Yöntem makalesi

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

DOI:

10.3791/54161

⸱

13 Temmuz 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğru kimlik ve bağırsak mukoza zarının üzerinde epitel hücreleri konumu farklı hücre soyları tanımlamak için gereklidir. bağırsak dokuların uygun görüntüleme maksimum çözünürlük ile protein ekspresyonu belirlenmesi için çok önemlidir. Bu çalışma işleme fare bağırsak dokuları için en uygun yöntem ve koşulları belirginleştiren amaçlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak epitel homeostazını düzenleyen faktörlerin rolünü ve yaralanma ve rejenerasyona yanıtı anlamak önemlidir. Mevcut literatür, veri doğrulama için bağırsak dokularının görüntülerini elde etmek için birkaç farklı metodolojik yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yazıda, fare bağırsak dokularının türetilmesi ve işlenmesi ile ilgili ortak bir protokolü betimliyoruz. Bağırsak dokularının uygun şekilde tespit edilmesi ve bağırsak epitel morfolojisini artıran Swiss-roll teknikleri tartışılmıştır. Rezeksiyon sonrası işleme ve gömülü bağırsak dokularının yeniden oryantasyonu, kesit alındıktan sonra sağlam bağırsak yapısal özellikleri gösteren parafine gömülü blokların elde edilmesinde kritik öneme sahiptir. İsviçre haddeleme tekniği, incelenen tüm bağırsak veya kolon bölümlerinin histolojik değerlendirmesine yardımcı olur. Bağırsak yapısal özelliklerini ayırt etme yeteneği, tüm uzunluk boyunca bağırsak iltihabı ve tümör oluşumunun kantitatif ölçümlerinde hayati önem taşıyabilir. Son olarak, parafine gömülü bölümler, hem immünohistokimyasal hem de immünofloresan tespit yöntemlerini kullanarak sağlam işleme için idealdir. Floresan olmayan immünohistokimyasal kesitler, farklı hücresel yapısal özellikleri detaylandıran dokunun canlı bir görüntüsünü sağlar, ancak hücre içi ko-lokalizasyon deneyleri için esneklik sağlamaz. Çoklu floresan kanalları, ko-lokalizasyon deneyleri için immünofloresan algılama ile uygun şekilde kullanılabilir ve mekanistik çalışmalara destek verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli bağırsak epitel sütun hücrelerinin tek bir katman ihtiva eder. farklılaşmış hücreler villus bölgesini işgal ederken ince bağırsakta, proliferatif hücreler crypts sınırlıdır. kalın bağırsakta hiçbir villus olduğundan Ancak, proliferatif hücreler kriptalarının altına lokalize ve farklılaşmış hücrelerin kriptalarının üst bölgesini işgal edilmiştir. crypts içinde proliferatif hücrelerin sürekli bölünmesi ile tahrik edilir - (5 gün yaklaşık 3) bağırsak epiteli hızlı ikmal uğrar. Kript proliferatif hücrelerin homojen popülasyon değildir ve daha fazla kök hücre ve transit amplifiye (TA) hücreleri 1 bölünür. 2 çok alttan 5 hücreleri - kök hücreler ilk 4 içinde, crypt dibinde bulunur. crypt baz sütunlu (CBC) kök hücre ve rezerv hareketsiz kök hücreleri: Mevcut model iki kök hücre tiplerinin varlığını destekler. CBC sTEM hücreleri etkin bir şekilde çoğalan ve Lösin açısından zengin tekrar içeren, G-proteine ​​akuple bir reseptör 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 ile Achaete Scute benzeri 2 (Ascl2) 5 ile işaretlenmiştir. Öte yandan, rezerv hareketsiz kök hücreleri, B hücre spesifik, Moloney kemirgen lösemi virüsü entegrasyon Bölge 1 (Bmi1) 6 fare telomeraz ters transkriptaz (mTert) 7 ile etiketlenir, HOP Homeobox (Hopx) 8 doublekortin-mi CAM Kinaz benzeri 1 (Dclk1) 9, ve lösin -Cys ve immünoglobülin benzeri sahalar 1 (Lrig1) 10. etkin bir şekilde çoğalan kök hücreler daha sonra emme hücreleri (enterositler) ve salgılayıcı hücreler (enteroendokrin, kadeh, Paneth ve Elyaf hücreleri) içine daha fazla farklılaşma tabi ta hücrelere yol açar. onlar apoptoz geçmesi ve olan villus, üst ulaşana kadar proliferatif bölgede sürekli hücre bölünmesi crypt-villus ekseni boyunca epitel hücrelerinin yukarı doğru hareketi ile sonuçlanırepitelyum yüzeyinden dökülür. Intestinal epitelyal hücrelerin farklı (örneğin, barsak goblet hücrelerinin lizozim karşı antikorla bir MUC2 ve Paneth hücrelerine karşı bir antikorla boyama ile tanınabilir) farklı proteinlerin ekspresyonu ile işaretlenir. Biz bağırsak epiteli 11-13 homeostazında ve patobiyolojisinde Kruppel benzeri faktörler (KLFs) rolünü incelemek. Değiştirilmiş Swiss-haddeleme tekniğinin fizibilitesini destekleyici Burada sunulan sonuçlar etkin bir şekilde çoğalan bağırsak epitel kök hücrelerin 14 bakımında Kruppel benzeri faktör rolü 5 (KLF5) önceki çalışmalara dayanmaktadır. KLF5 yüksek ölçüde aktif, bağırsak kök ve ta hücreleri 12 olarak ifade edilen bir çinko parmak kopyalama faktörüdür. Daha önceki çalışmalar, KLF5 Ki-67, bağırsak kript bilinen bir proliferatif işaretleyici ile birlikte ifade olduğunu göstermiştir.

gastrointestinal tr hareket bir yapısal veya işlevsel homojen bir doku değildir. ince barsak proksimal, orta ve distal parçaya bölünmüş ikinci, bundan başka, duodenum, jejunum ve ileum ve çekum ve kolon içine kalın bağırsak ayrılmıştır. Bu bölümlerin her biri kendine özgü histolojik özellikleri vardır ve farklı roller 15 oynar. Bu nedenle, hakaret etkileri ve bağırsak epiteli tepkisinin derecesi çalışılan dokuda 16 bölgeye bağlı olabilir. Buna ek olarak, farklı fare suşları, çalışmalarda 16 kullanılan hasara türüne göre histolojik düzeyde yanıt çeşitliliği gösterir. Bu durumda, dokunun hazırlama yakışır uygun histolojik ve bağırsak dokuları moleküler analizi izin vermek için gereklidir. Bu nedenle, İsviçre rulo tekniği hibe tek seferde bağırsak epiteli tam uzunlukta analizi ve böylece kapsamlı bilgilere dayanarak bilgili sonuçlar tespit eder.

e_content "> Swiss-haddeleme tekniği ilk Magnus 17 tarafından belirtildiği ve Moolenbeck ve RUITENBERG and Park ve arkadaşları tarafından ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. dokuların hazırlanması ve histolojik gerçekleştirmek için bir yöntem olup, kemirgen bağırsak 18,19 sırasıyla. protokolü analizleri olarak tanılama amacıyla zamanında ve güvenilir doku hazırlanması için izin orjinal yöntemin geliştirilmiş bir versiyonu, bu yayında sunulur tarif. Bu modifiye edilmiş tekniğin etkin koleksiyonları ve immünohistokimya, immünofloresans, hem de evrensel kullanılan teknikler, intestinal epitel hazırlanmasını sağlar ek değerlendirme (floresan ve kromojenik 20), in situ hibridizasyon gibi. Ayrıca, Hazırlama yöntemi örneği değiştirilmiş doku hızlı doku fiksasyon bir yöntem sunan hazır ve nispeten ucuz reaktifler kullanır ve protein, DNA elde sağlar ve RNA. Alınan birlikte, this tekniği bağırsak epiteli, histopatolojik patolojik ve moleküler özelliklerinin kapsamlı değerlendirme için mükemmeldir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fare

  1. fareler içeren tüm çalışmalar Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Fareler 12:12 saat ışık-karanlık döngüsünde tutulmuştur.
    1. Ticari olarak C57BL / 6 fareleri elde edin. LoxP siteleri tarafından çevrili Klf5 allelleri (Klf5 f l / f l) taşıyan C57BL / 6 fareler elde edin. Bu fareler, daha önce 21 tarif nazikçe Dr. Ryozo Nagai tarafından temin edildi.
  2. Lgr5 organizatörü (Lgr5 EGFP / CreERT2 fareler) düzenlemesi altında indüklenebilir Cre rekombinaz geni taşıyan C57BL / 6 fareler satın alın.
  3. Lgr5 EGFP / CreER T2 / Klf5 f l / f l fareler kurmak, çapraz Klf5 fl / f Lgr5 EGFP / CreER T2 fareler ve daha sonra Klf5 fl / f l döl geri-melez l fareler fareler.
  4. Protokole göre tamoksifen ile muamele fareler daha önce 22 nitelendirdi. Birbirini takip eden 5 gün süre ile, steril bir mısır yağı içinde çözülmüş tamoksifen 1 mg (10 mg / ml), 8 haftalık bir deney ve kontrol fareleri intraperitonal (İP) enjekte edilir.
  5. İlk tamoksifen enjeksiyondan sonra 14. günde, 2. gaz kaynağı CO bağlı bir bölme yerleştirerek CO2 boğulmaya kullanılarak fareler kurban. fareler bilinçsiz ve tüm hareketleri sona erene kadar gaz odasına akmasına izin verin. ötanazi servikal dislokasyon gerçekleştirmek sağlamak.

2. Doku Hazırlama ve İsviçre Rolling

  1. diseksiyon forseps ve makas kullanılarak, karın tarafı deride bir kesi kesti. forseps bir çift ile, kesi cildi tutun ve yavaşça karın kas dokusundan çekin. karın kasları, karın cildi kesip maruz bir makas kullanın.
  2. Tutun ve pe yukarı çekinforseps ile ritoneum. tutan ve bağırsakların çekerek olmamak emin olun. Dikkatle periton dokusunda bir kesi yapmak ve karın kasları ortaya çıkarmak için cildi kesilip devam ediyor. Dikkatle karın kaslarının bir kesi yapmak ve bağırsakları maruz onları uzak kesme devam ediyor.
  3. kolon tanımlamak ve rektum / anüs katıldı uzak ucuna iz. bir makas ile, mümkün olduğu anal açıklık yakın olarak kesilir.
  4. mide tanımlamak ve ince bağırsak ile birleştiği yerde iz. bir makas ile yaklaşık 1 cm uzakta mideden bağırsak özgür kesmek. fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden temiz Petri kabı serbest ince bağırsak ve kolon tüm uzunluğu aktarın.
  5. Bir yandan ya da forseps bir çift ile, kolon distal ucunu tutun ve yavaşça herhangi mezenterik bağ ve / veya yağ dokusundan kolonun tüm uzunluğu çözülmeye diğer elinizi kullanın.
  6. çekum tanımlamak(Küçük ince ve kalın bağırsak arasındaki kese) ve çekum ve kolon kolon serbest (kolon proksimal ucunu) katılmak nerede kesti.
  7. Bir yandan ya da forseps bir çift, küçük bağırsak tutun ve yavaşça herhangi mezenterik bağ ve / veya yağ dokusundan ince bağırsağın tüm uzunluğu çözülmeye diğer elinizi kullanın. çekum kesip ve bunun için gerek varsa atın.
    Bir gecede süreç (dH 2 O% 50 etanol /% 5 asetik asit) modifiye Bouin fiksatif dışarı disseke bağırsak kuluçkaya burada durdurulabilir ve ertesi gün prosedürü devam Not:.
  8. bağırsak (ince bağırsak ya da kolon) bir kesimi Taşıma, modifiye Bouin fiksatif ile 10 ml şırınga doldurmak ve bunun için bir sonda iğne takılır. barsak segmentinin ön açılışında yarım santimetre hakkında iğne takın.
  9. Bir alet ile firma basınç uygulayarak bağırsak segmenti içinde gavaj iğne tutunbarsak segmenti üzerinde. Öte yandan şırınga tutarken, modifiye Bouin fiksatif kullanarak barsak segmentinin içeriğini temizlemek için yumuşak ama tutarlı baskı uygulayın. Bu adım bağırsak segmenti ve hemen tespitin eşzamanlı temizlenmesini sağlar. akış atıkları toplamak için bir Petri kabı kullanın. Tespit opak çevirerek kolon renk ile görülebilir.
    Not: ateş basması ya da bağırsak segmenti açık patlama olabilir sırasında çok fazla baskı uygulamak için değil emin olun.
  10. makas kullanarak, mezenterik hat boyunca uzunlamasına bağırsak segmenti açmak kesti. forseps bir çift ile tutun ve PBS içeren bir Petri kabındaki kısaca durulayın.
    1. proksimal, orta ve distal: 3 eşit parça halinde ince bağırsak kesti. proksimal parça mide hemen sonra biridir ve distal segmenti kolon hemen önce bir tanesidir. proksimal segmenti için duodenum, jejunum orta ve distale eşdeğerdirileum.
    2. Her segment için proksimal ve distal ucunu işaretleyin. Proksimal uç başlangıçta mide doğru işaret ediyordu biri ve kolon işaret etti uzak olduğunu.
  11. temizlenmeli ve açılan bağırsak segmenti yerleştirmek için Petri kabı üst kullanın. lümen tarafı yukarı bakacak şekilde bağırsak segmenti yerleştirin.
    1. kolon, genişliği boyunca çalışan variegations / sırtlar lümen yan belirlemek ve yakın ucunda yer almaktadır. orta ve distal bölgelerde uzunlamasına çalışan bazı variegations var. ince bağırsak için, villuslar işaretleri kaba görünen yüzeyi ile luminal yan tespit.
      Not: ince bağırsak için, proksimal, orta ve distal bölgelerde harici makroskopik anatomik sınır vardır. Bununla birlikte, bu bölgeler mikroskop altında bölümlerde tanımlanan de bağlanabilir. Nerede olduklarını villus distalde giderek daha kısa proksimal bölgede uzun ve olmakuzunluğunda kısa. Mikroskopik olarak, kolon kriptler da, sırtlar varlığı ile tespit edilebilir yakın bölgede kısa bulunmaktadır. Kolon kriptler henüz yakın bölgede hala daha uzun uzak bölgede Midsection en yüksek ve daha kısadır.
  12. İsviçreli kolon haddeleme devam edin:
    1. düz açık kolon tutmak ve Petri kabı kenarına doğru proksimal ucundan forseps ile çekin.
    2. yukarı bakacak şekilde lümen tarafını tutmak ve tek elle forseps ile proksimal ucunu tutun ve diğer elinizle bir kürdan tutun.
    3. forseps kullanarak kürdan etrafında ucunun kenarı sarın ve hafifçe yerinde tutmak için kürdan karşı sarılmış kenar çimdik.
    4. Ve yavaşça bir İsviçreli rulo oluşturacak şekilde kürdan etrafında kolon rulo parmaklarıyla kürdan haddeleme başlar.
    5. Tüm kolon uzunluğu sıvadı edildikten sonra, dikkatlice c slayt forseps bir çift kullanınkürdan kapalı ve bir doku işleme / katıştırma kasete Olon İsviçre rulo. gece boyunca oda sıcaklığında% 10 tamponlu formalin içine kaseti yerleştirin.
  13. İsviçre ince bağırsak haddeleme devam edin:
    1. Bir seferde bir kesimi Taşıma, luminal kenarında düz açık segmenti tutmak ve Petri kabı kenarına doğru proksimal ucundan forseps ile çekin.
    2. kolon için anlatıldığı gibi İsviçre haddeleme ile devam edin.
  14. parafine için formalin ile fikse dokular işleme devam edin. Aşağıdaki adımları takip edin:
    NOT: (detaylar için malzeme ve ekipmanlar görelim) otomatik işlemcisi kullanın.
    1. Doku kasetinde iken sabitleştirici tamamen kaldırılması, PBS ile doku yıkayın.
    2. Aşağıdaki sırayla etanol kullanılarak doku kurutmak:% 50 etanol, 10 dakika,% 70 etanol 10 dakikada,% 80 etanol için 10 dakika, 10 dakika süre ile,% 95 etanol, 10 dakika boyunca% 100 etanol,% 100 etanol 10 dakika boyunca ve 110 dakika boyunca% 00 etanol.
    3. aşağıdaki sırayla ksilen Exchange etanol: 2: 1 etanol: 10 xylene - 15 dakikada, 1: 1 etanol: 10 xylene - 15 dakikada, 1: 2 etanol: 10 xylene - 10 15 dakika,% 100 iksilen - 15 dakika, 10% 100 iksilen - 15 dakika, 10% 100 iksilen - 15 dakika. DİKKAT: Ksilen böylece işyeri uygun bir başlık ve personel tarafından giydi gereken uygun koruyucu ekipman ile bir lokal egzoz havalandırması ile donatılmış olmalıdır bir sağlık tehlikesi vardır.
    4. parafin Exchange ksilen. 2: 1: ksilen: 30 dakika için parafin, 1: 1 ksilen: 30 dakika için parafin, 1: 2 ksilen: 30 dakika için parafin,% 100 parafin 58 ° C - Fırın 54 bir vakum, aşağıdaki adımları 1 - 2 saat ve 1% 100 parafin - 2 saat veya gece.
      Not: Bu parafin polimerler aşağılamak ve sert ve kırılgan hale getirecek, çünkü parafin uzun süre için 60 ° C'yi izin vermeyin.
    5. de taze yeni parafin ve şark dokusunda gömparafin sertleşir önce sired. İsviçre rulo, doku paraffinization ardından, parafine sırasında yana her rulo yeniden konumlandırmak için önemlidir. Bu kesme işlemi sırasında, her bir rulonun tüm uzunluğu bölümleri imal edilmesini sağlar.
  15. boyama için, mikrotom kullanılarak 5-mikron kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. ; Yüklü slaytlar üzerinde bölümleri toplayın ve fırın gecede 65 ° C onları (fırında) kurutmak oda sıcaklığına soğutun ve daha sonra boyama için onları kullanmış olsun.
    Not: pişirme süresi 1 kısaltılmış olabilir - slaytlar nasıl taze kesilmiş bağlı 2 saat. kesit beri bir aydan daha az ise, o zaman bir gecede pişirmek için tavsiye edilir. Bir aydan fazla olmuş, o zaman 1 - pişirme 2 saat zaman kazanmak için yeterlidir. Zaman tükeniyor ise, gecede destek her zaman kullanılabilir.

3. Histolojik Analiz ve Immunoflorasan Boyama

Histolojik analiz ve immunoflu gerçekleştirmeorescence boyama daha önce modifikasyonlarla, 23,24 tarif. gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) immünofloresan için:

  1. 1 saat boyunca 65 ° C fırın içinde slaytlar fırında endojen alkali fosfataz etkinliğini aktif hale getirmesi ve daha sonra ksilen deparaffinize.
  2. endogen dokunun peroksidazlar engellemek için, metanol içinde% 3 hidrojen peroksit banyosunda bölümleri inkübe; daha sonra 10 dakika boyunca 125 ° C 'de sitrat tampon çözeltisi içinde, antijen alma ve ardından azalan alkol banyosu serisi (% 100,% 95,% 70) içinde inkübe edilerek, (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Tween-20, pH 6.0) rehidrate bir decloaking odacığı kullanılarak.
  3. hidrofobik bariyer sağlar kalem işareti kullanılarak doku bölümleri etrafında bir daire çizin ve (EGFP karşı birincil antikor ile daha sonra seyreltme 1 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca (TBS-Tween içinde% 2.5 büyükbaş hayvan serum albümini [BSA]) bloklama tamponu ile bölümleri inkübe : gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de 500) hafifçe çalkalandı.
  4. bölümleri yıkayın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca uygun bir konsantrasyonda flüoresan etiketli ikincil antikor ile inkübe edin.
  5. Hoechst ile sekonder antikor tedavisi ve leke çekirdekleri sonra slaytlar yıkayın ve montaj medya ile monte edin.
    1. Klf5 / EGFP / Ki-67 eş-boyama için, işlem slaytlar adımları 3.1 de tarif edildiği gibi - 3.3 ve Klf5 antikor (seyreltme 1: 150) ile inkübe edilerek Klf5 boyama yerine gece boyunca karıştırılmıştır.
    2. protokole göre slaytlar tavşan AP polimer algılama uygulayın.
    3. Klf4 üreticinin protokol başına kadar kromojen immünohistokimyasal boyama ile boyanarak ortaya koymaktadır.
    4. Daha önce tarif edilen protokol 25 kullanılarak antikor elüsyon gerçekleştirin. Glisin-SDS içinde 50 ° C'de (pH 2.0), 1 saat boyunca çalkalama ile çözüme slaytlar inkübe edin.
    5. Yıkama damıtılmış su ile iyice kayar ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca (TBS-Tween içinde% 2.5 BSA) tampon engelleme inkübe edin.
    6. Ki-67 ekleyin (seyreltme 1: 500) ve EGFP (seyreltme 01:500) eş zamanlı olarak antikor ve 1 saat 37 ° C'de inkübe edin.
    7. (Veriler gösterilmemiştir) Hoechst ile boyamadan önce uygun bir sekonder antikor ile flüoresan tespiti gerçekleştirmek ve yerleştirme ortamı ile monte edilir.
  6. Hematoksilen ve eozin (H & E) 26 5-mikron bölümleri boyanarak üzerine dokuların histolojik morfolojisini gözlemleyin. Floresan görüntüler için, sırası ile, EGFP, Klf5, Ki-67 renklendirme görselleştirmek için 535, 646 ve 700 emisyon dalga boylarını kullanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

immünohistokimyasal boyama ile birlikte İsviçreli haddeleme tekniği küçük veya büyük bağırsak dokusunun kapsamlı bir analiz sağlar. Bir C57BL / 6 fare (Şekil 1) bir kalın barsak H & E boyama örnek fizibilite bir tasviridir ve bu tekniğin etkinliğidir. Proksimal, orta ve distal: Şekil 1 'de gösterildiği gibi, görüntü kolon tüm bölümlerini yakalamak edebilmektedir. Bu nedenle, bu kapsamlı bir histolojik değerlendirmesi için olanak sağlar. İsviçreli had...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İsviçre haddeleme tekniği büyük ölçüde, histolojik ve morfolojik değerlendirmesi için bağırsak doku hazırlanması için güçlü bir yöntemdir. Ilk dondurulmuş bölümleri 18,19 hazırlanması için geliştirilmiş daha önce tarif edilen Swiss-haddeleme tekniği, aksine, burada sunulan prosedür formalinle tespit ve parafine (FFPE) istemi bağırsak doku hazırlanması ve tespit sağlar. Dondurulmuş doku ile karşılaştırıldığında, FFPE dokusu çok daha uzun bir raf ömrüne sahiptir ve bu nedenle daha iyi bir doku bütünlüğü histolo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ainara Ruiz de Sabando'ya H&E görüntüleri sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Dr. Vincent W. Yang'a verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (DK052230, DK093680 ve CA172113) hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Paslanmaz Çelik Diseksiyon KitleriVWR25640-002
Boşaltma OdasıBiocare MedicalDC2012
Şırınga 10 mlVWR89215-218
Kapaklı Swingsette Doku gömme/işleme kasetiSimportM515
Superfrost Plus Slaytlar [boyut: 25 x 75 x 1 mm]VWR48311-703
Manuel Slayt Boyama SetiTissue-Tek/Sakura4451
Boyama Kabı YeşilDoku-Tek/Sakura4456
Boyama Kabı BeyazMendil-Tek/Sakura4457
Çıkarılabilir Saplı 24 Sürgülü Sürgü TutucuTissue-Tek/Sakura4465
FırınThermo Scientific624365 derecede slaytları pişirmek için
Diseksiyon mikroskobuZeissStemi 2000C
Floresan MikroskobuNikonEclipse 90iParlak ve akıcı ışık, objektiflerle: 10X, 20X
PAP Kalem Süper Sıvı Engelleyici MiniFisher ScientificDAI-PAP-SM
Etanol 200 geçirmezAAPR111000200
MetanolVWRBDH1135-4LP
Buzlu asetik asitAAPR281000ACS
KsilenFisher ScientificX5P-1GAL
Hidrojen peroksit suda %25 çözeltiACROS202465000
%10 bufered formalinFisher Scientific22-026-213
Sığır serum fraksiyonu V, ısı şokuRoche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
Sodyum sitratFisher ScientificS279
Gavaj iğnesiVWR20068-624
Tavşan anti Klf5 antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-22797Seyreltme 1:150
Tavuk anti EGFP antikoruMilliporeAB16901Seyreltme 1:500
Tavşan anti Ki67 antikoruBiocare MedicalCRM325BSeyreltme 1:500
Mach3 tavşan AP polimer tespit kitiBiocare MedicalM3R533L
Çözgü kırmızı kromojen kitiBiocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 fareler Jackson labs008875 
Otomatik işlemciLeicaLeica TP1020

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
  3. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  4. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  5. van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
  6. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
  7. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
  8. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  9. May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
  10. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  11. Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
  12. McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
  13. McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
  14. Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
  15. Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
  16. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
  17. Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
  18. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  19. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
  20. Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
  21. Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
  22. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  23. McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
  24. Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
  25. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
  26. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm nohistokimyasal Analizmm nofloresan AnalizModifiye Bouin Fiksat rFare Ba rsak DokusuHistolojik BoyamaParafin G m l BloklarDoku leme KasetiFloresan Deteksiyon Y ntemleri

İlgili makaleler