Polietilen glikol (PEG) ve avidin kaplı cam yüzeye bağlanmış ve mikroakışkan kesme akışlarıyla gerilmiş floresan protein DNA bağlayıcı peptit (FP-DBP) ile boyanmış büyük DNA moleküllerini görselleştirmek için bir yaklaşım sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme
Bu makalede
Özet
Özet
İşlevselleştirilmiş cam yüzeye bağlı büyük DNA molekülleri, polimer fiziği ve biyokimyasında, özellikle DNA ve bağlayıcı proteinleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılmıştır. Burada, yüzeye bağlı büyük DNA moleküllerini görselleştirmek için floresan mikroskobu kullanan bir yöntem bildiriyoruz. İlk olarak, cam lameller biyotinillenir ve biyotinile edilmiş polietilen glikol ile kaplanarak pasifleştirilir, bu da biyotinile DNA'yı avidin protein bağlayıcıları yoluyla spesifik olarak bağlar ve yüzeydeki proteinlerin veya DNA moleküllerinin spesifik olmayan etkileşimlerinden istenmeyen bağlanmayı önemli ölçüde azaltır. İkincisi, DNA molekülleri, terminallerine bağlı olarak iki farklı yöntemle biyotinile edilir. Künt uçlu DNA, terminal transferaz tarafından 3' hidroksil terminalinde biyotinile dUTP ile etiketlenirken, yapışkan uçlu DNA, DNA ligaz tarafından biyotinile tamamlayıcı oligonükleotidler ile hibritlenir. Son olarak, bir mikroakışkan kesme akışı, tek DNA moleküllerinin floresan protein-DNA bağlayıcı peptit (FP-DBP) ile boyandıktan sonra tam kontur uzunluklarına gerilmesini sağlar.
Giriş
Cam ya da topuk kısmı yüzeylerinde gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme DNA alt tabakası, 1,2 ve polimer fizik DNA-protein etkileşimleri, protein dinamiği araştırmak için kullanılmıştır. 3,4 tek gergin büyük DNA molekülleri için bir platform tat birkaç var avantajlar diğer DNA immobilizasyon yöntemlerine göre. 5 İlk olarak, yüzey üzerinde gergin büyük bir DNA molekülü bağlanma sitesi tanıyan bir DNA-bağlama proteini için kritik öneme sahip olan bir kesme akışı olmadan doğal rasgele sargı bir biçime sahiptir. İkinci olarak, bir akış odasının enzimatik reaksiyonlar için bir dizi DNA molekülüne kimyasal ortamı değiştirmek oldukça kolaydır. Üçüncü olarak, bir mikroakışkan kesme akımı alternatif DNA uzama kullanarak elde etmek çok zordur tam kontur uzunluğu,% 100 kadar uzanan moleküler DNA, yüzey immobilizasyon 6 ve nanochannel hapsi olarak yaklaşımları neden olur. 7 A stretche tamD bir DNA molekülü genomik haritada enzimatik hareketlerini izlemek için yararlı olabilir konumsal bilgi sağlar.
Bununla birlikte, DNA, bağlama yaklaşım, YOYO-1 genel olarak, bağlı DNA molekülleri kolaylıkla flüoresan uyarma ışık kırılması neden olduğu için bu araya eklenen boyanın önemli bir dezavantajı vardır. Genel olarak, büyük DNA moleküllerinin bir flüoresan mikroskobu altında görüntülenmesi için bir floresan boya ile boyanmış olması gerekir. Bu amaçla, YOYO-1, ya da diğer TOTO serisi boyalar da iki-şeritli DNA interkalasyon olduğunda bu boyalar, sadece floresan için öncelikle kullanılır. 8 Bununla birlikte, bis-araya eklenen boyanın ışık kaynaklı DNA verilmedi-bölünme için neden olduğu iyi bilinmektedir fluorophores ardalanması. 9 ayrıntılı bir yüzeyde gergin floresan lekeli DNA molekülleri kesme akımları serbestçe DNA moleküllerini hareketli kuvvetleri kırılma uygulamak beri daha kırılgandır. Bu nedenle, biz bir roman D olarak FP-DBP geliştirdiyüzey üzerinde gergin büyük DNA moleküllerini görüntülenmesi için NA-boyama Protein boya. AP-DBP kullanmanın avantajı, bunun bağlandığı DNA moleküllerinin verilmedi-bölünmesini neden olmasıdır. 10. Ayrıca bis-interkalasyon boyalar çevre uzunluğu artmakta, AP-DBP, DNA çevre uzunluğu artmaz yaklaşık% 33.
Bu video yöntemi PEG-biyotin yüzeye büyük DNA moleküllerini hayvan zinciri için deneysel bir yaklaşım getirmektedir. 1 küt uçlar ve yapışkan uçları ile DNA tethering farklı yaklaşımlar göstermektedir Şekil. Bu durumda, bu boyama yöntemi, DNA molekülünün her türlü uygulanabilir. 2 DNA moleküllerini germek için ve kimyasal ve enzimi yüklemek için kesme akışı üretmek üzere bir şırınga pompası ile kontrol edilebilir akış odası düzeneğinin şematik bir temsilini tasvir etmektedir çözümler. Şekil 3 PEGylat üzerinde gergin tamamen gerilmiş DNA moleküllerinin mikrograflarını gösteriyorEd yüzeyi 11 ve AP-DBP ile boyandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. DNA Biyotinilasyon
- Terminal transferaz kullanılarak kör uçlu DNA biyotinilasyon (TdT)
Not: künt uçlu DNA Kullan T4 DNA (166 kbp).- 2.5 mM CoCl2, 10 x reaksiyon tamponu 5 ul 10 mM biyotin-11-dUTP ve 0.5 ul, terminal transferaz 0.5 ul (10 birim) ve T4 DNA 0.5 ul (0.5 ug / ul), 5 ul ekle reaksiyon karışımına. Su 38.5 ul ekleyerek 50 ul son hacim olması için yapın.
- 1 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyon karışımı inkübe edin.
Not: Genişletilmiş reaksiyon süresi, yani çift gergin DNA verebilir, biotins iki ucunda etiketlenmiş olması mümkündür. - 0.5 M EDTA, pH 8 5 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
- 4 ° C'de tüp tutun.
- DNA ligazı kullanılarak yapışkan uçlu DNA biyotinlenmesi
Not: Bir yapışkan uç DNA Kullan λ DNA (48.5 kbp).- T4 DNA ligaz 1 ul 10 x ligasyon tampon maddesi 5 ul, 25 ng 1 ul ekle / λ faj DNA ul ve 50 ul bir son hacim yapmak için, su 43 ul ilave edin.
- 4 ° C'de tüp tutun.
2. İşlevsel yüzey türetilmesi
Not:. Şekil 1 'de gösterildiği şekilde, cam yüzey üzerinde bir DNA molekülünün bir son halata için, bir birincil amin grubu biyotin-PEG kaplama ardından bir lamel silanlı olan bu PEGilasyon prosesi, tek bir molekül, DNA görüntüleme için önemlidir çünkü o önemli ölçüde yüzeyde istenmeyen moleküllerin eki tarafından oluşturulan rastgele gürültüyü azaltabilir.
- piranha Temizleme
Not: Piranha çözümleri bu nedenle uygun güvenlik yönergeleri izleyerek, dikkatle ele alınmalıdır, organik malzemelerle şiddetle tepki.- Bir yerde bir politetrafloroetilen (PTFE) rafa lamelleri, b onları tutuny PTFE boyuna iplik mühür bandı, raf üzerinde yüzeylerin kenarında ve yarım yarım. sarma sonra, temizlik işlemi sırasında raf işlemek için bant uzun parçası (~ 5 cm) bırakın.
- SO, H2O 2 4 ve 150 ml davlumbaz pirana çözelti yapmak için H2, 350 ml 1 L cam beher. 2 saat pirana çözelti içinde raf yerleştirin.
- beher su pH kadar iyonu giderilmiş su ile iyice boş kaptan pirana çözeltisi ve durulama lamelleri nötr ulaşır. pH kağıdı şeritleri kullanın.
- 30 dakika süre ile, beher içeren su içinde kapak slipleri raflar sonikasyon. beher sadece amino silanizasyon önce boş su. cam yüzeylerin temizlenmesi ve türetmek için sonikasyon gücü 75 W kullanın.
- Cam Yüzeyinde Aminosilanization
- N 2 ml ilave edilir - [3- (trimetoksisilil) propil] etilendiamin ve 200 ml buzlu asetik asit 10 miaminosilanization çözeltisinin hazırlanması için temiz polipropilen kaba metil alkol.
- polipropilen kaba temizlenmiş lamelleri yerleştirin. 30 dakika boyunca 100 rpm'de ve oda ısısında çalkalanır.
- W, en az 30 dakika boyunca 100 rpm'de ve oda ısısında çalkalayın 75 ° C'da 15 dakika için türetilmiş kapak slipleri ile beher sonikasyon.
- etil alkol ile iki kez beher solüsyonun boşaltın ve metil alkol ile bir kez dikkatli bir şekilde lamelleri durulama ve. Mağaza etil alkolde lamelleri ve iki hafta içinde bunları kullanmak.
- Lamel PEGilasyon
- 0.1 M sodyum bikarbonat, 10 ml (NaHCO3) sağlayın. 0.22 um'lik bir şırınga filtresi ile filtre solüsyonu.
- Biyotin-PEG-süksinimidil karbonat (biyotin-PEG-SC) NaHCO 3 350 ul PEG-süksinimidil valerat 80 mg (mPEG-SVG) 2 mg eritin. hafif bir koruma tüpü kullanın.
- 1 için kuvvetli bir şekilde tüp vorteks0 sn ve santrifüj o 1 dk kabarcıklarını çıkarmak için 10.000 x g'de.
- etil alkol ile yıkama, ardından aseton ile, bir cam slayt, durulayın. havaya slayt tamamen kurumasını bekleyin.
- temiz bir cam slayt PEG çözeltisi bir damla (50 ul) yerleştirin. herhangi bir kabarcıklar oluşturmadan, bir amino Silanlanmış kapak kayma ile hafifçe damlacık örtün.
- 3 saat boyunca yer slaytlar gecede karanlıkta oda sıcaklığında nemli odasını iyi tesviye etmek. altta su ile oda olarak boş bir pipet ucu tutucu kullanın. tüp içinde kalan PEG çözeltisi kapatılır ve 4 ° C'de tutun.
- iyonu giderilmiş su ile iyice PEG'lenmiş lamel durulayın. kullanana kadar karanlık ve kuru bir yerde saklayın.
3. Bir akış odası Montaj
- . Şekil 2'deki gibi, bir delikli akrilik tutucu imal boru ucun çapı 0.762 mm olduğundan emin olun ve bir delikli bir giriş olduğu tayin ve diğeribir çıkış (Şekil 2).
- Herhangi bir kanal delik perturbing değil, bir giriş ve çıkış deliğine dik hizalama çift taraflı yapışkan bant şeritler akrilik tutucu (genişlik 5-6 mm) (Şekil 2), yerleştirin. Çok kanallı duvarları odaları yapmak için bu bant şeritlerini kullanın. Bir pipet ucu kullanılarak bandı fırçalayın.
- yüzükoyun PEG'lenmiş tarafı, akış odalarını yapmak için üstüne bir PEG'lenmiş lamel yerleştirin.
- sızıntı herhangi bir çözüm önlemek için, çift taraflı bantlar yerleştirilir alana bir lamel üstüne basın. Üst ve alt (Şekil 2'de sarı renk) de odacığın kenarlarını kapatma çabuk kuruyan epoksi yapıştırıcı ekleyin.
- Bir gaz geçirmeyen şırınga boru (dış çapı OD, 0.042 ") arasında kısa bir parça (2.5 cm) geç ve epoksi yapıştırıcı ile bağlantıyı tıkamak.
- şırınga ile bağlantılı boru ve epoksi yapıştırıcı ile ortak mühür: Uzun esnek borular (0.03 "OD) bağlayın.
- Tubi doldurunng DI su ile şırınga ile bağlantılı. hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- epoksi yapıştırıcı ile kapatılmış akış odasının deliğe boru yerleştirin.
- bir rezervuar olarak diğer delik sarı ucu (200 ul ucu) yerleştirin.
Akış Odası içine 4. Numune Yükleme
Not: Neutravidin streptavidin gibi diğer avidin protein ile değiştirilebilir. Bu açıklanan sürece bütün tepkimeler, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. Sarı uç örnek çözümü almak ve akrilik tutucu (Şekil 2b) deliği üzerine solüsyonu ile ucu yükleyin.
- / Dakika, 50 ul şırınga pompa akış hızını ayarlayın. Yük avidin protein 20 ul (T50 çözeltisi içinde 25 ug / ml, 10 mM Tris, NaCl 50 mM, pH 8), 10 dakika için tutun.
- Yük 20 biyotinlenmiş oligodeoksinükleotidler ul (1 x TE 100 uM) ve 10 dakika için tutun. terminal transferaz kullanılırsa, yükleme atlamakoligodeoksinükleotidler evi.
- Yük 20 10 ul / dk'lık bir akış oranında akış odasına Kademe 1 DNA çözeltisi ul ve 30 dakika için tutun.
- 1 × TE ile akış odasına yıkayın ve FP-DBP 10 (~ 80 nM) 40 ul yükleyin.
- 60X objektif lens 1 × TE boyama moleküllerin sürekli akış ile floresan mikroskop altında DNA gözlemleyin. FP (eGFP) -DBP uyarılması için 488 nm katı hal lazer kullanın. DNA moleküllerinin tam germek için, kullanılan DNA uzunluklarına göre farklı akış oranlarına uygulanır. Örneğin, T4 DNA 166 kbp için λ DNA 48.5 kbp, ve 100 ul / dakika 50 ul / dak uygulanır.
- Akrilik tutucu geri dönüşümü için, bir deterjan çözeltisi 12 monte akış odaları ıslatın. tamamen çıkarmak için elleriyle bir jilet ve ovalayın kasetleri ve epoksi çıkarın. şırınga iğneleri ile delikleri unclog. sonraki kullanıma kadar deiyonize su içinde tutucular tutun.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, 1b, Şekil. Şekil 1a yapışkan uçlu DNA moleküllerinin avidin kaplı PEG yüzeyi üzerinde hareketsiz tamamlayıcı biyotinile oligonükleotid ile melezlenir verilmektedir. DNA molekülünün ucu yapısına bağlı olarak, iki farklı DNA bağlama yöntemleri gösterir eklenmesini gösterir biyotinile ddNTP veya terminal transferaz ile kör uçlu DNA 3 'hidroksil grubuna dNTP. Bu DNA moleküllerinin yapıları ve biyotin arasındaki esnek bağlayıcıla...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada yüzeylerde ankraj için biyotinile uzun DNA moleküllerini görselleştirmek için bir platform sunuyoruz. Bu biyotinile sığır serum albümini ile bir avidin protein kaplı yüzey üzerine gergin DNA molekülleri için bir yaklaşım. 6. önceki yaklaşımda bildirmiştir, biz gergin DNA moleküllerini leke bis-interkalasyon boyalar neden olduğu DNA verilmedi-parçalanmasının önemli bir sorun bulduk yüzey. Bu sürekli heyecanlı fluorophores uyarma ışık güç foto-bölünme önlemek için minimize edilmesi gerekiyordu 9,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Sogang Üniversitesi 201410036 Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
4. Akış Odasına Numune Yükleme< / güçlü >
%<td colspan="4">
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1. DNA Biyotinilasyonu | |||
| 1.1) Terminal Transferaz (TdT)Terminal Transferaz kullanılarak künt uçlu DNA'nın biyotinilasyonu | |||
| New England Biolabs | M0315S | 10x reaksiyon tamponu, 2,5 mM kobalt klorür ile sağlanır | |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP de mevcuttur |
| T4GT7 Faj DNA | Nippon Geni | 318-03971 | |
| Etilendiamintetraasetik asit | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) DNA Ligaz/ | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | 10x reaksiyon tamponu ile sağlanır |
| Lambda Faj DNA | Bioneer | D-2510 | Ayrıca New England Biolabs |
| 2. İşlevselleştirilmiş Yüzey Türevlendirmesi | |||
| 2.1) Piranha Temizleme | |||
| Lamel | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22 mm x 22 mm, No. 1 Kalınlık |
| Teflon raf | Özel İmalat | ||
| PTFE İplik Conta Bandı | Han Yang Chemical Co., Ltd. | 3032292 | Teflon ve ticaret; bant |
| Sülfürik asit | Jin Chemical Co., Ltd. | S280823 | H < sub > 2 < / sub > SO< sub > 4 < / sub >,% 95 Saflıkta |
| Hidrojen peroksit | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H 2 < / sub > O < sub > 2 < / sub>, suda% 35 |
| Sonicator | Daihan Scientific Co., Ltd. | WUC-A02H | Masa Üstü Ultrasonik Temizleyici |
| < " güçlü >2.2) Cam Yüzeyinde Aminosilanizasyon< / güçlü > | |||
| < > N< / em> - [3- (Trimetoksisilil) propil] etilendiamin | Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Buzul Asetik Asit | Duksan Chemicals | 414 | 99 Saflıkta |
| Metil Alkol | Jin Chemical Co., Ltd. | M300318 %99,9 Saflıkta Polipropilen | |
| Konteyner | Qorpak | PLC-04907 | |
| Etil Alkol | Jin Chemical Co., Ltd. | A300202 | %99,9 Saflık |
| 2.3) Lamel PEGilasyonu | |||
| Sodyum Bikarbonat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Şırınga Filtresi | Sartorius | 16534----------K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Aseton | Jin Chemical Co., Ltd. | A300129 | %99 Saflıkta Mikroskop |
| Slaytları | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~ 76 mm x 26 mm x 1 & nbsp; mm |
| 3. Akış Odasının Montajı< / güçlü > | |||
| Akrilik Destek | Özel İmalat | ||
| Çift Taraflı Bant | 3M | Şeffaf tip | |
| Çabuk kuruyan Epoksi | 3M | ||
| Polietilen Boru | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gaz Geçirmez 250 ve mikro; l Şırınga | Hamilton | 81165 | |
| Şırınga Pompası | Yeni Dönem Pompa Sistemleri A.Ş. | NE-1000 | |
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris tabanı | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma tabanlı |
| Mikroskop | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Kamera | Q Görüntüleme | Rolera EM-C2 | |
| Katı Hal Lazer (488 ve nbsp; nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. |
Kaynaklar
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
- Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
- Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
- Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
- Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
- Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
- Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
