Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Programlanmış hücre ölümü Apoptozis gibi çok hücreli organizmalar^1,2,3, yaralı, istenmeyen veya tehlikeli hücrelerde ortadan kaldırarak embriyonik geliştirme ve normal homeostazı önemli bir rol oynar. Hücre ölüm ve yaşam arasında denge kaybı kanser, kalp yetmezliği, otoimmünite ve dejenerasyon^4,5,6,7,8gibi ölümcül sonuçlara yol açabilir. Caspases geleneksel olarak "dönüş yok" apoptoz^9,10,11, olarak kabul edilmiştir Cellat aktivasyonu hızlı ve büyük hücresel yıkım^{12tetikler, 13,14,15,16}. Bu genel dogma zorlu, kültürlü ölmekte olan Primer hücre ve kanser hücrelerinin değil sadece caspase harekete geçirmek, ama aynı zamanda aşağıdaki önemli hücre sonra plazma zarı blebbing, hücre büzülme de dahil olmak üzere ölüm işaretlerinden kurtarabilirsiniz gösterdi, Mitokondrial parçalanma, mitokondrial sitokrom c yayın sitozol, nükleer ve Kromatin yoğunlaşma, DNA hasarı, nükleer parçalanma, içine hücre yüzey teshir edilmesi Fosfatidilserin (PS) ve apoptotik organları oluşumu ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21}. ölen hücreleri hücre ölüm uyaranlara^17,18,19,20, kaldırdıktan sonra kurtarabilirsiniz olarak önerdiğimiz bu anastasis bir iç hücre kurtarma olgu olduğunu ²¹. dönem "Anastasis" (Αναστάσης)¹⁸"için Yunanca olarak hayata yükselen" anlamına gelir, icat bu beklenmedik hücre kurtarma fenomeni açıklamak. Anastasis bizim gözlem daha sonra Fosfatidilserin dışa^22,23,24, mitokondrial sınırlı da kurtarma hücre ortaya son bağımsız çalışmalar tarafından desteklenen dış membran permeabilization²⁵, karışık soy kinaz benzeri aktivasyon (MLKL) ve hücre büzülme²⁶.

Anastasis düzenleyen mekanizmalar karakterize paradigma kayması fizyolojik, patolojik ve tedavi edici etkileri olacaktır. Anastasis kurtarmak ya da ventrikül sol ventrikül kaldırarak önemli postmitotic hücreleri ve değiştirmek zor olan doku ve muhtemelen kalp yetmezliği tersine çevirme için hesabı korumak için daha önce bilinmeyen cytoprotective mekanizma temsil edebilir aygıtlar (LVADs)^27,28, kurtarma sonra aşırı ışık^29,30,31geçici pozlama veya onarım nöronların photoreceptor hücrelerinin beyin yaralanması³²sonra yardımcı. Öyleyse Anastasis teşvik hücre ve doku kurtarma geliştirmek. Diğer taraftan, anastasis kanser nüks^17,18neden terapi, hücre ölüm neden hayatta kalmak için kanser hücreleri tarafından kullanılan bir beklenmeyen kaçış taktik olabilir. Bu nedenle, anastasis kanser hücrelerinin sırasında ölüyor ve kanser tedavisi yanında onların nüks önleme kanser tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi olabilir sonra bastırmak.

Anastasis işlemi sırasında biz bulduk kurtarılan bazı hücreler kalıcı genetik değişiklikler satın aldı ve oncogenic dönüşüm uygulandı, DNA hasar nedeniyle büyük olasılıkla apoptosis^18,20sırasında^{,21 tahakkuk} . DNA zarar görmüş hücreleri ölüm sürecinin tersine tumorigenesis bir mekanizma olabilir, özofagus kronik termal yaralanma indüklenen gibi potansiyel olarak doku yaralanması tekrarlanan gözlem altında yatan dokuları, çeşitli kanser riskini artırır çok sıcak içecekler^33,34,35, alkolizm^36,37nedeniyle karaciğer hasarı, tümör evrim tüketimi ise kanser terapisi^38, sonra tarafından ^39,40ve anti-kanser tedavisi^41,42,43,44 döngüleri arasındaki aralıkları sırasında ortaya çıkan normal dokuların üzerinden yeni kanser gelişimi . TRUE ise, anastasis hedefleme önlemek ya da kanser gelişme ve ilerleme tutuklandı. Biz ölmekte olan germ hücreleri açlıktan kaynaklı anastasis yeniden beslenen Drosophila¹⁹geçmesi bulduk.  Germ hücreleri DNA hasarı Anastasis ortaya çıkarsa, hesap çevresel stres uzun süreli gözlem için genetik hastalıklar gelişimini destekler olabilir. Örneğin, kıtlıklar diyabet ve Koroner kalp hastalıkları⁴⁵gibi transgenerational devralınabilir hastalıkların gelişmesine katkıda bulunmak. Bu nedenle, anlayış anastasis devralınabilir hastalıklar bu potansiyel mekanizması tarafından neden geliştirme önleme stratejileri neden olabilir.

Anastasis keşfi koşum ve yenilikçi tedaviler geliştirmek için doğrudan için sebep ve sonucu anastasis Canlı hayvanlarda eğitim esastır. Ancak, bu teknik olarak tanımlamak ve anastatic hücreleri vivo içindeçünkü hücre ölüm işlemi kurtarılan hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez görünür ve hiçbir biyomarker anastasis izlemek için zordur tespit henüz^17,18,21. Biz son zamanlarda yeni bir in vivo caspase Biyoalgılayıcı tanımlamak ve sonra caspase harekete geçirmek^19,46, Apoptozis hayatta hücreleri izlemek için "CaspaseTracker"¹⁹, Özel Sigara İçilir bu sorunları çözmek için geliştirilen Hallmark apoptosis^10,14. SCAT^12,47, Apoliner⁴⁸, CA-GFP⁴⁹, ApoAlert^18,50, C3AIs⁵¹ ve iCasper^{52 gibi "gerçek zamanlı" caspase biyosensörler dan ayırt} devam caspase aktivite algılayan, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı, ayrıca kalıcı olarak hücreleri bu hızlı caspase etkinliği bile geçici etiket yeteneği sahiptir. Bu nedenle, caspase-aracılı ters hücre sonra ölüm süreci içinde vivoCaspaseTracker Biyoalgılayıcı anastasis uzun vadeli izlenmesini sağlar.

1) CaspaseTracker Biyoalgılayıcı hazırlanması uçar

1. CO₂sinekli anestezi ve sinek yiyecek ve taze Maya yapıştır ile aynı şişe içinde 7 ila 10 caspase duyarlı Gal4 (DQVD)¹⁹ bakire kadın ve 7 10 G-izleme⁵³ Gal4 muhabir genç erkek sinek (veya tersi) aktarmak için bir fırça kullanın.
   Not: Çapraz Caspase duyarlı (DQVD) Gal4 ve G-izleme Sineklerin Tanrısı CaspaseTracker döl sinekler üretecek. Caspase - duyarlı (DQVA)'¹⁹ Gal4 çapraz ve G-izleme sinekler (konuya bakın) negatif kontrol uçar sağlayacaktır. Taze Maya Yapıştır o döl sayısı artar bu yüzden yumurta üretimi, geliştirmek için protein kaynağı olarak hizmet vermektedir. Bakire kadın ve genç erkek sinek onların fenotipleri⁵⁴göre seçin.
2. Sinekler, 18 santigrat derece (^oC) sırasında çapraz için 3-7 gün kuluçkaya ve sonra yeni bir çapraz 18 ° C'de ayarlamak için yeni bir şişe için sinekler aktarın Döl eclose uçar kadar 18 ° C'de orijinal şişe kuluçkaya devam'i tıklatın.
   Not: Üst sinek özgün flakon, döl, aşırı kalabalık önlemek için yeni şişeleri aktarın. Üst sinek döl taze yiyecek ve Maya salçası ilk 2-3 anahtarları oluşturabilir ve sonra verimliliği önemli ölçüde zamanla azalacak. Sinekler yükselterek 18 ° C CaspaseTracker Biyoalgılayıcı non-spesifik sinyal azaltabilir (konuya bakın).
3. Seçme döl ile doğru fenotipleri⁵⁴ aşağıdaki deneyler için uçar.
   Not: Burada transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme CyO dengeleyici ile dengeli ikinci kromozom bulunur. Her iki transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme olan kıvırcık kanat döl (olmadan CyO) seçin.

2) uygulama geçici hücre ölüm indüksiyon CaspaseTracker Biyoalgılayıcı uçar

1. 10 eclosed erkek taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile yeni bir şişe için 1 gün için 18 ° C'de yumurta odası üretimi oogenesis tarafından izin vermek için uçar-20 yeni transfer.
   Not: Dişi erkek sinek ile tutmak yumurta odası üretimini artırmak.
2. Soğuk şok Apoptosis geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler sonra-7 ° C için 1 h yerleştirilmiş olması yeni boş şişe aktarın.
   Not: soğuk şok kişi yaralandı hücreler plazma zarı yırtılması^55,56inducing tarafından.
3. Apoptozis protein açlık tarafından geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler 18 ° C'de % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe 3 gün boyunca aktarın.
   Not: Protein açlık (protein olmayan gıda) yumurta chambers apoptosis^57,58,59 ve autophagy^60,61geçmesi tetikleyebilir. Sinekler sinek gıda Sükroz en iyi durumu tutmak için her gün % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe geçin.
4. Stresli sinekler geri yeni bir şişe taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile onları kurtarmak izin vermek için 18 ° c 3 gündür aktarın. Aç ve yumurtalıkların yumurta odalarından açıklanan⁶²elde etmek için açlıktan kurtarılan sinekler incelemek.
   Not: Kopyalayabilmek Drosophila yumurtalık elde etmek için sinekler CO₂, anestezi ve forseps 2 Çift sinek baş kaldırmak için kullanın ve forseps Bankası yumurtalık "Sineklerin Tanrısı" kaldırmak için karın çekmek için kullanın.

3) fiksasyon ve disseke yumurta odalarının görüntüleme için boyama

1. 0.5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) çevresinde disseke yumurta chambers ile birlikte 1 mL santrifüj tüpleri için transfer. Yumurta yerleşmek izin verir.
   Not: Plastik pipet ipuçları %1 sığır serum su veya yumurta odaları ipuçları plastik yüzeyde sopa önlemek için PBS çözünmüş albumin (BSA) ile kat. Karanlıkta photobleaching kırmızı floresan protein (RFP, DsRed olarak da bilinir) önlemek için aşağıdaki yordamları gerçekleştirin ve yeşil flüoresan protein (GFP) yumurta odalarında.
2. Pipetting tarafından PBS kaldırın ve sonra 0.5 mL % 4 paraformaldehyde 20-30 dk için karanlık oda sıcaklığında yumurta chambers düzeltmek için PBS içinde geçerlidir.
   Not: Bu ve aşağıdaki kuluçka adımları nazik döndürme uygulama.
3. Pipetting tarafından paraformaldehyde kaldırın ve sonra yumurta odası 0.5 mL PBST ile yıkanmış (PBS + %0,1 Triton X-100) için 3 kere.
   Not: Uzun süreli fiksasyon RFP ve GFP sinyalleri azaltmak olabilir.
4. PBST ile yumurta salonları, oda sıcaklığında 1-2 h için kuluçkaya veya bir yumurta Chambers'ı permeabilize için nazik döndürme ile 4 ° C'de gece.
   Not: PBST Ayrıca BSA sigara kaplı plastik yüzey sopa yumurta chambers kaçının.
5. Pipetting tarafından PBST kaldırın ve daha sonra mavi nükleer Höchst boya PBST 10 μg/mL 0.5 mL yumurta salonları çekirdeği için leke için oda sıcaklığında 1-2 h için geçerli.
   NOTE1: Bu non-spesifik sinyal artacak gibi nükleer boya ile uzun süreli kuluçka kaçının.
   NOT2: Çekirdeği Höchst olmadan leke için alternatif yaklaşımdır 200 eklemek μL anti-beyazlatma DAPI montaj aracıyla (malzemeleri görmek) ve protokol 3.8 açıklandığı gibi cam kapak fişinde dokular Montaj önce gecede⁶³, kuluçkaya.
   NOTE3: photobleaching önlemek için karanlıkta boyama ve aşağıdaki yordamları gerçekleştirin.
6. Pipetting tarafından nükleer boya kaldırmak ve 0.5 mL için 10-20 dk kuluçka her yıkama adım arasında nazik rotasyon ile ile 3 kere 1 mL santrifüj tüpleri yumurta odasında yıkamayı PBST uygulayın.
7. İyi pipet ile tüm PBST kaldırmak ve sonra uygulamak 200 μL anti-beyazlatma montaj ajan (tüp altına yumurta chambers lavabo kadar yumurta odaları 3 h için oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de kuluçkaya için bkz: belgeleri).
   Not: tam montaj Ajan absorbe doku tüpün dibine lavabo.
8. 200 μL anti-beyazlatma ile aktarmadan tarafından lekeli yumurta chambers mount Ajan pipetting tarafından görüntüleme için önceden temizlenmiş cam slayt üzerindeki montaj yumurta Odaları bir 20 x 20 mm önceden temizlenmiş cam kapak notu ile kapak ve koyarak cam kaymak kapak fişinde mühür tırnak cilası kapak notu kenarında.
   NOTE1: Cam slayt ve kapak kayma su ya da % 70ini etanol ile önceden temiz.
   NOT2: Vazelin cam slayt ve yumurta chambers tarafından overcompression yok önlemek için kapak Not arasında geçerlidir.
9. Floresan veya 20 x NA 0,8 kullanarak confocal mikroskop kullanarak yumurta chambers görüntü planı-Apochromat amacı, nükleer boyama için uyarma ışık dalga boyu 405 nm ile (emisyon ~ 461 nm algılama), 561 nm RFP (devam eden veya son caspase aktivite) sinyal () için emisyon ~ 590 nm algılama) ve 488 nm GFP (geçmiş caspase aktivite) sinyal için (emisyon tespit ~ 518nm).
   Not: Yayımlanmış protokolümüze mikroskobu^20,64için bkz.

Hızlandırılmış canlı cep mikroskobu yolu anastasis kültürlü hücreleri20için güvenilir bir yöntem olmakla birlikte, kurtarılan hücreleri morfolojik ayırt edilemez görüntülendiðinden hangi hücrelerin anastasis hayvanlarda, uğramıştır tanımlamak zordur hücre ölümü teşebbüs değil normal sağlıklı hücreler. Örneğin, yanıt olarak hücre ölümü Apoptozis1,2,14, hücre büzülme, nükleer yoğunlaşma ve plazma zarı blebbing gibi morfolojik işaretlerinden insan servikal kanser HeLa hücreleri görüntülemek uyarıcı 1µM staurosporine17 (şekil 1A, şekil 1B i-II). Hücre ölüm uyarıcı ve kuluçka taze ortamda çıkardıktan sonra ölen hücreleri hücre ölüm süreci anastasis17,18tarafından morfolojik kurtarma (şekil 1B III-IV), tarafından belirtildiği şekilde tersine yayılması (şekil 1B v-VI) tarafından takip. Önceki çalışmalarımız de sonra caspase harekete geçirmek18,20ApoAlert (NES-DEVD-YFP-apoptosis iptali göstermek için NLS) gibi "gerçek zamanlı" caspase biyosensörler kullandık. Bu Biyoalgılayıcı sağlıklı hücrelere (şekil 1 c, 1 D ben) sitozol yerelleştirir. Hücre ölüm uyarıcı % 3.7 etanol tarafından tetiklenen caspase harekete geçirmek bu YFP tabanlı Biyoalgılayıcı i caspases tarafından ciddi ve nerede o birikir ve elde edilen nükleer floresan YFP etiketinin adıyla devam ile hücreleri tanımlayan çekirdeği, translocated caspase etkinliği (1 C rakam, 1 D II-III). Ölen hücreleri de sırasında etanol-indüksiyon1,14,18,20, borulu mitokondri, nükleer parçalanma gibi Apoptozis morfolojik işaretlerinden görüntülemek yoğunlaşma, hücre büzülme ve plazma zarı blebbing (şekil 1 d II-III). İlginçtir, hücre ölüm uyarıcı kaldırıldıktan sonra aynı hücreler yeniden elde etmek ve normal morfoloji (şekil 1 d IV-VIII) yeniden elde etmek. Özellikle, ApoAlert (Biyoalgılayıcı i ciddi) nükleer Floresans öldü (şekil 1 d IV-VIII) kurtarılan hücrelerdeki 1 saat içinde muhtemelen anastatic hasarlı bileşenleri ortadan kaldırmak benzer işlemler nedeniyle18 hücreleri , i ciddi caspase-3, PARP ve Apoptozis sırasında oluşturulan ICAD gibi. Bu nedenle, yeni bir strateji anastasis daha uzun bir zaman dilimi içinde özellikle vivo içindeizlemek için gereklidir.

Anastatic hücreleri kaderi izlemek için kalıcı olarak hücreleri tarafından Cellat caspase faaliyet i ciddi sonra etiketleri memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemi geliştirdi. Bu Biyoalgılayıcı bir caspase duyarlı rtTA (ters tetrasiklin kontrollü transactivator) ve Cre-LoxP tabanlı muhabir rtTA etkinliği (şekil 2A-B) için oluşur. Hiçbir caspase etkinlik ile sağlıklı hücreleri içinde transactivator rtTA65 plazma zarı çapa (Lyn11)66,67için çekirdek dışlama sinyal (NES) harita kinaz kinaz (MAPKK)68, gergin ve östrojen reseptör varyant (ERT2)69 caspase yarilabilir (DEVD)70 bağlayıcı aracılığıyla elde edilen PARP (şekil 2A, 2B). Hayvan zinciri rtTA sitozol çekirdek için translocate olamaz gibi rtTA muhabir etkinleştiremezsiniz. Ancak, yanıt olarak bir hücre ölüm uyarıcı harekete geçirmek caspases çekirdeği (şekil 2B) translocate rtTA boşaltma DEVD halkalı ayırmak. Bir kez çekirdeğinde, rtTA tet yanıt öğesi (TRE) ve tetikleyiciler geçici ifade stop kodonu kaset CAG organizatörü ve kodlama dizileri arasında kaldırır bir geri dönüşü olmayan rekombinasyon olay yol açar Cre recombinase bağlar Kırmızı floresan protein (DsRed). DsRed (şekil 2B), caspase etkinlik, aynı zamanda onların döl (şekil 2C) yaşamış sonra hayatta kalabileceği hücreleri kalıcı floresan marker olarak hizmet veren kalıcı ifade sonuçlanır.

Memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı test etmek için biz tarafından geçici transfection HeLa hücreleri tanıttı, bir hücre ölüm uyarıcı (1µM staurosporine) hücrelerle tedavi ve yaptığımız gibi hücre kurtarma hızlandırılmış canlı hücre confocal mikroskobu tarafından izlenen 20nitelendirdi. RtTA etkinlik65,71izin vermek için gerekli olan Doksisiklin (1µg/mL nihai toplama), deneme boyunca Biyoalgılayıcı açmak için hücre kültür orta eklendi. Hücre ölüm uyarıcı yanıt olarak, işlem görmüş hücreleri Apoptozis hücre büzülme ve plazma zarı blebbing beklenen (şekil 2B i-III) olarak da dahil olmak üzere, işaretlerinden görüntüler. Hücre ölüm uyarıcı kaldırdıktan sonra hücre katmanı bir kez ve ekleme taze kültür orta, anastasis durulama normal morfoloji (şekil 2B IV-VII) geri tarafından belirtildiği gibi ölmekte olan hücrelerdeki görülebilir. Eden, onları hem sigara kurtarılan hücreleri (şekil 2B IV-VII) ve kontrol hücreleri ayrım DsRed floresan işaretçiyi sırasında ve sonrasında anastasis (şekil 2B IV-VII), hücreleri express yalnızca yeniden elde etmek hücre ölüm uyarıcı (şekil 2E) maruz bırakılmamalıdır. Bu uygulama ve memeli CaspaseTracker programı belirlenmesi ve kalıcı olarak caspase-aktivasyon kurtarma anastatic hücreleri etiketleme yeni bir roman araç olarak gösterir ve izlemek ve daha uzun vadeli kaderlerini çalışma için bir yol sağlar.

Algılamak ve canlı hayvanlarda anastasis izlemek için CaspaseTracker Biyoalgılayıcı Transjenik hayvanlar gereklidir. Bu nedenle, biz ilk Drosophila melanogaster bir model sistem19, çünkü kullanılan önemli bir genetik olarak uysal canlı hayvan geliştirme ve insan hastalıkları72,73,74 çalışma için olduğu gibi ,75. Memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı değiştirilmiş olarak Drosophila çift Biyoalgılayıcı tanımlamak ve "son/caspase etkinlik"geçmiş"devam" dan ayırt. Bu ikili Biyoalgılayıcı caspase duyarlı Gal419ve Gal4 muhabir G-izleme53 (şekil 3A) oluşur. Etkinlik içermeyen caspase hücrelerde, Maya transkripsiyon faktörü Gal4 DIAP1 türetilmiş bir caspase yarilabilir bağlayıcı (DQVD) üzerinden bir plazma zarı çapa (mCD8) etki alanına hayvan zinciri (şekil 3B), yıkımı önlemek için 21NN/GV22 mutasyon sahip drICE caspase inhibitör işlevinde BIR1 etki alanı77kaldırılması için bağlayıcı afterAsp2076ve D135R mutasyon caspase bölünme üzerine N uç kuralı tarafından Gal4. Hayvan zinciri Gal4 caspase tarafından serbest bırakmak için bölünme olmadan çekirdeği için translocate olamaz, Gal4 muhabir G-izleme yok caspase etkinlik19sahip hücrelerde devre dışı kalır. Caspase harekete geçirmek, ancak, aktif caspases Gal4 G-izleme gazeteci (şekil 3A)19etkinleştirmek için çekirdek translocate azat DQVD bağlayıcı ayırmak. Gal4 için özel bağlar akıntıya karşı Gal4 kadar son veya geçerli caspase aktivitesinin floresan muhabir olarak hizmet veren dizileri (UAS) geçici transkripsiyon ve teklif toplama, ifade tetiklemek için etkinleştirme (caspase) etkinliğini durdurur ve sonra RFP proteindir bozulmuş. Gal4 da stop kodonu kaset Ubikuitin (UBI) organizatörü ve bir kodlama dizisi arasındaki çekirdeği hedefli GFP (nucGFP) kaldırır rekombinasyon olay önde gelen FLP recombinase transgene üzerinden ifade tetikler. Bu, hayatta kalmak ve caspase aktivite yaşamış hücreleri kalıcı marker olarak hizmet veren nucGFP, kalıcı ifadesi olur.

Apoptozis ve anastasis algılamak için Drosophila CaspaseTracker Biyoalgılayıcı test etmek için in vivo, erkek uçar CaspaseTracker tabi fizyolojik stres (şekil 3 c), hangi-ebilmek etkili bir şekilde19, soğuk şok gibi Tetikleyici hücre ölümü, caspase harekete geçirmek, nükleer yoğunlaşma ve hücre büzülme19,78ve membran bütünlüğü kaybı ve sitoplazmik kaçağı neden olan soğutma nedeniyle nekroz tarafından da belirtildiği gibi Apoptozis de dahil olmak üzere içeriği55,56. Beklendiği gibi CaspaseTracker yumurta etkinleştirilemedi nerede strese bağlı hücre ölümü değildi odaları kontrol uçar (şekil 3D) indüklenen. Buna ek olarak, stresli sinekler yumurta odaları soğuk şok sonra bir gün sadece karakteristik apoptotik hücre büzülme ve nükleer yoğunlaşma, ama aynı zamanda RFP ve GFP ifade, son varlığını gösteren veya (RFP +) devam ve son (GFP +) caspase gösterdi aktivite (şekil 3E). Ancak, 3 gün normal durum sigara vurgulayarak, GFP ama hiçbir RFP için stresli sinekler döndükten sonra kurtarılmış yumurta chambers (şekil 3F) ifade algılandı. Bu stres takip caspase aktivite dile getirmişti yumurta chambers hücre ölüm süreci aşmak ve hayatta mümkün olduğunu gösterir.

Daha fazla yumurta odaları19' reversibility hücre ölüm sürecinin sınamak için CaspaseTracker dişi sinekler % 8 Sükroz %1 agar 3 gün boyunca besleniyor sonra protein açlık tarafından vurguladı. Önceki çalışmalar gösterdi protein açlık caspase-aracılı Apoptozis ve somatik ile dokularda autophagy tetikleyebilir ve germ hücreleri, yumurta chambers57,60,61de dahil olmak üzere. Beklendiği gibi CaspaseTracker protein açlık (şekil 3 g) 3 gün sonra yumurta odasında çalıştırıldım. Ölmek üzere olan yumurta chambers apoptotik türleri morfoloji ve ifade son veya devam gösteren RFP ve GFP Biyoalgılayıcı işaretleri, (RFP +) ve (GFP +) caspase etkinliği (şekil 3 g) geçmiş sergiledi. CaspaseTracker önce caspase harekete geçirmek bir ölüm uyarıcı sonra karşılaştığınız kurtarılan hücreleri izleyebilirsiniz göstermek için yıldız sinekler sonra protein içeren normal sinek yemek için transfer edildi. Beklendiği gibi bu yeniden beslenen sinekleri kurtarılan yumurta odaları yok son veya devam eden caspase etkinliği (şekil 3 H) gösteren RFP geçici caspase muhabir yok. Ancak, normal gıda döndürerek stres giderici olduğunu belirten GFP caspase muhabir (şekil 3 H), hücrelerin bu yumurta odasında göstermesinden sonra bu sinekler yumurta odasında başlatılan hücre ölüm bir noktadan sonra bu ters bir işlemdir caspase harekete geçirmek. CaspaseTracker Biyoalgılayıcı faaliyet caspase tarafından tetiklenir doğrulama hangi caspase ayırmak değiştiremiyor ve hangi Biyoalgılayıcı etkinliği (şekil 3B, 3I kaldırılması DQVA, sıra ile göğüs arası sıra DQVD değiştirerek elde edildi ).

Drosophila CaspaseTracker protein açlıktan kurtarıldı sonra bulduk (folikül) somatik hücreler gibi yumurta odalarında ve germline hücreyi (hemşire hücreleri ve yumurta), birden çok türde GFP, ancak değil RFP (şekil 3J görüntülenen ) bu hücreler caspase harekete geçirmek sonra anastasis geçirmek için gösteren19,. İlginçtir, GFP da aynı ovariole zinciri onun ilişkili yumurta odasında birlikte kök hücre içeren germarium (şekil 3J)19hücrelerde etiketli. Bu nedenle, bu GFP pozitif yumurta odaları hücre ölüm işleminden caspase harekete geçirmek sonra iyileşti kök hücrelerden elde edilmiş. Önemlisi, aç ve yeniden beslenen dişi döl sinekler19GFP ifade etmek,-ebilmek üretmek yatıyordu verimli yumurta caspase harekete geçirmek Görünüşe göre normal işlevini yeniden elde edebilirsiniz sonra potansiyel olarak hücreleri hücre ölüm bu ters bir işlemdir olduğunu düşündüren uçar. Gelecekteki çalışmalar anastasis sonucu olarak hayatta döl sinekler kalıcı sekel sergiler belirlemek için ihtiyaç vardır.

Resim 1 . Kurtarma HeLa hücreleri hücre ölüm indüksiyon sonra.
(A)hücre ölümüne neden ve daha sonra hücre hücre ölüm uyarıcı çıkarıldıktan sonra kurtarmak için ölmek izin yaklaşım şematik diyagramı.
(B) hızlandırılmış canlı hücre DIC mikroskobu sağlıklı HeLa hücre (Ben), (II), 1µM staurosporine ile tedavi sonra hücrelerinin aynı grup ve sonra yıkanmış ve daha fazla taze kültür ( staurosporine kaldırmak için orta ile inkübe III-vi). Beyaz ok hücre bölünme gösterir.
(C) caspase Biyoalgılayıcı füzyon protein NES-DEVD-YFP-NLS şematik diyagramı ve hücre ölüm indüksiyon sırasında ve sonrasında anastasis YFP hücre altı yerelleştirme.
(D) hızlandırılmış canlı hücre confocal mikroskobu bir HeLa hücre sırasında pozlama % 3.7 etanol (II - III) ve sonra (ben), daha önce caspase Biyoalgılayıcı füzyon protein NES-DEVD-YFP-NLS ifade etanol kültür ortamından (IV - VIII) kaldırma. Burada gösterilen (yeşil Floresan, üst satır); caspase Biyoalgılayıcı sadece görüntüleri vardır birleştirilmiş Höchst lekeli çekirdeği (mavi floresan) ve mitokondri (kırmızı Floresans) görüntüleri (orta sıra), ve orta sıra Albümdeki daha fazla DIC görüntüleri (alt satır) ile birleştirilir. Üst satırdaki beyaz okları nükleer yerelleştirilmiş YFP gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemi.
(A) caspase duyarlı rtTA şematik diyagramı.
(B) memeli CaspaseTracker rtTA Biyoalgılayıcı sistemi şematik diyagramı.
(C) anastasis algılamaya CaspaseTracker rtTA Biyoalgılayıcı sistemini kullanarak akış çizelgesi. Kırmızı/Sarı üçgen (geçerli hücre ölüm uyarıcı) ve yeşil/mavi (yıkama uyarıcı kapalı) sembollerdir şekil 1Aolduğu gibi.
(D) hızlandırılmış canlı hücre confocal mikroskobu HeLa hücreleri memeli CaspaseTracker rtTA Biyoalgılayıcı (ben), daha önce ifade bir küme ve pozlama için 1µM staurosporine (II - III) ve çıkardıktan sonra sırasında staurosporine kültür ortamdan (IV - VII). DIC ve DsRed sinyalleri birleştirilmiş görüntüler. Oklar hücre 1 (sarı) belirtmek ve 2 (yeşil) hücre.
(E) hızlandırılmış canlı hücre confocal mikroskobu tedavi edilmezse Biyoalgılayıcı ifade HeLa hücre. DIC ve DsRed sinyalleri birleştirilmiş görüntüler. Beyaz okları sayesinde bunun bölünen hücreler gösterir.
Doksisiklin (1ug/mL) panelleri (D) ve (E)gösterilen deneyler boyunca orta mevcuttu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . Drosophila CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı sistemi. (İzni gelen Tang vd., bilimsel raporlar 2015, 9:9015 ile kabul 19 ).
(A) Drosophila CaspaseTracker Gal4 Biyoalgılayıcı sistem şematik diyagramı.
(B) şematik diyagramı caspase duyarlı (DQVD) ve caspase-duyarlı kontrol (DQVA) Gal4.
(C) Drosophila yumurtalık ve hücre ölüm-indüksiyon 1 bayat sinekler, normal durum 3 gün iyileşme ardından içinde için akış şeması. Darren Obbard tarafından sağlanan drosophila görüntü.
Bir kadın Biyoalgılayıcı sinek yumurtalık gelen yumurta chambers (D) temsilcisi confocal görüntüsünü 6 gün (tedavi edilmezse) normal sinek gıda ile beslenen.
(E) yumurta odalarının bir soğuk şok kadın Biyoalgılayıcı sinek yumurtalık üzerinden temsilcisi confocal Resim-7 ° c için 1 h yerleştirilir ve sonra normal kültür durumu 1 günde (soğuk şok, CS) için açık.
(F) panelinde E dışında soğuk şok sinekler gibi normal kültür durumu 3 gün (CS sonra kurtarılan) için açık.
(G) temsilcisi confocal görüntü odaları aç bir kadın Biyoalgılayıcı yumurtalık üzerinden uçmak yumurta %1 agar protein olmadan % 8 Sükroz ile 3 gündür (Aç) beslenen.
(H) panelinde G dışında tedavi sinekler gibi protein açlık muamele (yeniden beslenen) sonra 3 gün boyunca normal sinek yemek için açık.
(I) negatif kontrol hizmet hassas CaspaseTracker (DQVA) kadın Biyoalgılayıcı sinek caspaseaçlıktan gösterilen dışında G paneli gibi.
(J) aç ve yeniden beslenen kadın Drosophilagelen yumurta chambers temsilcisi confocal görüntüsü. Oklar nükleer GFP hemşire hücreleri (siyah), yumurta (beyaz) ve folikül hücreleri (sarı) yumurta odalarının ve germarium (yeşil) ifade gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 . Anastasis fizyolojik, patolojik ve tedavi edici etkileri. (İzni gelen Tang vd., F1000Res 2017, 6:43 ile kabul 21 ). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.