Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hayatta kalma Süre deneyinde

7.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54126

⸱

22 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

Bu makalede

Özet

Rotiferler, ekotoksikolojik ve yaşlanma çalışmalarında model olarak kullanılan mikroskobik zooplanktonlardır. Burada, Brachionus rotiferlerinde hayatta kalma süresinin güçlü ve tekrarlanabilir ölçümü için bir protokol sunuyoruz. Kültür koşullarının birkaç nesil boyunca senkronizasyonu özellikle önemlidir, çünkü anne durumu yavruların yaşam öyküsünü etkiler.

Özet

Rotiferler, kısa ömür, kültür kolaylığı ve klonal kültürü mümkün kılan partenogenez gibi çeşitli avantajları nedeniyle ekotoksikolojik ve yaşlanma çalışmalarında model olarak kullanılan mikroskobik kozmopolit zooplanktonlardır. Bununla birlikte, anne yaşı ve anne beslenme koşullarından etkilendiği için hayatta kalma sürelerini ölçerken dikkatli olunmalıdır. Burada, birkaç nesil boyunca kültür koşullarının dikkatli bir şekilde senkronize edilmesini takiben Brachionus rotiferlerinde hayatta kalma süresinin güçlü ve tekrarlanabilir ölçümü için bir protokol sunuyoruz. Ampirik olarak, zayıf senkronizasyon erken mortalite ve sağkalım oranında kademeli bir azalma ile sonuçlanır, böylece zayıf istatistiksel güç ile sonuçlanır. Gerçekten de, bu tür koşullar altında, kalori kısıtlaması (CR), geçmiş ve mevcut çalışmalarda iyi senkronize rotifer numuneleri ile CR'nin neden olduğu uzun ömürlülük gösterilmiş olmasına rağmen, B. plicatilis'in ömrünü önemli ölçüde uzatamadı. Bu protokol muhtemelen meyve sineği Drosophila melanogaster ve nematod Caenorhabditis elegans dahil olmak üzere diğer omurgasız modelleri için yararlıdır, çünkü bu türlerde anne yaşı etkileri de bildirilmiştir.

Giriş

Rotiferler filumunu Rotifera 1 oluşturduğu mikroskopik kozmopolit zooplankton (<1 mm) 'dir. Bu yaklaşık 1000 somatik hücreler gibi karakteristik bir tekerlek gibi siliyer cihazından oluşan basit bir vücut düzeni hareket kabiliyeti ve besleme için kullanılan korona, adı vardır. Çoğu rotifer yaklaşık 1.600 ve 500 tür, sırasıyla 2 ihtiva sınıflar Monogononta veya bdelloidea aittir. Bdelloid rotifer zorunlu parthenogenesis 3 ile yeniden oluşturma sırasında Monogonont rotiferler genellikle hem eşeyli ve eşeysiz üreme evreleri (döngüsel parthenogenesis) var. Deneylerde, yüksek tekrarlanabilirliği sağlanır genetik olarak özdeş rotifer bireyler elde etmek mümkündür. Buna ek olarak, bu kadar kısa bir ömrü, kültür kolaylığı, genomik ve transkriptomik dizi verilerine 4-7 kullanılabilirliği ve uzak benzersiz bir filogenetik pozisyon gibi model organizmalar gibi birçok başka avantajları varrthropods ve nematodların 8. Rotifer Bu nedenle ekolojik, toksikolojik omurgasız modelleri vaat ve çalışmalar 9-12 yaşlanma vardır.

Çevresel strese ya da kimyasallara maruz altında hayatta kalma süresi bu araştırma alanlarında 13-19 bir çok ölçülen parametredir. Bu annelerinin çevre koşullarına maruz olduğu rotiferler hayatta kalma süresini ölçme, ancak, dikkatli gereklidir. Yani, monogonont rotiferi Brachionus manjavacas olarak, yaşlı annelerden gelen kadın yavrular genç annelerden daha kısa bir ömrü var; Ancak, anne kalori kısıtlaması (CR) kısmen ileri anne yaşı 20 zararlı etkilerini dengeler. B. plicatilis, anne CR yavru uzun ömürlü, açlık altında uzun yaşam süresi ve antioksidan enzimler 21,22 gelişmiş ifadesi ile ilişkili yüksek oksidatif stres direnci sağlar. anne yaşı etkisiAyrıca bdelloid rotiferler 23 gözlenmiştir. Bu nedenle, deneysel rotifer koşulları dikkatlice sağkalım süresi ölçümleri önce birkaç nesil boyunca senkronize edilmelidir.

Burada birkaç nesil boyunca kültür koşulları senkronizasyon aşağıdaki Brachionus rotifer sağkalım süresinin ölçümü için bir protokol sağlar. Aralıklı açlık (IF), rotiferler periyodik beslenir CR bir varyasyon nedeniyle uzun ömürlü 22,24 tarihinde IF tanınmış etkilerine senkronizasyon etkisini ortaya çıkarmak için uygulanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Medya 1. Hazırlık

Not: kullan tuzluluk 16.5 ppt (PSU) yarı seyreltilmiş Brujewicz yapay deniz suyu. Diğer yapay deniz suyu, aynı zamanda sık sık kültür Brachionus rotiferler 25,26 için kullanılır.

  1. 454 mM NaCI, ekleme 26 mM MgCI2, 27 mM MgSO 4, 10 mM KCI, damıtılmış su, 10 mM CaCl2 4.5 L (nihai hacim 5 L) olacaktır. Alternatif olarak, deiyonize seyreltme suyu yerine distile su kullanın. Diğer tüm tuzlan çözüldükten sonra CaCl2 ekleyin.
  2. 0.48 M NaHCO 3 stok çözelti (200x konsantrasyon) hazırlayın. Yukarıdaki çözeltiye bunun 25 ml ekleyin. NaHCO 3 nihai konsantrasyon 2.4 mM'dir.
  3. 0.4 M NaBr stok solüsyonu (500x konsantrasyon) hazırlayın. Yukarıdaki çözüm için 10 ml ekleyin. NaBr nihai konsantrasyonu 0.8 mM'dir. damıtılmış su ile 5 litreye tamamlanır sağlayın.
  4. 0.45 um membran filtre ile çözelti filtre.Kullanımdan önce, steril su ile iki kez seyreltilmiş (h / h).
    Not: Bir stok çözeltisi olarak Brujewicz yapay deniz suyu 2x konsantrasyonunu yapmak mümkündür.

2. Genel Kültür Koşullar

  1. Kültür laboratuar yükseltilmiş veya 20 ile 30 ° C arasında bir steril 100 ml çanak içinde yabani ele Rotiferler. Yüksek sıcaklıklar daha kısa ömürleri ve hızlandırılmış üreme sonuçlanır. Deneylerin kolaylık sağlamak için, 25 ° C ile. Rotifer yoğunluğu veya yapay deniz suyu hacmi burada büyük bir sorun değil.
  2. Yapay deniz suyu 11 Kültür diyet mikroalg türleri. Snell ve ark bakın. (2014) Detaylar 11. Tipik haliyle, Tetraselmis tetrathele kullanımı (~ 2 x 10 5 hücre / ml 27,28), T. Suecica (~ 6 x 10 5 hücre / ml 25,29), ve Nannochloropsis oculata türü (~ 7 x 10 6 hücre / ml 30,31). diyet yosun beri (türler, kültür conditiyonları, biyokimyasal kompozisyonlar) önemli ölçüde tüm deney gruplarında mikroalgi aynı çok kullanırım, Brachionus rotifer yaşam süresini etkiler.
  3. Beslenme ve (örneğin, 2 günde beslemek ve her hafta aşılamak) bazen medyayı değiştirerek bir toplu kültüründe rotifer bir stok nüfusu tutun. rotifer optimal koşullar olduğunda birçok yeni doğanlar ve 2-3 yumurta taşıyan yetişkinler görülebilir.
    Not: Deneysel rotifer elde etmek için alternatif bir yol dinlenme yumurta yumurtadan etmektir. Dinlenme yumurtalardan Rotiferler iyi senkronize olarak kabul ve onların ömrü amictic yumurta 11 yumurtadan rotifer önemli ölçüde farklı değildir vardır. Ancak, dinlenme yumurtadan rotiferler önce amictic yumurta daha üreme başlar. Böylece, dikkatli üreme özelliklerinin ölçümleri için gereklidir.

Ön kültür ile Rotiferler 3. Senkronizasyon

  1. st tek bir rotifer seçinock nüfusu ve kültürü deneyleri için kullanılacak bir alt popülasyonu kurmak için 2.1-2.3 tarif edilmiştir. iki hafta içinde tipik olarak kültür.
  2. alt nüfustan yumurta taşıyan rotifer toplayın (deney için kullanılacak bireylerin çift sayıda toplamak). Tek bir grup olarak kültür bunları (yoğunluk: ~ 50 birey / ml) ad libitum besleme altında taze ortam içinde 2.1-2.3 tarif edildiği gibi bir 6-yuvalı kültür plakasına. Koşullandırılmış ortam Brachionus rotifer 32,33 üreme fizyolojisini etkiler çünkü nüfus yoğunluğu kontrol eden önemlidir.
  3. Yeni hazırlanan kültür ortamına yetişkinlerin ilk yumurtalardan yenidoğanlar aktarın. 2-3 nesil boyunca bu işlemi tekrarlayın.
  4. Hayatta kalma süresini ölçmek için belirli bir süre (örneğin, <3 saat) içinde yumurtadan yenidoğanlar kullanın. , Inde birkaç kullanarak tekrarlanabilirlik kontrol çok imkansız olmasına rağmen, tek bir birey seçiminde olası bir önyargı önlemek içinsarkık alt popülasyonları.
    Not: rotifer genellikle bu koşul altında sadece eşeysiz üreme olarak, hiçbir erkek deney boyunca mevcut olduğundan emin olun. Erkekler yenidoğan daha küçüktür ve genellikle hızlı kadınlarda daha taşımak. Mictic kadın, belirli koşullar altında 29 amictic kadın farklı ömürleri vardır.

Survival of Time 4. Ölçümler

  1. Plastik levha yerleştirin yenidoğan (yapay deniz suyu içeren her 1 ml tipik haliyle 24 ya da 48 oyuklu plakalar).
  2. 24 saat aralıklarla, eğer daha yüksek bir sıcaklıkta (30 ° C'nin altında OR) yeni hazırlanmış kültür ortamı ya da 12 saatlik aralıklarla rotifer aktarın. döl sayısını kaydetmek ve her bireyin ölü ya da diri olup olmadığı. Koronanın kirpikler hareketi tamamen durduğunda ölü olarak rotifer kaydedin.
    Not: Rotiferler genellikle kuyu yan yüzeyine yapışırlar. Suyun yumuşak pipetleme onları bulmak için yardımcı olur. rotifer bulunamadı veya ar değilsenize yanlışlıkla "sansürlü" olarak değil "ölü" olarak, bunları kayıt, pipetle zarar.
  3. Deneysel rotifer aktif üreyen zaman yenidoğanlar çıkarın. Yenidoğanlar hızla büyümeye ve deneysel rotifer onları ayırmak için bazen zordur.

5. Veri Analizi

  1. Kaplan-Meier sağkalım eğrisi (Şekil 1 ve 2) X ekseninde Y ekseni ve zamanında kümülatif sağkalım oranı çizerek oluşturun. Bu yaşam en yaygın veri temsilidir. Hayatta kalma süresi 34 istatistiksel karşılaştırma için (aynı zamanda Mantel-Cox testi denir) non-parametrik log-rank testi kullanın. log-rank testi aynı zamanda JMP ve R. gibi diğer standart istatistik paket dahildir
    Not: Normal dağılım genellikle hayatta kalma verileri 35 tarafından karşılandı çünkü Student t-testi veya parametrik çoklu karşılaştırma ardından varyans (ANOVA) analizi kullanmayın. Ayrıca, bu metoDS dikkate sansür bireyleri yapmayız. hiçbir sansür veri olup olmadığını Mann-Whitney U testi kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar


Şekil 1 kötü senkronize popülasyonlar (iki çoğaltır dışarı) temsilcisi yaşam eğrilerini göstermektedir. Bu deneyde, rotiferler vardı ya beslenen günlük [ad libitum (AL) grubu] veya (grup IF) her gün. Medyan sağkalım sırasıyla gruplar AL ve IF 13 ve 18 gün idi. iyi IF rotifer ömrünü uzatır olduğu bilinmesine rağmen, bu deney AL ve gruplar IF ömürleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edemedi. Ampirik, erken ölüm ve hayatta kalma oranı ka...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokolü Brachionus rotiferler sağkalım süresini ölçmek için bir yöntem tarif eder. Kritik adım birkaç nesil boyunca rotifer koşulları eşitleme olduğunu. Deneysel rotifer iyi senkronize edildiğinde birkaç önceki çalışmalarda 18,24,37,38 belirtildiği gibi, tipik bir tip I sağkalım eğrisi çok az erken mortalite ile görülmektedir. onların hayatta kalma süresi standart sapmaları dolayısıyla yüksek istatistiksel güç sonuçlanan kötü senkronize rotifer göre daha küçük olur. Senkronizasyon da yaşam s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Biz filme katkılarından dolayı George Jarvis, Martha Bock ve Bette Hecox-Lea, Deniz Biyoloji Laboratuvarı müteşekkiriz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sodyum klorürWako190-13921
Magnezyum klorürWako136-03995
Magnezyum sülfatWako131-00427
Potasyum klorürWako168-22111
Kalsiyum klorürWako035-00455
Sodyum bikarbonatWako199-05985
Sodyum bromürWako190-01515
Membran filtre (0.45 & mikro; m gözenek boyutu)Millipore HAWP04700
Kültür plakası, 6 oyuklu, işlem görmemişThomas Scientific6902D01Düz tabanlı
Kültür plakası, 48 oyuklu, işlem görmemişThomas Scientific6902D07Düz tabanlı
Tetraselmis, LivingCarolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPad YazılımSürümü 6.0d

Kaynaklar

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671(2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108(2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137(2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Rotifer Sa kal m S resiMaternal Kondisyon SenkronizasyonuBrachionus plicatilisKalori K s tlamas Ya am S resiAral kl Oru ProtokolNeonat K lt rlemeYumurtal Bireylerin ToplanmasYapay Deniz Suyu Haz rlamaSa kal m E risi Analizistatistiksel G l m
Hayatta kalma Süre deneyinde
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.