Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
, Makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) patojenlere karşı savunmada temel bir rol oynar doku ve lemfoid organlarda bulunan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, bu nedenle, in vitro modeller geliştirilmiştir, detaylı bir şekilde ele alınması için yeterli sayıda izole edilmesi zordur., Kemik iliği türevli makrofajlar ve dendritik hücrelerin in vitro kültürler immünolojik çalışmalar için köklü ve değerli yöntemlerdir. Burada, kültür ve sitokin granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) kullanılarak primer, fare kemik iliği hücrelerinin tek bir kültür DH'lerin ve makrofajlar hem belirlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol ilk olarak Lutz ve arkadaşları tarafından geliştirilen kurulan prosedüre dayanmaktadır. Kemik iliği kaynaklı DC'ler için 1999 yılında. kültür heterojen ve MHC II ve floresanlı hyaluronan (FL-HA) ergin ve DC'lerden makrofajlar ayırt etmek için kullanılır. Bu, GM-CSF türetilmiş makrofajlar proyakından fenotip ve işlevsel olarak alveoler makrofajları andıran, in vitro türetilmiş makrofaj uygun bir kaynak vide.
Çeşitli in vitro kültür yöntemleri, kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar (BMDMs) ve bir veya büyüme faktörlerinin bir kombinasyonu kullanılarak, kemik iliğinden türetilmiş, DCS (BMDCs) oluşturmak üzere tarif edilmiştir. BMDMs makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) veya GM-CSF 1,2 kullanarak kemik iliği hücrelerinin kültürlenmesi ile elde edilebilir. BMDCs, kemik iliği kültür FLT3 ligandı eklenmesi (B220 +, sırasıyla CD11c / yüksek MHC II, yüksek ve CD11c LO) kültür 3,4 9 gün sonra yapışmayan klasik ve plazmasitoid DC yol açar. Bunun aksine, yapışmayan hücreleri tek başına GM-CSF 5,6 ile kültür içinde 7 ila 10 gün sonra üretilen GM-CSF ve IL-4 ile 7 ya da GM-CSF ve FLT3 ligandı 8,9 BMDCs daha yakından enflamatuar DCler benzeyen oluşturmak (CD11c yüksek, MHC II yüksek CD11b +) 10. Bu in vitro kültür makrofajlar oluşturmak için kullanılan birlikte veyaHer kültürün saf popülasyonları yol verirse DC'ler, belli değildir. Örneğin GM-CSF kültürlerde yapışan hücreler de homojen ve herhangi bir gözlenen değişkenliği olan varsayıma sahip makrofajlar 5, DCler 6,11-13 olarak kullanılan aynı kültürden yapışmayan hücreler, olduğu tarif edilmektedir, ancak nedeniyle gelişme 14,15 farklı aşamalarına. Ayrıca, araştırmalar in vivo 16,17 alveoler makrofaj gelişimi için önemli bir büyüme faktörü olarak GM-CSF bulduk ve alveolar makrofajlar gibi 16,17,18 oluşturmak için in vitro olarak kullanılabilir.
yapışma dışında, GM-CSF ile tedavi, kemik iliği kültürleri makrofajlar ve DCS üretilmesi için işlemler, GM-CSF, kemik iliği kültürleri içinde mevcut olabilir heterojen öne çok benzerdir. Bu gerçekten iki kağıtları BMDC kültürlerin yapışmaz fraksiyonunda BMDMs varlığını rapor olarak durum gibi görünüyor. bir yazıda, bunlar identifiEd en yakın makrofajların andıran ve T hücrelerini 19 aktif hale getirmek için daha düşük bir yeteneğine sahip bir gen sentezleme imza ifade CD11c +, CD11b +, MHC II orta, MerTK + ve CD115 + gibi bir hücre popülasyonu. MHC II ve FL-HA kullanılan ikinci kağıt bir alveoler makrofaj benzeri nüfusu tanımlamak için (CD11c +, MHC II orta / düşük, FL-HA yüksek) olgunlaşmamış farklı oldu (CD11c +, MHC II orta, FL-HA düşük) ve olgun DC'ler (CD11c +, MHC II yüksek), hem fenotipik ve fonksiyonel 18. Bu kağıtlar hem makrofaj ve BMDC kültürlerden gelen verileri yorumlanırken alınması gerektiğini bakım belirten DC popülasyonları ikisini de içeren, GM-CSF BMDC kültürleri heterojen olduğunu göstermektedir.
Bu protokol kemik iliği, GM-CSF kültür kemik iliği hücreleri izole ve alveol makrofaj benzeri nasıl belirleneceği açıklanırbağlayıcı ve MHC II ifadesi FL-HA kullanılarak flow sitometri ile kemik iliği kültürü olgunlaşmamış ve olgun DCler nüfus. . Bu prosedür, Lutz et al 6 kurulan prosedüre göre ve 5 üretebilir – bir 10 mi kültür 7. günde 10 x 10 6 yıkanarak yapışmayan hücreler. Kültür gün ile 7 10 kullanışlı ve 7 gün Bu büyüme ve büyük miktarlarda in vitro alveoler makrofajlar gibi izole etmek için basit bir yöntem sağlar, makrofajlar, olgun olmayan ve olgun DClerin, yanı sıra, bazı soylarının heterojen bir popülasyonu verir.
Bu yazıda, Lutz ve ark., 6 uyarlanmış olan bir tek bir fare kemik iliği kültürü GM-CSF türetilmiş makrofajlar ve DCS üretilmesi için bir yöntem sağlar. Bu kültürde olgunlaşmamış DC'lere ve makrofajlar olarak ayrılır bağlayıcı MHC II ifadesi ve FL-HA, daha önce zor olmuştur (Şekil 3C). Bu arada helft ve ark., 19 başka rapor ile, daha önce sadece DC'ler olduğu düşünülen GM-CSF kaynaklı BMDC kültürlerin içinde heterojenite…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) (Hibe MOP-119503) ve Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Konseyi (NSERC) Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. NSERC ayrıca YD yaz studentships desteklenen ve AA YD 4 yıllık dostluk ödülü British Columbia Üniversitesi (UBC) tarafından desteklenen, AA lisans öğrencisi yüksek lisans ödülü (CGS-M) ile CIHR tarafından desteklenmektedir. Biz Şekil 2'de görüntüler oluşturmak için kullanılan mikroskop ile yardım için Calvin Roskelley teşekkür ederiz. Biz de UBC Hayvan ve Sitometrisi Tesisleri destek kabul.
Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
Hemocytometer | Richert | 1490 | |
Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |