Yöntem makalesi

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

DOI:

10.3791/54144

⸱

1 Ekim 2016

 ,  ,  ,  , 
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2College of Interdisciplinary & Creative Studies, Konyang University, 3Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, ısmarlama bir taşınabilir FRET analizörü kullanarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) sensörü verilerinin hızlı ve son derece hassas ölçümü açıklanır. Cihaz şeker içeriğinin pratik ve etkili bir değerlendirme sağlayan saptama hassasiyetini maksimuma kritik sıcaklık aralığında maltoz tespit etmek için kullanıldı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Förster rezonans enerji transferi son gelişmeler (FRET) sensörleri iyonların ve amino asitler gibi çeşitli küçük moleküller tespit etmek kullanımını sağlamıştır. Ancak, FRET sensörlerinin doğuştan zayıf sinyal yoğunluğu çeşitli alanlarda uygulamalarını engeller ve pahalı, high-end kullanılması gerekli Fluorometreler yapan önemli bir sorundur. Daha önce, özellikle yüksek algılama hassasiyetini elde etmek için iki emisyon dalga boyu bantları (530 ve 480 nm) oranını ölçebilen bir maliyet-etkin, yüksek performanslı FRET analizörü inşa. 55 ° C - Daha yakın zamanda, bakteriyel periplazmik bağlayıcı proteinleri ile FRET sensörler 50 kritik sıcaklık aralığında en yüksek hassasiyete sahip ligandlar tespit keşfedilmiştir. Bu rapor, bir ısı özgü FRET sensörü ile portatif FRET analizörü kullanılarak ticari olarak temin edilebilen içecek numuneleri şeker içeriği değerlendirmek için bir protokol açıklamaktadır. Bizim sonuçlar ek ön ısıtma gösterdiFRET sensörünün süreci önemli ölçüde şeker içeriği daha doğru ölçüm sağlamak için, FRET oranı sinyalini artırır. ısmarlama FRET analizörü ve sensör başarıyla ticari içecek üç tip şeker içeriği ölçmek için uygulanmıştır. Biz high-end ekipman mevcut olmadığı durumlarda ekipman daha fazla boyut küçültme ve performans geliştirme ortamlarında el analiz kullanımını kolaylaştırmak olacağını tahmin ediyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Förster rezonans enerji transferi (FRET), yaygın olarak, şekerler, kalsiyum iyonları, ve amino asitler 1-4 küçük moleküllerin tespit biyometrik sensör olarak kullanılmıştır. FRET biyosensörler floresan proteinleri, mavi floresan proteinleri (Çağrıları) ve periplazmik-bağlayıcı proteinlere (PBP) her iki ucuna kaynaştırılır san bir floresan proteinleri (YFPs), ihtiva etmektedir. Şekerler daha sonra PBP her iki ucunda iki floresan protein mesafesi ve geçiş dipol yönünü değiştirme sensörüne yapısal değişikliklere neden FRET sensörü ortasında bulunan PBP bağlanır. Bu değişiklik, EYFP (530 nm) ve ECFP (480 nm) emisyon dalga boyları oranını ölçerek şeker içeriğinin nicel analiz edilmesini sağlar. Yüksek hassasiyet, seçicilik, gerçek zamanlı izleme kapasitesi ve FRET biyosensörlerin hızlı tepki süresi sayesinde, bu sensörler yaygın çevresel, endüstriyel ve tıbbi uygulamalarda 5 kullanılmaktadır. Ayrıca, ratiomSensör konsantrasyonu kolaylıkla kontrol edilebilir ve eşiğe her zaman mevcut olamaz kompleks biyolojik örneklerinde bileşenleri ölçmek için kullanılabilir gibi FRET biyosensörler kullanılarak Etric ölçümü, önemli pratik avantajları vardır.

nicel görselleştirme için FRET tabanlı sensörlerin bu avantajlara rağmen, floresan proteinleri eksik alan hareket transferi ile küçük yapısal değişiklikler doğal olarak zayıf sinyal yoğunluğu üretir. Bu zayıf sinyal in vitro ya da in vivo analiz 6'da FRET bazlı sensörler uygulanmasını sınırlar. Sonuç olarak, çoğu biyosensörler pahalı ve son derece hassas ekipmanların kullanılmasını gerektirir FRET. Daha önce, mevcut flüoresan analiz 7 benzer yetenekleri ile ucuz ve taşınabilir bir FRET analizörü geliştirdi. Bu cihaz, ucuz 405-nm bant ultraviyole ışık yayan diyot (LED) olarak th uyarma neden ışık kaynağı olarak kullanıldıe floresan sinyali, pahalı bir lamba veya lazer değiştirilmesi. analizörü algılama sistemi verimli bir silikon fotodiyot iki fotodedektörlerle üzerine dissipating floresan sinyali odaklanır. 55 ° C belirgin oranlı metrik FRET sinyalini 8 büyütmek olabilir - daha yeni bir çalışmada, 50 tespit sıcaklığının optimizasyonu olduğunu göstermiştir. Bu sıcaklık-spesifik sinyal geliştirme, ısmarlama FRET analizörü ile birlikte hızlı ve yüksek hassasiyet ile daha genel tanısal uygulamalarda FRET sensörlerinin kullanılmasını sağlar.

Bu protokol, biz ticari olarak temin edilebilen içeceklerin şeker içeriğinin miktarının optimal FRET sıcaklık koşulları altında FRET analizörü genel uygulanabilirliği gösterdi. Bu protokol FRET cihaz operasyonun ayrıntıları yanı sıra, sensörlü ve numune hazırlama kısa bir açıklamasını sağlar. Bu raporun taşınabilir potansiyel uygulanmasını teşvik edeceğini tahminküçük ölçekli laboratuvar ortamlarında analiz ve FRET tabanlı biyosensörler ile ucuz bünyesinde tanı cihazı daha da geliştirilmesi için bir temel oluşturacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyosensör 1. Hazırlık

  1. Daha önce kurulan protokol 2 aşağıdaki ile CFP-MBP-YFP His6 - plazmid pET21a (+) Construct.
  2. Bir Escherichia coli DE3 soyunun tek bir koloni ile Luria etsuyu (LB) 5 ml inoküle ve çalkalanarak 16 saat 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Aktarım 100 mi LB ihtiva eden ve 600 nm'de (OD600) 'deki optik yoğunluk 0.5 (yaklaşık 3 saat) ulaşana kadar bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de inkübe 500 ml'lik bir şişeye O / N kültürünün 1 mi.
  4. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile 50 ml konik bir tüp içinde hücreler hasat edilir.
  5. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de 50 ml buz gibi soğuk damıtılmış su (DW) ve santrifüj her bir tüp içinde hızlı bir şekilde pelletini.
  6. Hafifçe çözeltisi (elektro hücreleri) kadar dönen% 10 (h / h) gliserol ile buz soğukluğunda DW 50 ul pelletini bir OD ulaşır 600 100.
  7. Bir elektroporasyon cihazı ve elektroporasyona bir buz soğukluğunda elektroporasyon küveti içinde CFP-MBP-YFP His6 - ve plazmid pET21a (+), 10 ng (OD 100 600 hücreleri 50 ul) elektro uyumlu hücre karışımı yerleştirin karışım (18 kV / cm, 25 uF'de).
  8. Hızlı bir şekilde yumuşak bir 15 ml lik yuvarlak dipli tüp çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de geri ardından yavaşça hücreler, küvete 1 ml SOC ortamı ilave edin ve tekrar süspansiyon.
  9. 100 ug / ml ampisilin içeren LB plakasına hücrelerinin yayılmasını ve 12 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  10. bir döngü kullanarak tek bir koloni izole etmek ve LB 12 saat süre ile bir çalkalama 37 ° C'de 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden 10 ml koloni inoküle.
  11. 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB 500 ml tohum kültürü 5 ml ilave edilir ve 37 ° C sıcaklıkta çalkalanarak kuluçka makinesi içinde kültür inkübe edin.
  12. 0.5 mM izopropil β-D-tiyogalaktozid (IPTG) OD 600 ulaşır ekleme0.5 ile 24 saat boyunca 37 ° C'de çalkalama inkübatöründe kültür inkübe edin.
  13. Santrifüj 20 dakika (4 ° C) ve yavaşça süpernatant kaldırmak için 4.500 x g'de hücreleri.
  14. 5 ml bağlama tamponu (20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM PMSF, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT) içinde pelletini.
  15. Her soğutma 10 sn patlama sonrasında 200-300 W altı 10 sn patlamaları ile buz üzerinde hücreleri ses dalgalarına maruz.
  16. 10.000 × lizat santrifüj 4 ° C'de 30 dakika boyunca g hücre yıkıntıları pelet haline getirildi. Yeni bir toplama tüpüne süpernatant (çözünür protein) aktarın.
  17. Ni-NTA afinite sütunu (5 ml hacim) üzerine FRET sensör proteinlerinin eğilim saflaştırılmasına yük temizlenmiş hücre lizatının 4 mi elde etmek ve hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) 18 kullanarak bir kromatografi deneme yapmak.
  18. Yıkama tamponu, beş kolon hacmi ile bir kez kolon yıkaması I (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 10 mM imidazol, pH 7.0).
  19. yıkama tamponu II beş kolon hacmi (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 20 mM imidazol, pH 7.0) ile yıkama adımı tekrar edin.
  20. Elüsyon tamponu, beş kolon hacmi (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 500 mM imidazol, pH 7.0) ile sensör proteinini ayrıştırmak.
  21. konsantre edilen örnek desalt için 3000 x g'de 10 dakika boyunca numune ve santrifüj kadar 20 ml konsantratör (10,000 MW zar boyutu) doldurun. % 0.8 fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yoğunlaştırıcı doldurun. İlk örnek, 20 ml ile konsantratör doldurulması ve daha sonra PBS ile tekrar doldurulması, iki kez yineleyin.
  22. Konsantre ve de-tuzlu sensör protein kurtarmak ve -80 ° C'de saklayın.

FRET Analyzer kullanarak Şeker İçeriği 2. Ölçüm

NOT: FRET analizörü yapım ayrıntıları daha önceki çalışmalarında 7'de tarif edildi.

  1. % 0.8 PBS 0.2 içeren bir algılama çözüm hazırlayınSensör proteinlerinin uM.
  2. FRET analizörü açın. Optimal sıcaklığı ayarlamak için 2 sn "UP" butonuna basın. "UP" ve "DOWN" tuşlarını kullanarak 53 ° C'ye sıcaklığı ayarlamak ve "SET" düğmesine basın.
  3. Kalibrasyon, basın ve 2 saniye aynı anda "UP" ve "DOWN" tuşlarını tutun. LED panelinde "CALIB" ve "SET" tuşuna basınız emin olun.
  4. Sadece PBS analizörü bir küvet tutucu içine tampon ve "SET" tuşuna basınız içeren 12.5 × 12.5 × 45 mm (uzunluk x genişlik x yükseklik) dikdörtgen paralelkenar damar (küvet) yerleştirin.
  5. bir şeker (maltoz / sakaroz) olmadan sadece algılama solüsyonu (2.1 bakınız) içeren küveti değiştirin ve taban çizgisini kalibre etmek için "SET" tuşuna basınız.
  6. 10 mM şeker ile tespit çözeltisi içeren biriyle küveti değiştirin ve "SET" tuşuna basındüğmesine basın.
  7. bir içecek numunesinin şeker içeriğini belirlemek için, 1 dakika için 16,000 x g'de bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj 1 ml içecek numunesi yerleştirin.
    Not: FRET sensör tabanlı floresans ölçümü toplam hacim içinde bulunan örnek nedeniyle sadece% 1 (h / h) numunenin özel ön-tedaviye ihtiyaç avantajına sahiptir. Ancak, floresan ölçümü (örneğin, hücreler, çözünmeyen parçacıklar, lipit, yağ veya otofloresans ile herhangi bir malzeme) etkileyebilecek herhangi bir malzeme kaldırmanızı öneririz. güçlü bir asit, kuvvetli baz, madde (deterjan) temizlenmesi veya emülsifiye edici ajan (emülgatör), yüksek konsantrasyonda mevcut olması ve FRET biyolojik sensör özelliklerini etkileyebilir, buna ek olarak, bir organik çözücü veya bir kullanılarak temizlenebilir olmalıdır neutralizeR. süt yağ ve emülsiyon yapıcılar, dondurulmuş atıştırmalıklar elenir, örneğin, numuneler, 30 dakika, ve sıvı betwee 16,000 x g'de mikrofüj tüpüne santrifüjlenirn alt sediment ve süt yağ üst tabakası ekstre edilir. heksan eşit miktarda 30 dakika lipidlerin ortadan kaldırmak için 15.000 x g'de santrifüjleme ile, ardından eklenmektedir.
  8. 1 ml'lik şırınga ile süpernatantı ve bir şırınga filtre ile (gözenek boyutu 0.2 um) aracılığıyla filtre.
  9. yavaşça 0.9 ml PBS ve vorteks içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde içecek numunesinin süzüldü 0.1 ml yerleştirin.
    Not: Düzgün içecek numunesinin seyreltilmesi için çok önemlidir. Şeker konsantrasyonu, cihazın dinamik aralığı içinde olacaktır, böylece bu durumda, 1000-kat seyreltme yapılmıştır. Biz içeceğin etiketinde şeker içeriğine bakarak önceden hedef şeker konsantrasyonunu tahmin öneririz.
  10. Algılama çözeltisi 0.495 ml ihtiva eden bir küvete (% 1 v / v) ile seyreltildi içecek numunesinin 5 ul ekle.
  11. FRET analizörü bir küvet tutucu küvet koyun ve 53 ° C'ye kadar örnek çözümü ısıtın.
  12. şeker içeriği ölçmek için "SET" tuşuna basınız.
    488/535 nm 7,8 de oranı okuyarak sıcaklık kontrolü için bir Peltier cihazı ile donatılmış bir çok etiketli plaka okuyucusu veya flöresanlı bir spektrofotometre kullanılarak FRET ölçümü değerlendirmek olasıdır. Sakaroz tespiti için, bir CSY-LH sensörü 2 ile 2.12 1.1 den adımları uygulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET analizör kullanarak şeker içeriği kantitatif analizi gerçekleştirmek için, gözlenen FRET oranı hedef şeker konsantrasyonunu tahmin donatılmış bir eğri oluşturmak için gereklidir. R 480 nm CFP emisyon yoğunluğu oranını tanımlayan ve YFP emisyon yoğunluğu 530 nm (Eq. 1) oluşturulan edelim.

figure-results-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol FRET sensörler için optimal bir ısıda bir ısmarlama FRET analizörü 7 kullanarak, içecek örneklerinde şeker içeriğinin hızlı ve etkili bir ölçümü sağlar. analizörü yakın zamanda geliştirilen, ucuz 405-nm bant ışık kaynağı ve bir silikon fotodiyot iki fotodedektörlerle olarak ultraviyole-LED ile tasarlanmıştır. Bu cihaz, daha düşük maliyetli, diğer benzer Fluorometreler daha uzundur. FRET sensörler için en uygun sıcaklık aralığında iki emisyon dalga boyu bantları (530 nm ve 480 nm) oranının ölçülmes...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Küresel Frontier Projesi (2011-0031944) ve KRIBB Araştırma Girişimi Programı Akıllı Sentetik Biyoloji Merkezi'nden hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
LBBD# 244620
izopropil ve beta;-D-tiyogalaktozit (IPTG)SigmaI6758
AmpisilinSigmaA9518
Tri-HClBioneerC-9006-1
PMSFSigma78830
EDTABioneerC-9007
DTTSigmaD0632
NaClJunsei19015-0350
fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco70011-044%0,8 NaCl, %0,02 KCl, %0,0144 Na2HPO<>alt4, %0,024 KH2OP4, pH 7,4
SOC%2 tripton, %0,5 Maya özütü, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glikoz
Kaynağı QAmersham Biosciences17-1177-016 > 30 mm anyon değişim kromatografisi sütunu 
HisTrap HP1Amersham Biosciences29-0510-21
Kuvars küvetSigmaZ802875
AK & Auml; KTAFPLCAmersham Biosciences18-1900-26hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC)
Cary EclipseVarianIncbir floresan spektrofotometresi
VICTOR   PerkinElmer2030-0050çok etiketli bir plaka okuyucu
E. coli JM109 (DE3)PromegaElektroyetkin hücreler
A (İçecek)Korea Yakult Co. (Kore)BirakFermente içecekler
B (İçecek)Lotte Foods (Kore)EproAlkolsüz içecek
C (İçecek)Lotte Foods (Kore)GetoraySporcu içeceği

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
  2. Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
  3. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  4. Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  5. Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
  6. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  7. Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
  8. Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
  9. Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
  10. Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
  11. Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
  12. Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
  13. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
  14. Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
  15. Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
  16. Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
  17. Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
  18. Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FRET Sens reker TespitiS cakl k OptimizasyonuBiyosens r Safla t rmaMaltoz Nicelendirmesiecek AnaliziEmisyon OranKalibrasyon Protokol

İlgili makaleler