Yöntem makalesi

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

DOI:

10.3791/54131

⸱

31 Ekim 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Greehey Children's Cancer Research Institute, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metilasyon, farklı doku tiplerinin istikrarlı gelişimi ve farklılaşması için gereken genlerin kesin düzenlenmesinden sorumlu olan DNA, için gerekli epigenetik değişiklikler biridir. Bu sürecin düzensizliği sık sık kanser gibi çeşitli hastalıkların özelliğidir. Burada, son sıralama tekniklerden birini anahat, Metil-Bağlama geniş hasta grupları için çeşitli normal ve hastalık dokularda metilasyonu ölçmek için kullanılan DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq). Biz en uygun kantifikasyon ulaşmak için biyoinformatik boru hattı ile birlikte bu afinite zenginleştirme yaklaşımı ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu teknik, 1000 methylome projesi (Kanser Methylome sistemi) bir parçası olarak çeşitli kanser türlerinde hastanın yüz sıralamak için kullanılmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metilasyonu yoluyla gen epigenetik düzenlemesi gövde 1 'de, farklı doku tiplerinin stabil farklılaşması, hücre akıbetini belirlemek için gerekli olan temel mekanizmalardan birisidir. Bu işlemin bozulması kanseri 2 de dahil olmak üzere, çeşitli hastalıklara sebep olduğu bilinmektedir.

Bu işlem, esas olarak DNA 3 CpG dinükleotidleri sitozin tortu üzerindeki metil gruplarının eklenmesini içerir. Şu anda birçok çalışmada 2-8 belirtildiği gibi her biri kendi avantajları olan, bu mekanizmayı araştırmak için kullanılan birkaç farklı teknikler vardır. İşte biz DNA'nın metillenmiş bölgeleri tanımlamak için bir afinite zenginleştirme ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün dokular Kurumsal Değerlendirme Kurulu komitesinin onayını takip eden ve elde edilen tüm katılımcılar moleküler analizler ve takip çalışmaları hem rıza zaman. protokoller San Antonio Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi'nde İnsan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Metil-DNA bağlama Yakalama (MBDCap)

  1. Örnek toplama ve DNA izolasyonu
    1. Hasta parafin doku örneklerinden toplu tümör veya normal doku örnekleri toplamak.
    2. üreticinin protokolüne uygun olarak parafine gömülü doku örneklerinden genomik DNA izole etmek için ticari bir DNA mini kiti kullanarak.
    3. üreticinin protokolüne gö....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu, diğerleri arasında meme 12, endometriyal 13, prostat 14 ve karaciğer kanseri dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerinden hasta çok sayıda DNA metilasyonu değişiklikleri çalışma MBDCap seq kullandık. Burada biz son zamanlarda 12 yayınlanmış meme kanseri çalışmasında bazı bilgileri göstermektedir. Bu durumda, farklı şekilde farklı bir genomik bölgedeki normale göre tümör metile CpG adaları tespit etmek tüm genom sekanslama yaklaşım kullanılır. Araştırma, toplam üzerinden gen promoteri (n = 13.0.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MBDCap seq tekniği hastalar 15 çok sayıda kohortları araştırılırken maliyetli bir alternatif olarak kabul bir afinite zenginleştirme yaklaşımı 3 vardır. Burada sunulan boru hattı veri analizi ve yorumlanması örnek temininden kapsamlı bir yaklaşım anlatılmaktadır. En önemli adımlardan biri DNA metilasyonu meydana geldiği bu gibi genomunda GC zenginleştirilmiş bölgelerinin PCR verimliliğini artırmak için bir PCR prosedürü kuruyor. Ayrıca, dizi analizi sonrasında, her bir örnek benzersiz eşlenmiş, en azından fazla 20.000........

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol San Antonio Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi'nde Dr. Tim Huang ve Dr. Victor Jin laboratuarlarında geliştirilmiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iş CPRIT Araştırma Eğitim Ödülü RP140105 tarafından desteklenen yanı sıra kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 GM114142 verir tarafından ve William & Ella Owens Tıbbi Araştırma Vakfı tarafından desteklenmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Metilminer DNA zenginleştirme KitiInvitrogenME10025
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen112-05D
Bioruptor Plus Sonikasyon CihazıdiagenodeB01020001
3 M sodyum asetat, pH 5.2SigmaS7899100 mL
SPRIworks Parça Kütüphane SistemiI Beckman CoulterA50100Tam otomatik kütüphane inşaat sistemi
Adaptör PrimerleriBioo Scientific514104PCR astar karışımı
QubitInvitrogenQ32854Florometrik Kantitasyon Sistemi
PCR ana karışımıKAPA bilimselKK2621PCR ana karışımı
AMPure XPBeckman CoulterA63881PCR Saflaştırma boncukları
EB TamponQiagen19086
HiSeq 2000 Sıralama SistemiIllumina

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
  2. Nair, S. S., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DNA Metilasyon AnaliziHasta Doku rnekleriGenomik DNA zolasyonuSonikasyon ProtokolEl syon Tamponu Haz rlamaBiyoenformatik AkCpG Ada MetilasyonuKanser Metilomu ProjesiEpigenetik Biyobelirte Ke fi

İlgili makaleler