Polietilen glikol (PEG) ve avidin kaplı cam yüzeye bağlanmış ve mikroakışkan kesme akışlarıyla gerilmiş floresan protein DNA bağlayıcı peptit (FP-DBP) ile boyanmış büyük DNA moleküllerini görselleştirmek için bir yaklaşım sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme
Bu makalede
Özet
Özet
İşlevselleştirilmiş cam yüzeye bağlı büyük DNA molekülleri, polimer fiziği ve biyokimyasında, özellikle DNA ve bağlayıcı proteinleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılmıştır. Burada, yüzeye bağlı büyük DNA moleküllerini görselleştirmek için floresan mikroskobu kullanan bir yöntem bildiriyoruz. İlk olarak, cam lameller biyotinillenir ve biyotinile edilmiş polietilen glikol ile kaplanarak pasifleştirilir, bu da biyotinile DNA'yı avidin protein bağlayıcıları yoluyla spesifik olarak bağlar ve yüzeydeki proteinlerin veya DNA moleküllerinin spesifik olmayan etkileşimlerinden istenmeyen bağlanmayı önemli ölçüde azaltır. İkincisi, DNA molekülleri, terminallerine bağlı olarak iki farklı yöntemle biyotinile edilir. Künt uçlu DNA, terminal transferaz tarafından 3' hidroksil terminalinde biyotinile dUTP ile etiketlenirken, yapışkan uçlu DNA, DNA ligaz tarafından biyotinile tamamlayıcı oligonükleotidler ile hibritlenir. Son olarak, bir mikroakışkan kesme akışı, tek DNA moleküllerinin floresan protein-DNA bağlayıcı peptit (FP-DBP) ile boyandıktan sonra tam kontur uzunluklarına gerilmesini sağlar.
Giriş
Cam ya da topuk kısmı yüzeylerinde gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme DNA alt tabakası, 1,2 ve polimer fizik DNA-protein etkileşimleri, protein dinamiği araştırmak için kullanılmıştır. 3,4 tek gergin büyük DNA molekülleri için bir platform tat birkaç var avantajlar diğer DNA immobilizasyon yöntemlerine göre. 5 İlk olarak, yüzey üzerinde gergin büyük bir DNA molekülü bağlanma sitesi tanıyan bir DNA-bağlama proteini için kritik öneme sahip olan bir kesme akışı olmadan doğal rasgele sargı bir biçime sahiptir. İkinci olarak, bir akış odasının enzimatik reaksiyonlar için bir dizi DNA molekülüne kimyasal ortamı değişt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. DNA Biyotinilasyon
- Terminal transferaz kullanılarak kör uçlu DNA biyotinilasyon (TdT)
Not: künt uçlu DNA Kullan T4 DNA (166 kbp).- 2.5 mM CoCl2, 10 x reaksiyon tamponu 5 ul 10 mM biyotin-11-dUTP ve 0.5 ul, terminal transferaz 0.5 ul (10 birim) ve T4 DNA 0.5 ul (0.5 ug / ul), 5 ul ekle reaksiyon karışımına. Su 38.5 ul ekleyerek 50 ul son hacim olması için yapın.
- 1 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyon karışımı inkübe edin.
Not: Genişletilmiş reaksiyon süresi, yani çift gergin DNA verebilir, biotins iki ucunda etiketlenmiş olması mümkündür. - 0.5 M EDTA, pH 8 5 ul ilave ederek rea....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, 1b, Şekil. Şekil 1a yapışkan uçlu DNA moleküllerinin avidin kaplı PEG yüzeyi üzerinde hareketsiz tamamlayıcı biyotinile oligonükleotid ile melezlenir verilmektedir. DNA molekülünün ucu yapısına bağlı olarak, iki farklı DNA bağlama yöntemleri gösterir eklenmesini gösterir biyotinile ddNTP veya terminal transferaz ile kör uçlu DNA 3 'hidroksil grubuna dNTP. Bu DNA moleküllerinin yapıları ve biyotin arasındaki esnek bağlayıcıla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada yüzeylerde ankraj için biyotinile uzun DNA moleküllerini görselleştirmek için bir platform sunuyoruz. Bu biyotinile sığır serum albümini ile bir avidin protein kaplı yüzey üzerine gergin DNA molekülleri için bir yaklaşım. 6. önceki yaklaşımda bildirmiştir, biz gergin DNA moleküllerini leke bis-interkalasyon boyalar neden olduğu DNA verilmedi-parçalanmasının önemli bir sorun bulduk yüzey. Bu sürekli heyecanlı fluorophores uyarma ışık güç foto-bölünme önlemek için minimize edilmesi gerekiyordu 9,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Sogang Üniversitesi 201410036 Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
4. Akış Odasına Numune Yükleme< / güçlü >
%<td colspan="4">
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1. DNA Biyotinilasyonu | |||
| 1.1) Terminal Transferaz (TdT)Terminal Transferaz kullanılarak künt uçlu DNA'nın biyotinilasyonu | |||
| New England Biolabs | M0315S | 10x reaksiyon tamponu, 2,5 mM kobalt klorür ile sağlanır | |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP de mevcuttur |
| T4GT7 Faj DNA | Nippon Geni | 318-03971 | |
| Etilendiamintetraasetik asit | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) DNA Ligaz/ | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | 10x reaksiyon tamponu ile sağlanır |
| Lambda Faj DNA | Bioneer | D-2510 | Ayrıca New England Biolabs |
| 2. İşlevselleştirilmiş Yüzey Türevlendirmesi | |||
| 2.1) Piranha Temizleme | |||
| Lamel | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22 mm x 22 mm, No. 1 Kalınlık |
| Teflon raf | Özel İmalat | ||
| PTFE İplik Conta Bandı | Han Yang Chemical Co., Ltd. | 3032292 | Teflon ve ticaret; bant |
| Sülfürik asit | Jin Chemical Co., Ltd. | S280823 | H < sub > 2 < / sub > SO< sub > 4 < / sub >,% 95 Saflıkta |
| Hidrojen peroksit | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H 2 < / sub > O < sub > 2 < / sub>, suda% 35 |
| Sonicator | Daihan Scientific Co., Ltd. | WUC-A02H | Masa Üstü Ultrasonik Temizleyici |
| < " güçlü >2.2) Cam Yüzeyinde Aminosilanizasyon< / güçlü > | |||
| < > N< / em> - [3- (Trimetoksisilil) propil] etilendiamin | Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Buzul Asetik Asit | Duksan Chemicals | 414 | 99 Saflıkta |
| Metil Alkol | Jin Chemical Co., Ltd. | M300318 %99,9 Saflıkta Polipropilen | |
| Konteyner | Qorpak | PLC-04907 | |
| Etil Alkol | Jin Chemical Co., Ltd. | A300202 | %99,9 Saflık |
| 2.3) Lamel PEGilasyonu | |||
| Sodyum Bikarbonat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Şırınga Filtresi | Sartorius | 16534----------K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Aseton | Jin Chemical Co., Ltd. | A300129 | %99 Saflıkta Mikroskop |
| Slaytları | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~ 76 mm x 26 mm x 1 & nbsp; mm |
| 3. Akış Odasının Montajı< / güçlü > | |||
| Akrilik Destek | Özel İmalat | ||
| Çift Taraflı Bant | 3M | Şeffaf tip | |
| Çabuk kuruyan Epoksi | 3M | ||
| Polietilen Boru | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gaz Geçirmez 250 ve mikro; l Şırınga | Hamilton | 81165 | |
| Şırınga Pompası | Yeni Dönem Pompa Sistemleri A.Ş. | NE-1000 | |
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris tabanı | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma tabanlı |
| Mikroskop | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Kamera | Q Görüntüleme | Rolera EM-C2 | |
| Katı Hal Lazer (488 ve nbsp; nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. |
Kaynaklar
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
- Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule im....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
