Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Özet

Bağırsak lenfositlerinin kantitatif karakterizasyonuna, bu hücrelerin çeşitli bağırsak ve sistemik hastalıklarda kritik bir rol oynadığının giderek daha fazla tanınması nedeniyle artan bir ilgi vardır. Bu protokolde, sonraki akış sitometrik karakterizasyonu için tek hücreli popülasyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini açıklıyoruz.

Özet

bağırsaklar - Vücutta herhangi bir organın bağışıklık hücrelerinin en fazla sayıda içerirler - sürekli yabancı antijenleri, mikrobik ve diyet hem de maruz kalmaktadır. bağırsak sistemik hastalıkların bir dizi için kritik olan bu lümen antijenler immün yanıtı ve bağışıklık hücrelerinin eğitimin şekillenmesine yardımcı olduğunu giderek artan bir anlayış göz önüne alındığında, bağırsak bağışıklık sistemini karakterize ilgi var artmıştır. Bununla birlikte, bir çok yayınlanmış protokoller zor, zaman alıcıdır. Biz, hızlı, tekrarlanabilir ve zahmetli Percoll geçişlerini gerektirmez ince bağırsak lamina propria, intraepitelyal tabaka ve Peyer yamaları lenfositlerin izolasyonu için burada basitleştirilmiş bir protokol mevcut. Protokol, ince bağırsakta üzerine odaklanmış olmakla beraber, bu da kolon analizi için de uygundur. Ayrıca, biz belirli bir bilimsel ques bağlı olarak ek optimizasyon gerekebilir bazı yönlerini vurgulamakyon. Bu yaklaşım daha sonra, akış sitometrik analizinde ve özellikleri alternatif yollarla kullanılabilir uygulanabilir lenfositler, çok sayıda ayrı olarak elde edilir.

Giriş

İnce bağırsağın temel görevi, genellikle besinlerin ¹ sindirim ve emilim olarak kabul edilir. Bu metabolik fonksiyon açıkça gerekli iken, ince bağırsak lümeninin ² içinde bulunan çevresel antijenlere sürekli baraj konağı korunmasında eşit derecede önemli bir role sahiptir. Bağırsak dış dünyayı ayıran (örn., Lümen antijenler) Sadece tek bir hücre tabakası kalınlığında bir epitel tabakası ile konağın iç ortamdan. Bu şekilde, ince bağırsak, bağışıklık sistemi, işgalci patojenlere karşı güçlü bir yanıtın monte ederken, minimal mukoza girmek için diyet ve ortakçı mikroplardan yabancı antijenleri sağlayan, herhangi bir halinde, bir bağışıklık tepkisi reaktivite için eşik dengeleme üstün görevi, öteki "zararlı" antijenler. Bu antijenlere karşı aşırı ya da uygunsuz immün yanıtlar (patolojik hastalığa yol açabilir, örneğin., Inflamasyonedici bağırsak hastalığı, tip I diyabet, çok merkezli skleroz) ve ^3-6 kaçınılmalıdır.

Genel olarak, mide-bağırsak yolu, tüm antikor salgılayan hücreler ^7% 70 üzerinde içeren, vücudun en büyük immün organı temsil ettiği düşünülmektedir. Lamina propriya (LP), intraepitelyal tabaka ve Peyer yamaları (PPS) - - ince bağırsak bağışıklık sistemi 3 ana bölmeden oluşur, her lenfosit ² ayırt edici bir grubu içerir. LP lenfositleri (LPLs) ~% 20 B hücreleri ile esas TCRαβ ⁺ T hücreleridir; intraepitelyal lenfositler (IELS) TCRαβ ⁺ T hücreleri daha TCRγδ ⁺ T hücreleri çok az sayıda B hücrelerini içeren; ve ince bağırsak duvarında gömülü ikincil lenfoid organlar PPs, ~% 80 B hücrelerini içerirler. Bu anatomik bölgelerin her biraz farklı fonksiyonları ve ontolojik üsleri olmasına rağmen, onlar işlev aharmonized moda patojenik hakaretlere gelen ev sahibi korumak için.

Ayrıca, Mikrobiyota özel mikroplar ve özellikle hücre soylarının ^8,9 ontogeny arasındaki soydaş ilişkinin tanıma artan bağırsak bağışıklık sisteminin gelişimi için kritik bir belirleyicisi olduğunu büyüyen takdir var. Ayrıca, bağırsak bağışıklık sisteminin eğitim anatomik uzak bölgelerde bağışıklık tepkilerini etkiler göz önüne alındığında (örneğin., Artrit, multipl skleroz, pnömoni), daha önce ¹⁰ tanıdı daha bağırsak bağışıklık sisteminin gelişmesi daha hastalık süreçleri ile ilgili olduğu açıkça ortaya çıktı ^-12. Bu nedenle, kantitatif bağırsak bağışıklık sistemini değerlendirirken ilgi şimdi konak-ortakçı etkileşimleri ve birçok sistemik hastalığın patogenezi de içerecek şekilde konak-patojen etkileşimleri aşmıştır.

mevcut yöntemlerin değişkenliği göz önüne alındığındabağırsak lenfosit izolasyonu gerekli zamanı dengeleme giderek kritik iken verimi, canlılığı ve tutarlılık için optimize edilmiş bir yöntem. Percoll geçişlerini içeren protokoller, zaman ve emek yoğun ve insan hatası potansiyel olarak daha yatkındır değişken verim giden ve ¹³ canlılığı. Burada, 3 ince bağırsak immün bölmelerden lenfositlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için optimize edilmiş bir protokol sağlar. Buna ek olarak, mukozal bağışıklık sistemi mikrop kaynaklı değişikler verilen artan bir ilgi, bu değişikliklerin kantitatif bağırsak bağışıklık sistemini nasıl etkilediği değerlendirmek için fareler arasında mikroorganizmaların yatay aktarım sağlamak için kullanılabilir adımları içerir.

Protokol

Tüm çalışmalar Laboratuar Hayvanları Bilimi için Amerikan Derneği (AALAS) tarafından belirlenen veteriner standartlarını karşılayan Harvard Tıp Okulu'nda Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre sıkı inceleme ve kuralları uyarınca yapılmıştır.

Co-konut yoluyla Bakterilerin 1. Yatay İletim (İsteğe bağlı)

1. yiyecek ve her ikisi de otoklavlanmış edilmiş su kullanarak, steril tek kullanımlık kafesleri montaj sırasında (gnotobiyotik fareler kullanılarak özellikle) eksojen kontaminasyonu en aza indirmek için, aseptik teknik uygulama.
2. Kullanım kulak yumruklar veya etiketleri tek tek farklı microbiotas liman ve aynı kafeste onlara ev 6 haftalık C57BL / 6 fareler işaretlemek için. fareler coprophagic ve kafes yerden fekal pelet yemek göz önüne alındığında, mikroplar doğal fareler arasında yatay iletilecektir.
3. ≥1 hafta Co-ev fareler analizden önce mikrobiyal transferi ve immünolojik değişim için zaman tanımak için.

Küçük bağırsak intraepitelyal Katman ve lamina propria bir Tek Hücre Süspansiyon 2. Hazırlık

1. Çözümler hazırlanması
   1. (Ince bağırsak başına) Ekstraksiyonu hazırlanması: 30 ml RPMI + 93 ul% 5 ditiyotreitol (DTT) (w / v) + 60 ul 0.5 M EDTA + 500 ul cenin sığır serumu (FBS). Kullanmadan önce hemen DTT ekleyin.
   2. 25 ml RPMI + 12.5 mg dispase + 37.5 mg kollajenaz II + 300 ul FBS: (ince bağırsağın başına) sindirim ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce hemen dispase ve kollajenaz ekleyin.
   3. 37 ° C, 37 ° C, ön ısıtılması çözeltiler gerçekleştirilen tüm inkubasyon için.
2. Servikal dislokasyon tarafından takip CO ₂ boğulma fare Euthanize.
3. aşağı fare dorsal yüzü koyun ve% 70 etanol ile karın püskürtün. sırayla fro ventral orta hat boyunca cilt ve sonra periton fasya keserek bir laparotomi gerçekleştirmek için makas kullanınböylece periton boşluğuna açığa kılıç şeklinde sürecine pubis eklemi m.
4. pilor sfinkter bölücü ile mideden ince bağırsağa ayırmak için makas kullanın. Yavaşça mezenterik yağ uzak alay, periton ince bağırsak kaldırın.
   1. Tamamen ince bağırsak kaldırmak için, ileo-çekal kavşakta ikinci bir kesim yapmak. Soğuk izole edilmiş ince bağırsağa yerleştirin (yani., 4 ° C),% 10 FBS içeren RPMI hücre canlılığı üst düzeye çıkarır.
5. Yavaşça kavisli bir forseps kullanarak yağ büyük parçalar çıkarın. yağ çıkarmak isterken bağırsak dokusu kendisini yırtılmasını önlemek için dikkatli kullanın.
6. bir şırınga yapıştırılmış bir 18 G besleme iğne kullanılarak soğuk PBS 20 ml - 15 ile bağırsak içeriği, hafifçe yıkayın bağırsakları kaldırmak için.
7. PPS tüketim için makas kullanın ve% 5 FBS içeren soğuk RPMI içine koyun. PPs ince bağırsak antimezenterik tarafında bulunur ve bir çok-lobüle beyaz görünürkitle. 12 PPS - Belirli zorlanma bağlı olarak, bir fare, genellikle 8 sahiptir.
8. 4 inçlik segmentlerine - 3 içine ince bağırsak kesti.
9. uzak dokudan yağ kızdırmak için sıkıcı bir neşter kullanılarak, RPMI ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerine her ince bağırsak segmenti yuvarlayarak kalan yağ çıkarmak.
10. kavisli bir forseps ile bağırsak segmentleri kanüle ve doku distal ucunu tutarak dışarı içinde doku çevirin. Sonra yavaşça doku ters olan sonuçlanan (proksimal ucunda başlar) kavisli bir forseps doku segmenti çıkarmak için düz forseps bir çift kullanın.
11. 30 emme ml ortam ve bir karıştırma çubuğu ihtiva eden bir kap içinde, doku bölümleri yerleştirin. fincan kapağı elde edin ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca 500 rpm'de karıştırıldı; karıştırma dinç ama çalkantılı olmamalıdır.
12. kuluçkadan sonra bulutlu görünmelidir epitel içeren süpernatant, doku parçaları ayırmak için çelik süzgeç kullanın. Bu yüzer madde i içerir2.23 - adımda 2.18 numune süzme işlem yolu ile, arzu edildiği takdirde daha da analiz edilebilir ntraepithelial lenfositler.
13. El ile artık çıkarma medya yıkayacak RPMI doku parçaları çalkalayın.
14. kuru bir kağıt havlu üzerine doku yerleştirin ve ekstraksiyon ortamı tarafından serbest değildi bakiye mukus çıkarılmasını kolaylaştırmak için son birkaç kez sona çevirin.
15. Sindirim ortamının 600 ul, 1.5 ml bir tüp içinde doku parçaları yerleştirin.
16. parçalar artık makas sopa ve çözüm homojen görünene kadar doku kıyma için makas kullanın. Bu adım, doku tam enzimatik sindirim sağlamak için çok önemlidir.
17. sindirim medya 25 ml içeren bir bardağa kıyılmış ince bağırsak ekleyin. 37 ° C'de 30 dakika boyunca 500 rpm'de karıştırılır. Yarım sindirim yoluyla (yani., 15 dk), pipetlemeyin yukarı ve serolojik pipet ile aşağı dokusunun herhangi büyük boyutta break up yardımcı olur.
18. Filtre Sindirilmiş doku (veya epithadım 2.12 Elial tabaka halinde 50 ml'lik bir tüp içine 100 mikron hücre süzgecinden işleme IELS). % 10 FBS ihtiva eden RPMI 20 ml süzgeç durulayın.
19. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de filtre solüsyonu santrifüjleyin.
20. Dikkatle% 10 FBS ihtiva eden RPMI 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet süzün.
21. Filtre 50 ml'lik bir tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden hücreler yeniden süspansiyon haline getirildi. % 10 FBS ihtiva eden RPMI 20 ml süzgeç durulayın.
22. Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 500 xg'de çözelti filtre edilmiştir.
23. Dikkatle% 2 FBS içeren RPMI 1 ml süpernatan, ve tekrar süspansiyon pelet süzün.

Peyer yamaları tek bir hücre süspansiyonu 3. hazırlanması

1. Transferi 25 sindirim medya ml ve bir karıştırma çubuğu ile bir fincan PPS eksize. Güvenli kapağı ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca 500 rpm'de döndürün.
2. Filtre 50 ml'lik bir tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden PPS sindirilmiş. herhangi bir yığınının Rema Eğeriçinde, bir 1 ml şırınga pistonu düz ucunu kullanarak süzgeç aracılığıyla basın.
3. % 10 FBS ihtiva eden RPMI 10 ml süzgeç durulayın.
4. Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 500 xg'de çözelti filtre edilmiştir.
5. Dikkatle% 2 FBS içeren RPMI 1 ml süpernatan, ve tekrar süspansiyon pelet süzün.

Akım Sitometrisi 4. Yüzey Boyama

1. Hücre kısım uygun hacmi (örneğin., LPLs 200 ul) 96-çukurlu yuvarlak tabanlı plaka.
2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün.
3. RPMI% 2 FBS içeren 90 ul içinde süspanse hücreleri ve bir 1: anti-CD16 / 32 (Fc Block) 100 dilüsyon. 4 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
4. 10 ul PBS ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün.
5. 250 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. tarafından decant süpernatantplakayı tersini.
6. üreticinin protokolünü takip ederek, eğer istenirse canlılığı boya ile (isteğe bağlı) boyama hücreleri.
7. 100 ul% 1 formalin içinde süspanse hücreler düzeltmek için. 4 ° C'de karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin.
8. 200 ul PBS ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün.
9. 250 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün.
10. 200 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. bir akış sitometresinin kullanarak hücrelerin analiz edin.

Sonuçlar

Splenositler (Şekil 1A ve 1B) halinde ileri içindeki ve yan saçılma özelliklere sahip farklı bir hücreler popülasyonu elde gereken ince bağırsak lenfositlerin tekli hücre süspansiyonları, akış sitometrik analizi. Doku izolasyon ilk aşamalarında, 4 ° C de muhafaza değilse lenfositleri daha düşük bir ileri dağılım olan ve diğer epitel ve ölü hücrelerden ayırmak için daha zor olan lenfosit popülasyonu ile sonuçlanan, kalıp başlayabilir (Şekil 1C) . Ince bağ...

Tartışma

Biz izolasyonu için bir protokol mevcut ve PPS'de LPLs, IELS ve lenfositler de dahil olmak üzere ince bağırsak lenfosit, sitometrik karakterizasyonu akar. Mikrobiyota değişiklikler ince bağırsak bağışıklık sistemini nasıl etkilediğini değerlendirmek ilgilenenler için, detay farklı microbiotas barındıran fareler arasında organizmaların yatay iletim dahil basit adımlar. Bu protokol, ince bağırsakta odaklanır rağmen, prosedür tek fark hiçbir PPs kaldırmak için vardır (kolon yamalar mevcut olmasına rağmen, bunlar fena h...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Steril Eldivenler	Kimberly-Clark	555092
steril fare kafesi	Innovive	MS2-AD	kapak, kafes tabanı ve alpha-dri yatak takımı içerir
Metal besleyici	Yenilikçi	M-FEED
Su şişesi	Yenilikçi	M-WB-300
Kart sahibi	Yenilikçi	CRD-HLD-H
Otoklavlanabilir kemirgen chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI ortamı 1640	Gibco	11875-119
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Ambion	AM9262
Fetal Sığır Serumu (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	Protokoldeki konsantrasyon, 1.878 U / mg
Kollajenaz, tip II	Invitrogen	17101-015	protokolündeki konsantrasyon, 245 U/mg aktivite seviyesine dayanmaktadır
Diseksiyon makası	Roboz	RS-5882
Besleme iğnesi (18 G, 2" uzunluk)	Roboz	FN-7905
10 ml Şırınga	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Tek Kullanımlık Neşter (15 bıçak)	Miltex	4-415
Kavisli forseps	Roboz	RS-5211
Düz forseps	Roboz	RS-5132
Çok amaçlı kaplar, 120 ml	VWR	89009-662
Karıştırma çubuğu	VWR	58949-062
Çok konumlu karıştırma plakası, 9 konumlu	VWR	12621-048
Paslanmaz çelik konik süzgeç, 3 inç	LCV
1.5 ml Tüp	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m Hücre süzgeci	Falcon	08-771-19
40 μ m Hücre süzgeci	Falcon	08-771-1
50 ml Konik tüp	Falcon	352098
1 ml Şırınga	BD	309659
96 oyuklu Plaka, yuvarlak tabanlı	Corning	3799
Anti-fare CD16/32 (Fc bloğu)	Biolegend	101320
(İsteğe bağlı) Sabitlenebilir canlılık boyası eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
%10 Formalin, nötr tamponlu	Thermo Scientific	5725