikonE600
Forseps No. 5Güzel Bilim Araçları11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Seyreltme 1/100
Hamilton ŞırıngaHamilton805N22 ölçü, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
İnsan IgG, Fc ParçasıJackson009-000-008
LamininTermo Bilimsel23017-015
NörobazalTermo Scientific21103-049
Normal Eşek SerumuJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Penisilin-StreptomisinThermo Scientific15070-063Seyreltme 1/100
Plastik kültür kabı, 60 mm ThermoScientific150288
Silikon MatrislerProf. Martin Bastmeyer'den temin edilebilir ve satın alınabilir (bastmeyer@kit.edu)
Stereo MikroskopOlympusSZ61
Uç, 1000 uLWatson125-1000S
Şeffaf yapışkan bantTesa57315Alternatif yapışkan bant kullanılabilir
Triton X-100SigmaT8787
Tripan mavisi, %0.4Bio-Rad145-0013
Tripsin / EDTAThermo Scientific25300-054
B27, GlutaMAX ve Penisilin-Streptomisin ile desteklenmişkültür ortamı
Nörobazal.

Kaynaklar

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Akson K lavuzlamasProtein tmesiFLRT2 ProteiniDissosiye N ronlarLaminin KaplamaTau1 mmunboyamaH cre K lt rProtein Ba lanmas

İlgili makaleler