Isı Önlenmesi ile Sıçanlarda Olumsuz Etkileri Stres Bacillus subtilis Gerilme

Farklı stres faktörleri insan ve hayvan sağlığını etkiler. Sıcaklık, kronik, akut ve hatta ölümcül hastalıklara neden olan en stresli faktörlerden biridir¹. Bağırsak morfolojisindeki değişiklikler ve ısı stresinden sonra bağırsak bariyeri bütünlüğünün kaybı birçok durumda belgelenmiştir^2,3. Bu koruyucu bariyer, bağırsak bakterilerinin ve toksinlerinin, özellikle lipopolisakkaritlerin (LPS) lümenden iç dolaşıma^4,5 translokasyonuna karşı savunmadan sorumludur. Bağırsak mikrobiyotasının stabilitesi, bağırsak bariyer fonksiyonunu, konağın bağışıklık tepkisini ve stres koşullarına toleransı önemli ölçüde etkiler⁶. Bu nedenle, bağırsak mikrobiyotasının modülasyonu, strese bağlı olumsuz etkilerin önlenmesi için yeni bir yaklaşım sağlayabilir.

Yararlı bakteriler, ishal, inflamatuar bağırsak hastalığı, atopik dermatit, metabolik bozukluklar gibi çeşitli klinik durumların başarılı yönetimi için bağırsak mikrobiyotasını değiştirmek için umut verici bir strateji olarak kullanılmıştır^7-10. Yararlı bakterilerin probiyotik etkileri, bağırsak sağlığını desteklemek için temel metabolitlerin üretimini, bağışıklık sisteminin uyarılmasını, laktoz toleransının teşvik edilmesini, epitel disfonksiyonunun restorasyonunu içerir. Probiyotikler in vitro ve hayvan modellerinde strese bağlı komplikasyonların önlenmesinde etkili olmuştur^11,12.

Araştırmacılar, Bacillus bakterilerine probiyotik olarak daha fazla dikkat ettiler çünkü bu bakteriler bağırsak homeostazını^{destekliyor 13} ve konakçı¹⁴ üzerinde faydalı etkileri var. Önceki verilerimiz, Bacillus probiyotiklerinin in vitro^15,16 ve klinik çalışmalarda^17,18 patojenlere karşı yüksek etkinliğini göstermiştir. Bu çalışmada, B. subtilis BSB3 suşunun ısı stresi sonrası komplikasyonlara karşı önleyici etkisini değerlendirmeyi amaçladık.

Tüm deney prosedürleri Auburn Üniversitesi IACUC, Auburn, Alabama tarafından kabul edildi.

Kültür Medya, Yemekleri ve Bakteriyel Kültür 1. Hazırlık

1. Bir besleyici agar plakası üzerinde bir gece büyütüldü Bacillus subtilis BSB3 kültürünün tek bir koloni ile bir şişe içinde besleyici sıvı 10 ml inoküle.
2. Litre başına sporlaşma ortamının ¹⁹ (500 ml yapmak: Bacto besleyici Broth, 8 g,% 10 (ağ / hac) KCI, 10 mi,% 1.2 (h) ₄ x 7H _2, O, 10 mi MgSO / a; ağar, 15 g) ve 20 dakika boyunca 121 ^o C'de otoklav. Aşağıdaki steril çözümleri 50 ^o C soğumasına ve eklemek için izin: 1 M Ca (NO _{3) 2,} 1 ml; 0.01 M _MnCl2, 1 mi; 1 ila _{4 mm,} 1 ml FeSO.
3. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 40 ^° C'nin soğutun hazırlanan orta ve steril bir kabine 20 steril Petri kapları her birine 25 ml dökün. orta gecede katılaşmaya edelim.
4. B gecelik kültürün 0.5 ml yayıldıacillus subtilis BSB3 Petri kutularına ortamın yüzeyi üzerine. % 90 Sporulationun kadar 5 gün boyunca 37 ^o C'de kültür inkübe. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile faz-parlak sporlar ortaya koymaktadır.
5. levhaya steril fosfat tamponlu salin (PBS) 1 ml ekleme ve steril bir hücre dağıtıcı ile bir yüzeyden bakteriler, kazınarak Hasat bakteri. ihtiyaç kadar buzdolabında süspansiyon saklayın.
6. 37 ^o C'de 24 saat - 18 kuluçkalandı sporlaşma ortamının plakaları üzerinde bakteri süspansiyonu uygun seyreltme (10 ^{-5 -6} ila 10), 0.1 ml kaplama bakterilerin canlılığı teyit
7. Bir koloni sayacı kullanılarak plakalar üzerinde bakteri kolonileri sayın ve test süspansiyon bakteri titresi hesaplamak. Nihai konsantrasyon 1 x 10 ⁸ CFU / ml'lik son yoğunluğa seyreltildi bakteriyel süspansiyon hazırlayın.

2. Hayvanlar

1. 300 gr - 32 erkek Sprague-Dawley sıçanları (250 kullanın). standart pelet yemi ve su ücretsiz erişim ile spesifik patojen free şartlarda hayvanları korumak. Ortalama sıcaklığı (21 ± 1 ^° C), nem (% 50 ± 5) ve 12 saat ışık-karanlık döngüsü kurmak.

3. Deney Tasarımı

1. Iklimlendirme 2 gün sonra, oral gavaj ¹¹ hayvanların tedavisini başlatın. ağızdan sonda iğne ile şırınga kullanın. B. ile 16 sıçan tedavi subtilis BSB3 süspansiyonu (sıçan başına 1 mi), iki gün boyunca günde iki kez (B. subtilis grubu). PBS ile 16 sıçan (sıçan başına 1 mi), iki gün (PBS grubu) (Şekil 1) için günde iki kez tedavi edin.
2. Grup 1- kontrolü (PBS / hiçbir stres), Grup 2- B: Tedaviden sonra, her gruba (grup başına 8 sıçan) subdivide subtilis (B. subtilis / hiçbir stres), Grup 3- stres (PBS / ısı stresi) ve Grup 4- B. subtilis + stres (B. subtilis / ısı stresi).
3. Bir elec kullanarak her sıçanın rektal sıcaklığını ölçmekdijital termometre tronic. 25 dakika için oda sıcaklığında Grup 1 ve 2'nin sıçanları tutun. 45 ^o C'de iklim odasına gruplar 3 ve 4 ve bağıl nem 25 dakika boyunca% 55 yer hayvanları.
4. Daha sonra, bir elektronik dijital bir termometre kullanılarak tüm gruplarda, her sıçanın rektum sıcaklığının ölçülmesi. 4 saat oda sıcaklığında tüm hayvanlar koyun.
5. Bir yapışmalı anestezi kavanoza - (% 4 2) ve sıçanlar derinden (ayak tutam yanıt yokluğu) anestezi kadar dikkat izofluran ile sıçan anestezisi. Bir Giyotin ile hızlı dekapitasyon sıçan Euthanize.
6. Serum elde ve hemen mikroskobik inceleme için bir pipet ile kan örnekleri (her sıçan 7 ul) almak için apirojen tüpler içine apirojen pipetler ile - (16 ml 15) her sıçan ²⁰ gövde kan toplayın.
7. pıhtılaşmayı izin vermek için en az 30 dakika boyunca bir soğutucuda kan Tüpleri koyun. 20 ^o C santrifüj tüpleri, 7000 xg 10 dakika ve hızlı bir şekildeBir pipet ile serum kaldırın. Tahlil kadar -20 ^o C'de her 50 ul birimlere sıçan ve mağazadan alınan Kısım serumu.

4. Cerrahi Prosedür

1. Kes / elektrikli makas ile karkasın alt karın ve göğüs tüm kürk Döşeme. steril bir kabine karkas yerleştirin ve% 70 alkol ile karkas traş yüzeyi davranın.
2. karın ortasındaki bir yarık oluşturmak için Steril bir bisturi bıçağını kullanarak. Steril cımbız kullanarak her sıçandan karaciğer, mezenterik lenf düğümleri, dalak ve ince bağırsak çıkarın.

Bakteriyel Translokasyon 5. Analiz

1. önceden tartılmış steril tüplere karaciğer, mezenterik lenf düğümleri ve dalak her bir örnek yerleştirilir ve tartılır. Bir numune ile bir boru ve ağırlıkça boş borunun ağırlığı arasındaki fark olarak numunenin ağırlığı hesaplanır.
2. 1:10 seyreltme elde etmek üzere tüpe steril PBS ekleyin (ağırlık / hacim) numune ve homojen birHomojen bir süspansiyon elde etmek için ²¹ steril bir cam doku homojenleştirici ile her bir örnek çer-.
3. Steril PBS Her numunenin seri dilüsyonları (10 ^{-1 -4} 10) konur. Plaka hemin (0.005 g / L) ve Vitamin K1 (0.01 gr / lt) plakalı MacConkey en yüzeyi ve% 5, kan agar ve Brucella, kan agar üzerine her bir doku tüm seyreltileri, 0.1 mi.
4. 37 ^o C ^22, MacConkey en ve% 5 kanlı agar plakaları aerobik ve Brucella kan agar plakaları anaerobik koşullarda inkübe edin.
5. 24 saat sonra aerobik bakteri kolonileri sayın ve inkübasyon 48 saat, bir koloni sayacı kullandıktan sonra anaerobik bakteri kolonileri. bir doku gramı koloni oluşturan birim (CFU) sayısı sonuçlarını ifade eder.

6. Histolojik analiz

1. Cerrahi işlem her sıçan ince bağırsak örnekleri çıkarın (- 4.2 4.1 adımlar). , Parafin gömmek Bouin Sabitleme örnekleri, Fixhematoksilen ve eozin standart prosedürler ²³ kullanılarak 6 mikron bölümleri ve leke kesitler hazırlamak.
2. Her bir örnek (büyütme 100X) ²⁴ intestinal villus ve toplam mukozal kalınlığı yüksekliğini ölçmek için yüksek çözünürlüklü mikroskop sistemi kullanın. Her bir sıçandan 4 örnekleri analiz eder ve her bir örnek, en az yirmi ölçümler yapmak. mikrometre sonuçları ifade edin.

7. Sitokin Deneyi

1. IL-1 p ticari sıçan ELISA kitleri kullanın; IL-6; TNF-α, γ INF-, ve IL-10, üreticinin protokolüne uygun olarak, serum sitokin düzeylerinin ölçülmesi için.
2. İlgili kiti için standartlar kullanılarak test numunelerin her set için standart eğrileri oluşturmak. uygun standart eğri ile deneysel verilerle karşılaştırılması ile her numunedeki sitokinlerin düzeyini tanımlayın.

8. Lipopolisakkarit Deneyi

1. uygun bir sıçan LPS ELISA kiti kullanılarak serumda LPS seviyesini analizÜreticinin protokolü. Standart eğri değerleri ile elde edilen değerlerin karşılaştırılması ile örnekleri LPS konsantrasyonunun tahmin edilmesi.

Kan 9. Yüksek Çözünürlüklü Işık Mikroskopi

1. Daha önce ^25,26 açıklanan mikroskop sistemi kullanın. Canlı görüntüleri kaydetmek için bir mikroskop sistemi için taban ve video kamera ve bilgisayar ²⁵ gibi titreşim izolasyonu platformu kullanın. Daha önce ²⁷ açıklandığı gibi bir Richardson slayt kullanarak test görüntüleri kalibre edin.
2. Bir cam slayt, lamel, fotoğrafta Her bir sıçanın taze çekilmiş kan 7 ul yerleştirin ve her bir örnek (büyütme 1,700X) 72 × 53,3 mm ² on resim çerçeveleri kaydedin.
3. gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü direkt görüş optik görüntü sağlar yazılımı kullanarak veziküllerin konsantrasyonunu ölçün. Her deneysel koşul ²⁸ 20 görüntü kareleri minimum inceleyin.

10. İstatistikitikler

1. ortalama ve standart sapma gibi tüm değerleri ifade eder. istatistiksel analiz ve grafik komplo gerçekleştirin. , Iki örnek t-testi ile analiz sonuçları istatistiksel anlamlılık tanımlamak için 0.05 anlamlılık düzeyini ayarlamak.

Isı stresi önce ve hemen sonrasında hayvanların ortalama vücut ısısı sırasıyla 36.7 ± 0.07 o C ve 40.3 ± 0.17 o C, (p <0.05). Isı (Grup 3), maruziyeti villi yüksekliği önemli ölçüde inhibe toplam mukozal kalınlığı ile sonuçlanmıştır (Şekil 2, 3). ısı zararlı etkisinden stres korumalı bağırsak önce BSB3 suşu Oral uygulama.

bağırsaktan bakteri translokasyonu bakteriyolojik mezenterik lenf düğümlerinin analizi (MLN), karaciğer ve her bir sıçanın dalak ile belirlenmiştir. 1.7 x 10 3 ± 4.6 x 10 2 CFU / g doku (Şekil 4) arasında bir konsantrasyonda bakteri kültürleri MLN sadece izole edildi ve karaciğerdeki (Grup 3), PBS ile önceden muamele edilmiş ve ısıya maruz bırakılmıştır. kontrol farelerinde bütün test edilen numuneler (grup 1, 2) ve ısı stresi hayvanlardanBir BSB3 suşu (grup 4) steril edildi aldı. Resim bakteri dalak örneklerinden izole edilmiştir.

IL-1 p değişiklik yok; IL-6, TNF-α, INF-Γ sitokinlerin düzeyleri, ısı stresi sıçanlarda kaydedildi. IL-10 ve LPS seviyelerinin ısı ile teması büyük yüksekliği önce PBS ile tedavi edilmiş hayvanların serumunda bulunan (grup 3) - (Şekiller 5, 6). B. ön-muamele subtilis BSB3 (grup 4), ısı-stresli hayvanlarda serum IL-10 ve LPS'nin neden engelledi.

(1.4 ± 0.2) ücretsiz veziküller konsantrasyonunun önemli bir artış (3.8 ± 0.3) 10 6 ul -1 10 6 veziküller × × (p <0.001), ısı stresi önce PBS alınan sıçanların kan bulundu (Şekil 7 , 8). BSB3 ile önceden tedavi edilen bir hayvan grubunda serbest veziküllerin sayısında herhangi bir değişiklik kıç bulunmuşturer ısı maruziyeti (Şekil 7).

Şekil 1. Çalışma Dizaynı. Faresi, iki grup (her bir grup 16 fare) B ile oral besleme yoluyla tedavi edildi günde iki kez subtilis BSB3 (B. subtilis grubu) ya da PBS ile (PBS grubu). 3. günde, her bir grup, her grupta 8 sıçan tarafından bölünmüştür. Grup 3 ve 4 ile sıçanlar 25 dakika süreyle 45 ° C de yerleştirildi. Kontrol hayvanları (grup 1 ve 2) oda sıcaklığında tutuldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Bağırsak Villi Yükseklik (A) ve Sıçanlarda Mukoza Kalınlığı (B) ölçümü. Sıçanlar PBS veya tedavi edilen önB. subtilis BSB3 45 ° C (gerilme) ya da oda sıcaklığında (Kontrol) maruz bırakıldı. Her bir grup 8 fareden oluşmuştur. Her bir numunedeki her bir parametre yirmi ölçümleri alınmıştır. Değerler ortalama ve standart sapma olarak sunulmuştur. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı tanımlamak için anlamlılık düzeyinde 0,05 iki örnek t-testi ile analiz edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Hematoksilin ve eosin. Sıçanlarda sahip bağırsak mukozası Lekeli Şekil 3. histolojik Çıkan PBS veya B ile önceden tedavi edilen subtilis BSB3 ve 45 ° C (Stres) ya da oda sıcaklığında (Kontrol) maruz A. PBS / hayır stres;. B. PBS / ısı stresi C. B. subtilis / hiçbir stres; D. B. subtilis / ısı stresi. Villi yüksekliği oklarla gösterilir. 200 mikron Bar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Sıçanların Dokuların Bakterilerin Şekil 4. Sayısı. Sıçanlar PBS veya B ile ön işlemden subtilis BSB3 45 ° C (gerilme) ya da oda sıcaklığında (Kontrol) maruz bırakıldı. Her bir grup 8 fareden oluşmuştur. Mezenterik lenf düğümleri, karaciğer, dalak aseptik her bir sıçan, homojenize çıkarılır ve aerobik ve anaerobik bakterileri agar ortamı üzerine kaplanmıştır. transloke bakteriler (aerobik ve anaerobik) toplam sayısı doku gramı başına koloni oluşturan birim (CFU) halinde sunulmuştur. Değerler olarak sunulmuştur ortalama ve standart sapma. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Sıçanların Serum IL-10, Şekil 5. Seviye. Sıçanlar PBS veya B ile tedavi edilen ön subtilis BSB3 45 ° C (gerilme) ya da oda sıcaklığında (Kontrol) maruz bırakıldı. Her bir grup 8 fareden oluşmuştur. Kan serumu Her bir sıçandan elde edilen ve ticari bir fare ELISA kiti ile incelenmiştir. Değerler ortalama ve standart sapma olarak sunulmuştur. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı tanımlamak için anlamlılık düzeyinde 0,05 iki örnek t-testi ile analiz edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Sıçanların Kan vezikülleri Şekil 7. sayısı. Sıçanlar-tedavi öncesiPBS veya B ile subtilis BSB3 45 ° C (gerilme) ya da oda sıcaklığında (Kontrol) maruz bırakıldı. taze alınmış bir kan küçük damlacık (7 ul), her bir örnek (büyütme 1,700X) on resim çerçeveleri, bir cam lam üzerine konuldu kaplandı, fotoğrafı ve kaydedilmiştir. veziküllerin konsantrasyonu gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü direkt görüş optik görüntü sağlar yazılımı kullanılarak ölçüldü. Yirmi görüntü kareleri her deneysel koşul için incelendi. Değerler ortalama ve standart sapma olarak sunulmuştur. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı tanımlamak için anlamlılık düzeyinde 0,05 iki örnek t-testi ile analiz edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ve Şekil 8. ArtışIsı stres sonrası Kan sicles Konsantrasyon. oda sıcaklığında (A) ya da 45 ° C (B) maruz bırakılmadan önce, PBS ile muamele edilmiş farelerin kan Video görüntüsü. taze alınmış bir kan küçük damlacık (7 ul), her bir örnek (büyütme 1,700X) on resim çerçeveleri, bir cam lam üzerine konuldu kaplandı, fotoğrafı ve kaydedilmiştir. Vezikül V. Bar 6 mikron olarak belirtilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.