Yöntem makalesi

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

17.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54194

⸱

25 Haziran 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Immunology, University of British Columbia

Bu makalede

Özet

Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile kültürlenen kemik iliği hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) içeren heterojen bir kültür oluşturur. Bu yöntem, makrofajları GM-CSF kültüründeki DC'lerden ayırt etmek için MHCII ve hyaluronan (HA) bağlanmasının kullanılmasını vurgular. Bu kültürdeki makrofajlar, alveolar makrofajlarla birçok benzerliğe sahiptir.

Özet

, Makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) patojenlere karşı savunmada temel bir rol oynar doku ve lemfoid organlarda bulunan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, bu nedenle, in vitro modeller geliştirilmiştir, detaylı bir şekilde ele alınması için yeterli sayıda izole edilmesi zordur., Kemik iliği türevli makrofajlar ve dendritik hücrelerin in vitro kültürler immünolojik çalışmalar için köklü ve değerli yöntemlerdir. Burada, kültür ve sitokin granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) kullanılarak primer, fare kemik iliği hücrelerinin tek bir kültür DH'lerin ve makrofajlar hem belirlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol ilk olarak Lutz ve arkadaşları tarafından geliştirilen kurulan prosedüre dayanmaktadır. Kemik iliği kaynaklı DC'ler için 1999 yılında. kültür heterojen ve MHC II ve floresanlı hyaluronan (FL-HA) ergin ve DC'lerden makrofajlar ayırt etmek için kullanılır. Bu, GM-CSF türetilmiş makrofajlar proyakından fenotip ve işlevsel olarak alveoler makrofajları andıran, in vitro türetilmiş makrofaj uygun bir kaynak vide.

Giriş

Çeşitli in vitro kültür yöntemleri, kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar (BMDMs) ve bir veya büyüme faktörlerinin bir kombinasyonu kullanılarak, kemik iliğinden türetilmiş, DCS (BMDCs) oluşturmak üzere tarif edilmiştir. BMDMs makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) veya GM-CSF 1,2 kullanarak kemik iliği hücrelerinin kültürlenmesi ile elde edilebilir. BMDCs, kemik iliği kültür FLT3 ligandı eklenmesi (B220 +, sırasıyla CD11c / yüksek MHC II, yüksek ve CD11c LO) kültür 3,4 9 gün sonra yapışmayan klasik ve plazmasitoid DC yol açar. Bunun aksine, yapışmayan hücreleri tek başına GM-CSF 5,6 ile kültür içinde 7 ila 10 gün sonra üretilen GM-CSF ve IL-4 ile 7 ya da GM-CSF ve FLT3 ligandı 8,9 BMDCs daha yakından enflamatuar DCler benzeyen oluşturmak (CD11c yüksek, MHC II yüksek CD11b +) 10. Bu in vitro kültür makrofajlar oluşturmak için kullanılan birlikte veyaHer kültürün saf popülasyonları yol verirse DC'ler, belli değildir. Örneğin GM-CSF kültürlerde yapışan hücreler de homojen ve herhangi bir gözlenen değişkenliği olan varsayıma sahip makrofajlar 5, DCler 6,11-13 olarak kullanılan aynı kültürden yapışmayan hücreler, olduğu tarif edilmektedir, ancak nedeniyle gelişme 14,15 farklı aşamalarına. Ayrıca, araştırmalar in vivo 16,17 alveoler makrofaj gelişimi için önemli bir büyüme faktörü olarak GM-CSF bulduk ve alveolar makrofajlar gibi 16,17,18 oluşturmak için in vitro olarak kullanılabilir.

yapışma dışında, GM-CSF ile tedavi, kemik iliği kültürleri makrofajlar ve DCS üretilmesi için işlemler, GM-CSF, kemik iliği kültürleri içinde mevcut olabilir heterojen öne çok benzerdir. Bu gerçekten iki kağıtları BMDC kültürlerin yapışmaz fraksiyonunda BMDMs varlığını rapor olarak durum gibi görünüyor. bir yazıda, bunlar identifiEd en yakın makrofajların andıran ve T hücrelerini 19 aktif hale getirmek için daha düşük bir yeteneğine sahip bir gen sentezleme imza ifade CD11c +, CD11b +, MHC II orta, MerTK + ve CD115 + gibi bir hücre popülasyonu. MHC II ve FL-HA kullanılan ikinci kağıt bir alveoler makrofaj benzeri nüfusu tanımlamak için (CD11c +, MHC II orta / düşük, FL-HA yüksek) olgunlaşmamış farklı oldu (CD11c +, MHC II orta, FL-HA düşük) ve olgun DC'ler (CD11c +, MHC II yüksek), hem fenotipik ve fonksiyonel 18. Bu kağıtlar hem makrofaj ve BMDC kültürlerden gelen verileri yorumlanırken alınması gerektiğini bakım belirten DC popülasyonları ikisini de içeren, GM-CSF BMDC kültürleri heterojen olduğunu göstermektedir.

Bu protokol kemik iliği, GM-CSF kültür kemik iliği hücreleri izole ve alveol makrofaj benzeri nasıl belirleneceği açıklanırbağlayıcı ve MHC II ifadesi FL-HA kullanılarak flow sitometri ile kemik iliği kültürü olgunlaşmamış ve olgun DCler nüfus. . Bu prosedür, Lutz et al 6 kurulan prosedüre göre ve 5 üretebilir - bir 10 mi kültür 7. günde 10 x 10 6 yıkanarak yapışmayan hücreler. Kültür gün ile 7 10 kullanışlı ve 7 gün Bu büyüme ve büyük miktarlarda in vitro alveoler makrofajlar gibi izole etmek için basit bir yöntem sağlar, makrofajlar, olgun olmayan ve olgun DClerin, yanı sıra, bazı soylarının heterojen bir popülasyonu verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Fareler British Columbia Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre etik hayvan araştırmaları için Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi uyarınca ötenazi edildi.

1. Fare Femur ve Tibia bir Tek Hücre Kemik iliği Süspansiyon Kazanılması

  1. biyolojik güvenlik kabini (BSC)% 70 etanol ile, daha sonra temiz / sprey BSC yüzeyi kabine havayı temizlemek ve hava akış stabilizasyonu için izin prosedürü başlatmak için önce 15 dakika çalıştırınız. protokol bütünlüğü için mümkün olduğunca steril her şeyi tutmak. steril olmayan koşullarda kemikleri kesmeyin.
  2. % 70 etanol içinde ıslatarak diseksiyon araçları hazırlanması,% 5 fetal dana serumu (HBSS-FCS), steril bir Petri kutularına (100 mm x 15 mm), 1 Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (diseksiyon makas forseps 2 çift 1 çift) BSC ml şırıngalar, 26½ gauge iğne konik toplama tüpleri (15 ml veya 50 mi), ve kağıt havlu.
  3. kullanarak fare EuthanizeKurumun hayvan araştırma etik kurulu tarafından onaylandı protokolleri. BSC getirmek bir ya da iki kağıt havlu üstüne yerleştirin ve% 70 etanol ile fare püskürtün.
  4. Kapağın 2 ml - BSC, kısım, tabana HBSS-FCS ve 10 mL 1 steril bir Petri kabı aseptik açın.
  5. yukarı bakacak şekilde arka ile karnına fare yerleştirin ve non-dominant elin parmakları ile göğüs bölümleri çevresindeki deri kaldırın. cilt kaldırıldığı bir kesi yapmak için makas kullanın.
  6. mide de kesi buluştuğu iki bitene kadar çekerek devam mide arkasından fare çevresindeki deri dışında çekin dikkatle kesilmiş iki ucunda, her el ile bir ucuna üzerinde tutmak ve.
  7. yukarı bakacak şekilde mide fareyi Flip ve tek elle aşağı bacak doğru cilt alt yarısını çekme bacaklar maruz kadar deriyi geri çekerek tutun.
  8. Fare up ayak tutun ve ayak bileği ekleminin üzerinde Aşil tendon kesilmiş vekasları bağlantı ligament makas ile tibia alt ucunda ayak. Bu bacak kemiklerinden ayak gevşetir.
  9. yürüyerek bacak tutarken, alt bacak uyluk kaslarını koparmaya femur alt ucunda tüm diz eklem çevresindeki makasla kasları ve bağları kesti. nazikçe fibular ve femoral yüzeylerden gevşetti kasları çekmek için forseps kullanabilir. ağır kanamaya önlemek için femoral arter koparmaya dikkat edin.
  10. Bir yandan ayak üzerinde tutan, kalça ekleminin femur üst ucunda bastırın açık makas, bacak döndürmek ve ücretsiz nihai kesim yapmak için makas kullanırken kalça ekleminden femur ayırmak için nazikçe çekin vücuttan bacak.
  11. Bu noktadan itibaren, sadece steril forseps ile doku tutun. bir ucunda bacak üzerinde tutmak ve diğer ayak çekin.
    NOT: bağlantı ligament adımda kesilir gibi bu kadar kuvvet gerektirmeyecektir1.9. Alternatif olarak, sadece kemik kaynaşmıştır ayak bileği üzerinde tibia kesti.
  12. bir forseps seti ve birbirleri ile tibia ve fibula proksimal ucu femur distal sonuna kadar bacak tutun, dikkatle femur ve patella onları ayırmak için diz ekleminin ters yönde tibia ve fibula bükün.
  13. hala alt bacak kemikleri bağlı kalan ligament ve kasların aşağı çekmek için forseps kullanabilir. kemik iliği hücreleri için temizlenip için çok küçük olarak burada, forseps ile bağ dokuları ile birlikte fibula çıkarın. ters Petri kabı kapağı temizlenmiş tibia yerleştirin.
  14. bir forseps seti ve birbirleri ile patella ile femur alt ucunu tutun kaldırılması için eklemin ters yönde Patellayı ve çevre dokulara bükün. Sonra femur gelen bağ dokuları kalan kapalı temiz; forseps ile onları uzağa çekerek ve ters Petri kabı kapağı üzerine yerleştirin. patellayı atın.
  15. 1.7 tekrarlayın- Diğer bacak ile 1.13 gerekirse. Gerekirse ulaşım için 1 ml steril HBSS-FCS içeren 1.6 ml mikrosantrifüj tüplerine kemikleri aktarın.
  16. 1 ile ters Petri kabı kapağı kemikleri yerleştirin - HBSS-FCS 2 ml hala tibia ve femur bağlı herhangi bir kalıntı doku temizlemek için forseps kullanabilir, daha sonra HBSS- 10 ml içeren Petri kabı tabanına kemikleri aktarmak FCS. Alternatif olarak, kemikleri temizlemek ve% 70 etanol batırılmış doku kullanılarak ekli kas doku kaldırmak.
  17. makasla ikiye kemiklerin her kesin. kemikler çanak kalmak sağlamak için keserken Kısmen steril kapaklı Petri kabı kalkan. Seçenek olarak ise, bir sonraki aşamada yıkama izin vermek için her bir kemik ucu kesin.
  18. 1 ml şırınga üzerine 26½ G iğne takın ve Petri kabı, 1 ml HBSS-FCS hazırlar. Bir kemik parçasının ucuna iğne ucu yerleştirin ve kemik iliği hücreleri (kemiklerin içindeki yumuşak kırmızı doku) dışarı floş. kafasının içine iğne takınkemik ve açık ucun, tüm kırmızı renkli ilik kaldırılıncaya kadar. renk beyaz olarak kemikleri gözlemleyin.
  19. tek bir hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere şırınga ile bir kaç kez kemik iliği görünür bir kümeleri geçirin.
  20. kızarmış kemikleri atın. iyi hücre süspansiyonu karıştırın ve toplama tüpüne transfer etmek için 10 ml pipet kullanın. çanak artık hücreleri toplamak için HBSS-FCS 5 ml ile bir kez Petri kabı durulayın. buz üzerinde hücreleri yerleştirin.
    Not: 2 saklandığında kemik iliği hücre süspansiyonu hala canlı olması - 4 ° C'de 3 saat süredir.

Kemik İliği Hücrelerinin 2. Kaplama ve Kültürleme (BMCs)

  1. Aşağıdaki reaktifler ve sarf malzemeleri hazırlayın.
    1. 2 mM Tris pH 7.2 nihai bir çözelti içinde% 0.84 amonyum klorür yaparak kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu, daha sonra bir 0.2 mikron filtre içinden süzme ile sterilize edin.
    2. % 10 FCS, 20 mM HEPES, 1 x esansiyel olmayan amino asit, 55 ve # ekleyerek BMC ortamı hazırlamak181; RPMI ortamı 1640 M 2-merkaptoetanol, 50 U / ml penisilin ve streptomisin, 1 mM sodyum piruvat ve 2 mM L-glutamin.
    3. Ticari olarak temin edilebilir biraraya getiren GM-CSF elde edilir veya GM-CSF geninin 20 ile transfekte AG8.653 miyeloma hücreleri süpernatant içeren GM-CSF kullanımı. ELISA ile yüzer GM-CSF konsantrasyonu belirlemek BMC ortamına 20 ng / ml eşdeğer ekleyin.
  2. 5 dakika boyunca 314 xg'de kemik iliği hücreleri aşağı doğru döndürün. pelet nedeniyle RBCs için, kırmızıdır. BSC, emme vakum dokunarak pelet gevşetin ve RBC parçalama tamponu 10 ml bağlanmış bir steril cam Pasteur pipet kullanılarak süpernatan aspire. Girdap hücreleri tekrar süspansiyon ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında RBC liziz tamponunda inkübe edilmesi.
  3. HBSS-FCS sonra 5 dakika boyunca 314 xg'de hücreleri dönmeye ve süpernatant aspire 10 ml ekleyin. beyaz renk olarak hücre pelet gözlemleyin. BMC ortamı istenen hacmi içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  4. resu Sayısı% 0.4 tripan mavisi ile ölü hücreleri boyandıktan sonra bir hemositometre kullanılarak spended hücreleri.
    NOT: Bir bacak (tek tibia ve femur) kemik iliği kullanılırsa, BMC ortam 5 ml içinde tekrar süspansiyon hücre süspansiyonu 10 ul alır ve mavi% 0.4 tripan 70 ul ile seyreltilmiş, iyice karıştırın ve 10 ul transfer hemositometre haznesine 1/8 hücre dilüsyonu. Dört çeyrek daireye canlı hücreleri saymak: dört kadran sayımı ortalama seyreltme faktörü x 10 4 = ml başına hücre sayısını x. RBC Parçalama işleminden sonra 4 x 10 7 hücre - Bir femur ve bir bacak bir tibia genellikle yaklaşık 2 verecektir.
  5. Kültür sonunda deneyler için gerekli olan toplam hücre sayısına göre alt deneyler için gerekli olan kemik iliği kültürleri 10 mi yemekler kestirilebilir.
    NOT: Her yemeğin 2 x 10 6 kemik iliği ilk tohumlama hücreleri ve verimleri 5 gerektirir - 7. günde 10 x 10 6 hücre.
    1. Ali5 dakika boyunca 314 x g hızında aşağı spin, yeni bir tüp içine kaplama hücrelerin toplam sayısı quot süpernatan aspire ve BMC medya 4 x 10 6 hücre / ml'de tekrar süspansiyon hücreleri.
  6. BMC ortamı 9.5 ml GM-CSF (rekombinant ya da süpernatan içeren GM-CSF ile ilgili), 200 ng içeren yeni bir steril 100 mm x 15 mm Petri kabı hazırlanır. 10 ml, 2 x 10 5 hücre / ml nihai konsantrasyon için Petri kabı merkezine 4 x 10 6 hücre / mL, kemik iliği hücrelerinin 500 ul ekle.
    NOT: steril Petri kabı değil bir doku kültürü çanak kullanmak önemlidir. Hücreleri eklerken Ayrıca, hücreler merkezde konsantre kalmasını sağlamak ve tohumlama sonrası ve ortam değişiklikleri sırasında yemekleri rahatsızlığı en aza indirmek. 37 ° C'de ve% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. Bu kültürde gün 0'dır.
  7. 3. günde, hücreler her bir tabak için, GM-CSF, 200 ng içeren taze BMC, 10 mL ortam ilave edin. rahatsızlık o en aza indirmek için özensüspansiyon içinde konsantre hücre f. Hücre kültürünün toplam hacmi artık 20 ml'dir.
  8. 100X büyütmede ışık mikroskobu altında hücreleri gözlemleyin. Çok sayıda yapışmaz hücreler (yuvarlak) ve birkaç yapışık hücrelere (düz) dikkat edin. Bir çiçeğin üç ya da dört benzer yaprakları gruplarda hücre proliferasyon gösteren görülebilir.
  9. 6. günde bir buçuk medya değişikliğini gerçekleştirmek. Dikkatle 5 dakika, aspirat için 314 xg aşağı spin, steril 50 ml konik tüp içine medya 10 ml kaldırmak ve supernatant atın.
  10. GM-CSF, yavaşça girdap ve 20 ml toplam hacim için orijinal hücre kültür çanağı ekle 20 ng / ml ihtiva eden taze ortam, BMC, 10 ml hücre pelletini. mikroskop altında hücreleri gözlemleyin.
    NOT: Günlük 7 kültür% 70 olması ya da yapışık yassı hücreler ve yuvarlak yapışmayan hücrelerin yoğun bulutlar confluency daha fazla olmalıdır.

3. Toplama ve Akış Sitometri için BMDC ve BMDMs hazırlama

  1. 4 ° C'de tüm tamponları tutun.
  2. hücreler, 50 ml'lik konik bir toplama tüpüne kültür süpernatanının ilk transfer 10 mi hasat için günde 10 gün 7 hücreleri hasat, daha sonra yaklaşık 30 derece dikey çanak eğilme ve kalan 10 ml pipetleme bulaşık yıkama çanak üst kültürü. Bu yıkama 5 kez, üçte bir oranında çanak dönen her zaman tekrarlayın.
  3. Aynı toplama tüpüne hücrelerin kalan 10 ml aktarın ve plaka ve yapışık hücreleri atın.
    NOT: yıkar yapışmayan ve gevşek yapışmış olan hücrelerin kaldıracaktır; Düz yapışmayan hücreler yıkama dayanıklıdır. Tipik olarak, 5 ila - 10 x 10 6 yapışmayan hücreler gün 7 ve 2 de bir plaka beklenen -, 10. günde 5 x 10 6 hücre Lutz ve ark, ancak. 10. günde bildirilmiştir 10 x 10 6 hücre yapışan hücreler, normal olarak alınmamıştır. Bununla birlikte, bu hücreler, gerekirse yapışmayan hücreler ile karşılaştırıldığında gerekenaşağıdaki gibi, çıkarılabilir. 1 x PBS, yapışmayan hücreler çıkarıldı sonra çanak pH 7.4 içinde 0.7 mM EDTA 5 ml, ayrı bir tüp içinde yapışmayan hücreler giderilmiş ve toplamak için yukarı ve aşağı 5 dakika, pipet için 37 ° C'de inkübe edin.
  4. 5 dakika boyunca 314 xg'de toplanan hücreleri aşağı spin ve süpernatant aspire. 4 ° C'de 5 ml steril BMC medyada süspanse, vorteks hafifçe karıştırın ve tripan mavi ve hemasitometre kullanarak saymak.
    NOT: 5 verecektir Her yemeğin - Bir gün 7 kültüründen 10 x 10 6 yapışmayan hücreler. Şu andan itibaren, 4 ° C'de tüm adımları uygulayın.
  5. Akış sitometrik analizi, 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp içine 2 x 10 5 hücre her bir örnek için transferi için, her bir 4 ° C (1 x fosfat tamponlu tuzlu su, 2 mM EDTA ve% 2 sığır serum albümini) FACS tampon 300 ul örnek.
  6. 5 dakika boyunca 314 xg'de hücreleri aşağı Spin ve süpernatant aspire. bir görünür beyaz, opak pelet gözlemlemekTüpün alt.
  7. Etiketlenmemiş Fc reseptörü Ab 100 ul içinde süspanse hücreleri (miyelom hücre çizgisi üreten 2.4G2 kullan 1/10 süpernatant) Fc reseptörü bloke etmek ve 4 ° C de 20 dakika inkübe etmek. Daha sonra 5 dakika boyunca 314 xg'de hücreleri aşağı spin, her bir örnek, yavaşça girdap için FACS tampon 300 ul ekleyin ve süpernatant aspire.
  8. 0.2 ug / ml'de CD11c-PeCy7 100 ul içinde süspanse hücreleri, 0.25 mg / ml'de Gr1 Pasifik Mavi, 0.05 ug / ml'de MHC II-APC, ve FL-HA yaklaşık / mL 2 ug makrofajlar ve DCS tespit etmek.
    NOT: FL-HA floresein ve horoz tarak hiyalüronik asit sodyum tuzu kullanılarak evde hazırlanan önceden 21 nitelendirdi.
  9. Hücre yüzeyine bağlanmaya imkan vermek için, 4 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Her bir örnek FACS tampon 300 ul ekleyin, yavaşça girdap, sonra 4 ° C'de 5 dakika 314 xg'de hücreleri aşağı spin ve süpernatant aspire NOT:. Bio EğerFloresan-streptavidin ile 9 - tinylated antikorlar 3.8'de kullanılan, 3.8 tekrarlayın.
  10. karıştırın ve 5 dakika boyunca 314 xg'de hücreleri aşağı spin FACS tampon başka 300 ul, yavaşça girdap hücreleri yıkayın. Süpernatant aspire ve 0.1 içeren FACS tamponda 200 ul hücrelerin tekrar süspansiyon - cansız hücreleri etiketlemek için propidyum iyodür veya DAPI ml'si başına 0.2 ug. Hücreler artık akım sitometri analizi 22 için hazır.
    Sonuçları gör ve popülasyonların ayrıntılar için Şekil 3 ve hücreler nasıl kapı edildi: NOT.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yöntemin en önemli adımları özetleyen bir akış şemasıdır, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kültür farklı zamanlarda, kemik iliği kültür yoğunluğu ve şekil Şekil 2'de gösterilmektedir. Gün 1' de hücreler küçük ve seyrek ama 3 gün cinsindendir orada daha fazla hücre, bazı büyük olan ve birkaç uymak başladı. 6. günde tarafından kesin bir yapışkan ve yapışkan parça (Şekil 2A) bulunmaktadır. Kültür 7. günde hasat edilebilir - gün 10...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, Lutz ve ark., 6 uyarlanmış olan bir tek bir fare kemik iliği kültürü GM-CSF türetilmiş makrofajlar ve DCS üretilmesi için bir yöntem sağlar. Bu kültürde olgunlaşmamış DC'lere ve makrofajlar olarak ayrılır bağlayıcı MHC II ifadesi ve FL-HA, daha önce zor olmuştur (Şekil 3C). Bu arada helft ve ark., 19 başka rapor ile, daha önce sadece DC'ler olduğu düşünülen GM-CSF kaynaklı BMDC kültürlerin içinde heterojeniteyi göstermektedir. Helft ve ark.,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir finansal çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) (Hibe MOP-119503) ve Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Konseyi (NSERC) Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. NSERC ayrıca YD yaz studentships desteklenen ve AA YD 4 yıllık dostluk ödülü British Columbia Üniversitesi (UBC) tarafından desteklenen, AA lisans öğrencisi yüksek lisans ödülü (CGS-M) ile CIHR tarafından desteklenmektedir. Biz Şekil 2'de görüntüler oluşturmak için kullanılan mikroskop ile yardım için Calvin Roskelley teşekkür ederiz. Biz de UBC Hayvan ve Sitometrisi Tesisleri destek kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Akış SitometresiBD LSR-II
Otomatik Ters Mikroskop Leica DMI4000 B
Santrifüj Thermo FisherST-40R Biyogüvenlik
KabiniNuaireNU-425-600
Şırınga 1 mlBD309659
26 1/2 Gauge İğneBD305111
50 ml Konik Tüp Corning357070*Falcon marka
Eppendorf tüpleri (1.5 ml)CorningMCT-150-C
5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüplerCorning352052
DiseksiyonAletleri Güzel Bilim Aletleri *Çeşitli * Diseksiyon makası, dumont forsep ve standart forseps;
Hemositometre ve nbsp;Reichert1490
Steril 100 mm x 15 mm Petri KabıCorning351029*Falcon marka
2-MerkaptoetanolThermo Fisher21985-023
Amonyum KlorürBDHBDH0208-500G
Sığır Serumu Albümin FisherBiyoreaktifleriBP1600-1
Brefeldin ASigmaB7651-5MG
EDTASigmaE5134-1KGEtilendiamintetraasetik asit
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher16000-044
Hank'in Dengeli Tuz ÇözeltisiThermo Fisher14175-095 
HEPESThermo Fisher15630-0804- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit
L-GlutaminSigmaG8540-100G
LPS UltrasafInvivogentlrl-3pelps
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi Thermo Fisher11140-050
Penisilin / Streptomisin 100xThermo Fisher15140-122
Potasyum Fosfat MonobazikBDHBDH0268-500G
Potasyum KlorürBDHBDH9258-500G
Rekombinant GM-CSFPeprotech315-03-A
Horoz Tarağı Sodyum Hyaluronat SigmaH5388-1G*Floreseinli hyaluronan
RPMI-1640 yapmakThermo Fisher21870-076Sodyum piruvat yok, glutamin yok. 37 ° C'ye kadar sıcak ortam; ° Kullanmadan önce C.
Sodyum KlorürFisher 5271-10   
Sodyum Fosfat DibazikSigma50876-1Kg
Sodyum PiruvatSigmaP5290-100G
Tris(hidroksimetil)aminometanFisher BiyoreaktifleriBP152-5
Tripan MaviSigmaT8154
Anti-Fc Reseptörü (etiketlenmemiş), Doku Kültürü SüpernatantN/AN/AKlon: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7 eBioscience25-0114-82Klon: N418
Anti-Gr-1 efluor450eBioscience48-5931-82Klon: RB6-8C5
Anti-MHCII APCeBioscience17-5321-82Klon: M5 / 114.15.2
Biyotinile Anti-MerTKAbcamBAF591Keçi poliklonal IgG
Streptavidin PEeBioscience12-4317-87
Propidyum İyodürSigmaP4170-25MG
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol)SigmaD9542-5MG
için kullanılır.

Kaynaklar

  1. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  2. Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
  3. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
  4. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  7. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
  8. Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
  9. Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
  10. Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
  11. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
  12. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
  13. Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
  14. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
  15. Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
  16. Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
  17. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
  18. Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
  19. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  20. Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
  21. de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
  22. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
  23. Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
  24. Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
  25. Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
  26. Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
  27. Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
  28. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  29. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

GM CSF Kaynakl MakrofajlarKemik li i K lt rDendritik H cre DiferansiyasyonuMHCII EkspresyonuFL HA Ba lanmasCD11c pozitif H crelerKemik li i zolasyonuAk Sitometrisi AnaliziH cre K lt r Protokol

İlgili makaleler