İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Summary

Bu yazıda izolasyon ve bu dokulardan mezenkimal kök / stromal hücreler (MSC) genişlemesi, ardından insan terim plasenta, fetal ve maternal dokuların diseksiyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

Abstract

Mezenkimal kök/stromal hücreler (MSC), hücre bazlı tedavilerde kullanım için umut verici adaylardır. Çoğu durumda, terapötik yanıt hücre dozuna bağımlı gibi görünmektedir. İnsan terimi plasentası MSC açısından zengindir ve genellikle doğumdan sonra atılan fiziksel olarak büyük bir dokudur. Plasenta, allojenik MSC'nin çoklu hücre dozlarının büyük ölçekli üretimi için ideal bir başlangıç materyalidir. Plasenta, fetal veya maternal dokunun izole edilebildiği fetomaternal bir organdır. Bu makale, plasental anatomiyi ve desidua (maternal), koryon villus (fetal) ve koryonik plaka (fetal) dokusunu ayırmak için prosedürü açıklamaktadır. Protokol daha sonra MSC'nin diseke edilen her doku bölgesinden nasıl izole edileceğini ana hatlarıyla belirtir ve ilgili doku tiplerinden türetilen genişlemiş MSC'nin temsili analizini sağlar. Bu yöntemler klinik öncesi MSC izolasyonu için tasarlanmıştır, ancak aynı zamanda insan terapötik kullanımı için plasental MSC'nin klinik üretimi için de uyarlanmıştır.

Introduction

Mezenşimal kök / stromal hücreler (MSC), hücre bazlı terapiler ¹ kullanılmak için umut verici bir aday olarak ortaya çıkmaktadır. Çoğu uygulama MSC aracılı doku tamirini veya immün regülasyonu ² hedef görünür. Bu uygulamaların çoğunda, allojenik MSC otolog MSC ³ kadar etkili olabilir. Allojenik MSC kullanımı birçok hastaları tedavi etmek için, tek bir kaynak dokuda ⁴ birden fazla hücre dozlarının büyük ölçekli üretimi ile uyumlu olma ekonomik avantajı vardır.

Tarihsel olarak, ön-klinik ve klinik çalışmalarda, kemik iliği ⁴ MSC türevi kullanmışlardır. Kemik iliği genellikle gönüllü vericinin iliak toplanır. Bu işlem, invaziv ve kemik iliği (~ 20 mi), sadece küçük bir hacim tek delik yoluyla toplanır. MSC klinik olarak anlamlı sayılar üreten in vitro genişlemesi kapsamlı gerektirir. Hücre gücü kanal adedi ile azalır ^{3, klinik etkinlik için gerekli olan hücrelerin teorik sayısı daha fazla hücre popülasyonu genişletilir artan bir paradoksuyaratmanın. Kemik iliği aksine terimi plasenta verici için bir risk ile sezaryen esnasında aseptik hasat edilebilir bir fiziksel olarak büyük olan bir başlangıç ​​dokusu (tipik haliyle 500-750 g kadar 4) 'dir. Plasenta türetilen MSC kemik iliği kaynaklı MSC üstün uzun vadeli çoğalması 5 ve immünomodülatör kapasitesi 6 var. Bir önceki çalışmada, tek bir terim plasenta kadar 7.000 klinik dozlarda 4 imalatı için yeterli MSC içerdiğini göstermiştir. Bu özellikler, allojenik MSC üretimi için ideal bir kaynak dokuda plasenta olun.}

Plasenta, teorik olarak, izole olabilir fetal veya maternal kökenli bir fetomaternal hem fetal ve maternal dokusunun ⁷ oluşan organı ve dolayısıyla MSC olduğunu. Aşağıdaki referanslar DE sağlamakgeliştirme ve patolojisi kuyruklu bilgiler, yanı sıra insan plasenta ve overler ^8,9 mikroskobik ve makroskobik incelenmesi. Plasenta uygun koryon frondosum (plaka) ⁸ kapsadığı koryon villus oluşturan, büyük ölçüde fetal kan damarları ve salgı ve trofoblastlar denilen destekleyici hücrelerin oluşmaktadır. dallı plasental villus besin, hormon ve fetüs ve anne arasındaki gaz alışverişini sağlayan, rahim spiral arterlerin teslim anne kanında banyo edilir. Plasenta anne desidual stromal hücreler ve fetal extravillious trofoblastların yoluyla endometrium demirlemiş ekstraselüler matriks ⁸ serpiştirilmiş. Villus onlar göbek kordonu ⁸ oluşturan fetal koryonik plaka üzerine birleşir.

Plasenta-Türetilmiş Kök Hücre ilk Uluslararası Çalıştayı bir sonucudur (2008) izolasyon ve characterizatio standardize ihtiyacının bir takdir olduğunuİnsan plasentasından ¹⁰ hücreleri n. Çünkü plasenta anatomisinin farklı dokuların diseksiyonu, MSC izolasyonu ve beklenen kültür sonuçları alanına yeni gelenler için çok zor olabilir. Bu protokolde, MSC izolasyonu ve genişleme takip plasental koryon dokuların hasat iyice detaylı. Flow sitometri aracılığı ile in vitro farklılaşma MSC karakterizasyonu rutin ^5,11-13 olarak kabul edilir ve bu nedenle sadece burada kısaca ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Son sistematik literatür ¹⁴ vurgulandığı gibi, MSC plasental koryon villus genellikle fetal olarak kabul edilir elde. Her ne kadar, çalışmaların sadece% 18'i elde MSC kaynağını incelenmiş ve bunlardan, çalışmaların sadece yarısı fetal MSC ve diğer yarısı anne ya da karışık MSC popülasyonları bildirdi. Burada tarif edilen üç doku bileşenlerinin her biri (koryon villus, koryonik plaka ve desidua basalis) comp vardıröncelikle fetal membran / villus ve teslim plasenta bağlı kalır rahim kökenli anne hücreleri, küçük bir oranda osed. Veri anne MSC isteniyorsa daha önce ^5,11 rapor gibi, plasentanın anne tarafında, yerine plasentanın fetal taraftan MSC izole, daha uygun bir başlangıç ​​malzemesi olduğunu gösteren sağlarlar. Bu protokol aynı zamanda hücre kültürleri fetal veya maternal katkı doğrulamak için XY FISH kullanımını açıklar. Bu üreticinin standart bir protokoldür iken, bu analiz genellikle ihmal ve önemi ¹⁴ göz ardı edilmektedir.

Protocol

İnsan Araştırmaları Etik Mater Sağlık Hizmetlerinde Komiteleri, Royal Brisbane ve Kadın Hastanesi, Queensland Teknoloji Üniversitesi ve University of Queensland çalışmasında kullanılan insan plasenta örneklerinin araştırma ve toplama onayladı. Tüm protokoller ulusal araştırma kurallarına uyulması. Hastalar araştırma amaçlı doku kullanımı için yazılı onam İşletmesi.

Üçüncü trimester plasenta Brisbane, Avustralya yukarıda belirtilen hastanelerden dönem rutin sezaryen (CS) doğum aşağıdaki sağlıklı annelerden elde edildi. vadeli örnekleri için erkek uyumsuz gebelikler anne hücreleri fetal ayırmak için bu çalışmada kullanılmıştır. Fetal cinsiyet önce doğum ve / veya klinik personeli tarafından doğumda yenidoğanın görsel muayeneye ultrason ile tespit edilmiştir. In situ hibridizasyon (FISH) X ve Y kromozomu floresan ayrıca cinsiyet ve korunmuş doku fetal veya maternal kökenini doğrulamak için kullanılmıştırOrijinal plasenta.

1. öncesinde Harvest, ardından hazırlayın

Not: Enzim çözümleri yukarı yaparken, her bir ürün için üretici tarafından sağlanan özel gereksinimleri ve konsantrasyonları takip edilmelidir. Enzimler genellikle bu nedenle de farklı firmalardan benzer enzimler farklı etkinlikler / konsantrasyonları olması muhtemeldir, proteinlerin ham bir karışımı olarak temin edilmektedir. Bu nedenle, üreticilerin tavsiyelerine kabul edilmelidir ve çözelti hazırlama göre modifiye edilmesi gerekebilir.

1. Hazırlayın ya da 1.5 ila 2 L toplam satın alma steril bu protokol için Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS).
2. kollajenaz tip I tartılmasıyla kolajenaz I stok çözelti hazırlayın ve yavaşça tam çözünmenin gerçekleşmesi için 1 mg / ml HBSS içinde ve vorteks çözülür. 100 birim (U) / ml (1,000x stok çözelti) kollajenaz çözüm getirmek ve daha sonra bir 0.2 kullanılarak filtre etmek için gerekli HBSS (kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden) hacminin belirlemek# 181; m şırınga filtresi. -20 ° C'de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli.
3. kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) içinde 10 mg / ml steril olmayan dispaz eritilerek dispaz stok çözelti hazırlayın. Ayrıntılı 2.4 U / ml bir son konsantrasyona kadar kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile seyreltin. 0.2 mikron şırınga filtre ile sterilize filtre. -20 ° C'de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli.
4. 0.15 M NaCl içerisinde 10 mg / ml'de DNase I çözülmesiyle deoksiribonükleaz (Dnase) -I stok çözelti hazırlayın. 0.2 um'lik bir şırınga filtreden filtre thorugh. -20 ° C'de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli.
5. 100 U / ml kolajenaz türü birleştirerek çalışma sindirim çözeltisi hazırlayın I I.5 ug / ml DNase I ve 2,4 U / ml dispaz serumsuz DMEM. Taze defrost ve kullanımdan hemen önce, enzim stok seyreltin. Yaklaşık bir 1: sindirim çözeltisi 1 oranındaDoku hacmine gereklidir (50 ml tüp içinde ölçülen doku gibi 10 ml, sindirim çözeltisi 10 ml gereklidir).
6. PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) içindeki bir çözeltisi hazırlandı ve pH, 7.4 ila ¹⁵ ayarlanır. Mağaza uzun süreli ya da 1 hafta boyunca 4 ° C 'de, -20 ° C'de 25 ml'lik örnekler.
7. 1 x antibiyotik ve antimikotik çözelti ve% 10 ısıl inaktif fötal sığır serumu ile takviye edilmiş DMEM-düşük glikoz (DMEM-LG) MSC kültür ortamı hazırlayın. MSC dereceli FBS birçok FBS tedarikçilerden satın alınabilir.
8. kurumsal rehberlere göre önceden diseksiyon ekipmanı sterilize otoklavlayın. Bu makas, forseps, neşter ve büyük bir metal diseksiyon tepsisi bulunmaktadır. Ek steril doku kültür plastik malzeme, sarf malzemeleri (örneğin neşter, 50 ml ve 15 mi borular, 25 mi, 10 mi, 5 ml pipet ve 75 ya da 175 ^cm2 hücre kültürü şişeleri) toplayın.
9. bir sınıf II b: standart birincil hücre kültür laboratuvar ekipmanı kullanınPrimer hücre izolasyon için uygun iosafety dolabı, hücre kültürü kuluçka% 5 _CO2 ve 37 ° C, 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir rocker ve 50 ml'lik tüplere kapasiteli bir santrifüj ayarlanır.
10. kurumsal rehberlere göre bir laboratuvar önlüğü, (her zaman) eldiven 2 çift, koruyucu gözlük ve yakın parmaklı ayakkabı: Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
11. önceden kurumsal rehberlere ve sıvı biyolojik atık kapları göre insan kan örnekleri için uygun dekontaminasyon çözümleri hazırlayın.

Plasental MSC 2. izolasyonu

1. Plasenta hazırlanması
   1. gerekli kişisel koruyucu ekipman giydirin. enzimatik sindirim (bölüm 2.5.6) prosedürü kadar yürütmek için gerekli malzeme, çözümleri ve atık kapları ile biyolojik güvenlik kabini ayarlayın.
   2. aydınlatılmış onam ve etik onayı ile bir plasentayı edinin. sezaryen sn yoluyla plasentayı toplayınlaboratuara taşınması için steril torba ya da kova aseptik cerrahi koşullar altında tion, ve ambalaj.
   3. taşıma ve diseksiyon önce sırasında, oda sıcaklığında veya 4 ° C'de plasentayı saklamak.
      Not: doku hücre kültürünün performansını etkilemeden en fazla 6 saat süre ile depolanabilir.
      1. Plasenta toplama ve doku işleme mümkün arasındaki süreyi sınırlayın. Bu öneri pratik konular dayanmaktadır. Bazı durumlarda, biz doğumdan sonra 6 saat boyunca hücre izolasyon işlemi geciktirmiştir. Bu durumlarda plasenta oda sıcaklığında ya da 4 ° C (laboratuarda veya toplama merkezinde) tutulan edilmiştir. bunlar, 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında muhafaza edildiğinde hiçbir belirgin farklılıklara plasenta elde MSC, genel verici varyasyon üzerinde gözlenmiştir.
   4. biyolojik güvenlik kabini plasenta ile kap yerleştirin. Kabı açın ve steril bir tepsiye plasentayı aktarın.
   5. Fetal membranlar (amniyon kesesi ya da amniyon-koryonik laeve) ⁸ açılmaktadır. plasenta parçaları ile odaklı hale gelir. fetal yan merkezi plasenta takılı, genel olarak göbek kordonu ekleme vardır. Fetal yanının karşısında olduğu (Desidua basalis ile kaplı) maternal, belirgin kotiledonlar (ya da lob) sahiptir.
   6. diseksiyon başlamak için, steril tepside yukarı bakacak şekilde göbek kordonu ile plasentaya yolunuzu.
      Not: Bu protokol, üç doku tiplerinin her birinden bir T175 şişesi içine tohum için yeterli hücreleri elde etmek için tasarlanmıştır. Her bir özeti dokusunun yaklaşık 10 g ile başlar. Bu 20 mi, kemik iliği aspiratı başlatılan MSC kültürler olarak şişelere benzer bir başlangıç ​​sayıdır. daha fazla hücre istenirse, daha sonra, doku hasat edilebilir ve protokol doğrusal ölçeklendirilebilir. hasat edilecek doku boyutları plasenta dokusundan pratik olanın sadece gösterge niteliğindedir. Birkaç definin varBir referans noktası olarak kullanılabilir plasental villus, g özellikleri. belirtilen boyutlar bir tahmin olarak hizmet ve göbek kordonu fetal yüzey üzerinde bir dönüm noktası olarak kullanılır.
2. Desidual (D) Doku Diseksiyon
   1. bu yüzden anne yüzey (desidua basalis) yukarı bakacak üzerinde plasentayı çevirin. göbek kordonu ekleme noktası fetal yan aşağı baktığından emin olun.
   2. plasenta (desidua basalis doku içeren) maternal taraftan 0,5 cm kalınlığında parçalar kesin.
   3. nemli doku parçaları tutmak için Diseksiyon sırasında HBSS içeren bir Petri kabı içine doku parçaları yerleştirin.
   4. (Bu doku yaklaşık 10 g), 50 ml'lik bir tüp içinde 10 ml işaretine kadar bir tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın.
3. Koryon Plate diseksiyonu (CP) Doku
   1. Mekanik cho bırakarak, plasentanın (değil amniyon kesesi) fetal yüzeyinden amniyotik membran kaldırmakrionic frondosum (koryon plaka) bozulmamış.
   2. koryonik plaka derin 0,5 cm 1 cm genişliğinde ~ parçaları kesin. uzakta plasentanın kenarından, en yakın göbek kordonu bölgeye koryonik plaka hasat.
   3. hidrate tutmak için Diseksiyon sırasında HBSS içeren bir petri içine doku parçaları yerleştirin.
   4. 10 mi işaretine (~ 10 g doku) kadar 50 ml tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın.
4. Koryon Villi diseksiyonu (CV) Doku
   1. CV doku ~ 1 cm CP zaten kaldırıldı plasenta dokusundan derin ² x 0.5-1 cm parçalara ayır. Yine, uzak plasentanın kenarından bölgeye göbek kordonu yakın, hasat CV. (Desidua basalis doku içeren) plasentanın anne tarafında uzağa en az 1 cm kalmaya çalışın; amaç plasenta villus dokusunun iç doku hasat etmektir.
   2. disse sırasında HBSS içeren bir Petri kabı içine doku parçaları yerleştirinhidrate tutmak için ction.
   3. 10 mi işaretine (~ 10 g doku) kadar 50 ml tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın.
5. Kıyma ve D CP enzimatik sindirimi ve CV Plasental Dokular
   1. D ~ 10 g olduğu gibi, CP veya CV dokuları, üç farklı 50 ml tüpler, HBSS yaklaşık 40 ml ile herbir tübe girip sürekli doku yıkamak için tüp ters (10 sn ~ için tekrar).
   2. Süpernatantı Durusu ve çözüm kandan büyük ölçüde boşalana kadar bu yıkama adımı 2-3 kez tekrarlayın. süpernatan ayrıldı sırasında doku parçaları tüp (ler) dışında kayıp değil emin olmak için bir 10 ml pipet veya uzun cımbız kullanın.
   3. en az bir sıvı transferi ile 10 cm'lik petri doku parçaları dönün. Chop / makas veya jilet ile yaklaşık 1-5 mm ³ ince parçalar halinde doku kıyma.
   4. geri uygun şekilde etiketlenmiş (D, CP veya CV) 50 ml tüpler içine kıyılmış doku aktarın.
   5. taze prepar ekledoku (örneğin, 10 ml doku ilave artı ortamı özet 10 mi) ile: 1 oranında ed en az 1 'de ortam sindirimi. Her tüp kapağı değiştirin ve karıştırmak için boruları birkaç kez ters çevirin.
   6. 37 ° C'de 1-2 saat boyunca ortam sindirimi tüpler dokuları inkübe edin. Nemlendirilmiş atmosfer ve% 5 _CO2 Bu aşama için gerekli değildir.
      Not: Hızlı sarsıntı verimli MSC verimi doku hücreleri ayırmak ve üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Sınırlı verim 48 saat ve daha uzun 1-2 haftadan fazla bir birinci kanalı zamanda kültür şişesine bağlı çok az hücreleri tarafından belirgin olacaktır. Kuluçka süresi ve sallayarak yöntem laboratuvarda mevcut 37 ° C inkübatör bağlıdır ve optimizasyon gerektirebilir.
      1. hızlı ve kontrol edilebilir çalkalama mekanizması, yer dokusu ile bir inkübatör ve inkübatör 50 ml'lik bir tüp veya steril erlene, yerinde orta sindirmek ve 250 rpm hızı sallayarak ayarlayın. Bu tam bir Digest sonuçlanır1 saat doku.
      2. Seçenek olarak ise, hafif bir sallama ya da sallanan bir mekanizma ile bir inkübatör için, elle 10 sn 1,5 ila 2 saat süre ile, her 30 dakika boyunca elle hızlı ve kuvvetli bir şekilde tüp sallayın. Enzim Kuluçka dönemi, gereksiz öğeleri biyogüvenlik kabini temizleyin atık atmak kirli ise laboratuvar önlüğü değiştirebilir ve prosedürün bir sonraki bölümü için hazırlamak için uygun bir zamandır.
6. Mononükleer Hücreleri Toplama ve parfümeri içine Kaplama
   Not: Bir önceki Aşama'daki, doku parçaları sindirilmesi ile üç adet 50 ml'lik tüp (D, CP veya CV) vardır. Doku özet çözüm bulutlu bir görünüm geliştikçe ve beyaz kan damarları dokuda belirgin olduğunda, sindirim tamamlanır.
   1. Dijestiyon çözeltisi içinde ihtiva edilen enzimleri inaktive her tüpe FBS içeren MSC medya 30 ml ekleyin.
   2. Büyük sindirilmemiş enkaz mononükleer hücreleri ayırmak için nabız 50 ml tüp santrifüj. Kısaca, izinsantrifüj 340 x ulaşmak için g 5 saniye sonra durur. Bu sıvı süspansiyon mononükleer hücreleri bırakarak, tüpün alt pelet büyük artıkları zorlar.
      Not: tüp sadece kısa bir süre (pulsed) santrifüj ise mononükleer hücreler sıvı fazda kalır. santrifüj uzatılırsa, tek çekirdekli hücreler, arzu edilmeyen hücre kaybı ile sonuçlanan, doku parçaları ile tüpün alt pelet olacaktır.
   3. mononükleer hücreleri içeren supernatant toplamak ve bir pipet ile yeni bir 50 ml'lik bir tüp içine, bu aktarın.
   4. Kalan plasental doku enkaz medya veya HBSS 30 ml ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Bu süspansiyon içine kalan müstakil mononükleer hücreleri getirmek ve dokudan varsayılan MSC ikinci bir hasat sağlayacaktır.
   5. Darbe santrifüj tüpü ikinci kez ve yine yeni bir 50 ml'lik bir tüp süpernatantı aktarın. Bu adımı toplama verimliliğini en üst düzeye çıkarmak üçüncü kez tekrarlayınHer bir doku kaynağından mononükleer hücre.
   6. iki adet 50 ml'lik tüplere bağımsız doku tiplerinin her birinden süpernatantlar havuz. Bu toplam 6 tüpler (her D, CP ve CV 2 tüpleri) verecektir. Santrifüj 340 x g'de 5 dakika boyunca her bir tüp. Bu adım tüplerin altına mononükleer hücreler pelet olacaktır.
   7. Dikkatle süzün veya atık içine süpernatant pipetle. Süpernatant her damla ortadan kaldırmak için denemek için gereksizdir.
      Not: hücre topağı ise kırmızı kan hücrelerinin çok sayıda hassas olacaktır. 50 ml tüp doğrudan boşaltılarak eğer yanlışlıkla pelet atmak için dikkatli olun.
   8. süpernatant en çıkardıktan sonra, yavaşça hücre pelletini çıkarmak için bir parmak ile tüpü birkaç kez hafifçe vurun. buradaki her bir D, CP veya CV doku için tek bir tüp olup, böylece granül birleştirin ve MSC medya 35 ml, her yeniden süspanse edin.
   9. İsteğe bağlı: 100 mikron örgü hücre süzgecinden mononükleer kısmını filtre u set50 ml'lik bir tüp içinde bir p hücre kümeleri veya lifli malzemenin çıkarılması için.
      Not: Filtreler kolayca yapışmasına neden olabilir ve aşırı dolgu gibi bakım gereklidir. Ayrıca, hava kabarcıkları drenaj filtreleri engelleyebilir. Bu durum ortaya çıkarsa, yavaş yavaş hava, yeni bir filtreye hücre kültür ortamı veya değişim ile aracılığıyla filtre, filtre altında akmasına yıkamak için izin tüpün dışına filtreyi kaldırın. Filtreleme adımı hariç takip eden MSC kültürlerinin verimini ve kalitesini değiştirmek için görünmez.
      1. İsteğe bağlı olarak, bir kırmızı kan hücresi (RBC) parçalama veya yoğunluk gradyan santrifüj Bu aşamada ¹⁵ üzerinden gerçekleştirilebilir. Ancak, bizim deneyim RBC MSC eki ya da çoğalması ve bu nedenle RBC lizis müdahale kalmamasıdır gerekli değildir. RBC çıkarma ¹⁵ üzerinden gerçekleştirildiği takdirde Mononükleer hücreler bu aşamada sayılabilir. Her ne kadar, bu aşamada hücreler büyük çoğunluğu MSC, ancak fetal kökenli trofoblast, endotelial hücreler ve hematopoietik hücreleri, hem de ma olmayacakmodu, harici kökenli hematopoetik hücreleri ve desidual stromal hücreler.
   10. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, tek bir T175 şişeye ve kültür, her D, CP veya CV doku için hücre süspansiyonu aktarın ve% 5 _CO2.
7. Mesaj İzolasyon-hücre Genişleme
   1. İlk izolasyon aşağıdaki 48 saatte, şişeler (D, CP ve CV) her birinden orta kaldırmak ve taze MSC medya 35 ml ile değiştirin. Farazi MSC doku kültürü şişesi ¹⁶ bağlı olduğu varsayılan harcanır orta ve müstakil hücreleri, iptal edilebilir. Bir 24 saat daha kuluçka şişeler dönün.
   2. kültürün ek bir 24 saat sonra, enkaz ve eritrositlerde kaldırmak için DPBS (25 mi) ile iki kez şişeler yıkayın. Eritrositlerde çıkarmak için şişenin dibine etrafında sıvı girdap. sıvı ve enkaz kaldırmak için bir pipet kullanın. şişelere MSC medya 35 ml ekleyin ve inkübatör şişeler dönün.
   3. haftada iki kez, ve medya değiştirinhücre mono tabakaları kadar cubate kültürler 80-% 90 konfluent. Bu ilk genişletme doku kalitesine bağlı olarak, 4-14 gün sürer, Özet çözeltisi ile malzeme ve verimlilik ve inkübasyon süresi, başlangıç ​​miktarı.

pMSCs 3. Alt kültür

1. Kültürler% 80-90 ortak akışlı olduğunda, 20 ml 1x HBSS veya DPBS ile iki kez yıkayın ve yıkama atın. Her bir şişeye tripsin yerine ekleme (örneğin bir T175 şişeye 5 ml,).
2. Doku kültürü yüzeyinden MSC serbest bırakmak için 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca şişeler inkübe edin. dekolmanı kolaylaştırmak için balonun yanlarnıı her ~ 2 dk dokunun.
3. Hücreler yüzey ve tek bir hücre süspansiyonu müstakil zaman MSC medya ile şişeden hücreler yıkama ve tüplerde hücreleri toplamak. MSC medya sulandırmak ve (~ T175 şişesi başına MSC medya 15 ml kullanımı) tripsin yerine devre dışı kalır.
4. 50, her bir doku kültürü şişesi içeriği aktarmaml tüp.
5. 5 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj tüpleri pelet hücreleri.
6. Süpernatant atılır ve MSC medya 1 ml hücre pelletleri tekrar süspansiyon.
7. 10 ul tripan mavi ile hücre süspansiyonu 10 ul seyreltilir. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve hücrelerin ¹⁵ toplam sayısını hesaplayın.
8. Taze MSC medya 1.150 hücre / ^cm2 yeni şişelere hücreleri transferi ve bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. Bu tohum ekme yoğunluğu MSC medya 35 ml her yeni T175 şişesi içine 200,000 MSC tohum. % 80-90 konfluent kadar haftada iki kez hücreleri beslemek. 1150 hücre / cm ² veya her T175 balona 200.000 MSC daha sonraki pasajlar Tohum.
9. Ne zaman Passage 1 (P1) ya da P2 hücreleri ileride kullanılmak üzere hücrelerin çoğunluğunu cryopreserve ve daha fazla yayılması ve karakterizasyonu için tek T175 şişesi reseed, birleşmiş olan. çoğaltılan hücreler fl yoluyla mezodermal farklılaşma tahlilleri ve hücre karakterizasyonu için P3 veya P4 de kullanılabilirow sitometri.
   Not: Erken pasajlarda, orada çok az seyrek ayrılmış koloniler olabilir, ama her koloninin içindeki yerel hücre yoğunluğu çok yüksek olabilir. hücrelerin lokal yoğun ambalaj büyümesini geciktirerek ve kültür performansı azaltarak, temas inhibisyonu neden olacak gibi bu, ideal değildir. Bu yoğun kolonileri gözlenir, hücreler hasat edilmiş ve yeni bir şişe içine tohumlandı gerektiğini tavsiye. Bu yeniden dağıtım işlemi çoğalmaya oda hücreleri sağlar ve genel kültür performansı artacaktır.
10. MSC dondurularak saklanabilmesi,% 90 FCS ve% 10 dimetilsülfoksit (DMSO), 1 ml için 1 x 10 ⁶ hücre toplanması ve standart protokoller kullanılarak dondurma.
    Not: temsilcisi sonuçları bölümünde, üç farklı (D, CP ve CV) genişletilmiş hücre popülasyonlarının cinsiyetini belirlemek için akış sitometri kullanılarak MSC karakterizasyonu, mezodermal farklılaşma ve XY FISH analizi açıklamaları vardır. Çalışmamızda, plasenta erkek bebekler vardı; böylece tümFetal hücreler erkek (Y kromozomu) olarak ayırt edilebilir ve tüm anne hücreleri (sadece X kromozomu) dişi olarak ayırt edilebilir.

Results

Plasental MSC izolasyon prosedürü MSC izole edildiği plasental anatomisinin üç alan Bu maternal Desidua yanı sıra koryonik plaka ve koryonik çıkıntı büyük ölçüde fetal dokular, Şekil 2'de vurgulanır Şekil 1 'de özetlenmiştir. Birçok ders kitapları, makaleleri ve çevrimiçi kaynaklar detay geliştirme ve çeşitli plasental dokuların fonksiyonel rolü (referansı ⁸ bakınız).

48 saat izolasyonu ve doku kalıntılarının uzaklaştırılmasından sonra kültür morfolojisi.
Eritrositler ve diğer birçok hücresel enkaz bağlı değil ise kültür 48 saat sonra, MKH, doku kültürü plastik eklenmiş olacaktır. Şu anda, ortamı, taze kültür ortamının 35 ml'si ile değiştirilmelidir. Bu orta alışverişi öncesinde, çünkü kesin gözlemler yapmak zordurgörsel değerlendirme engel olacak RBCs çok sayıda. Kültür üstte kalan sıvı kısmın görünümü plasenta donör arasında büyük ölçüde değişebilir. Bu varyasyon, Örnek 1 ve 2 (Şekil 3A) görsel olarak görülebilir. çok farklı olduğu ortaya çıktı bu iki MSC izolasyonları, bahsedilen iki farklı plasenta eşzamanlı olarak yapıldı. Bununla birlikte, bir kez yıkandı, her iki kültür de (yıkandı Örnek 3, Şekil 3A) benzer olmuştur.

Mikroskop altında, 48 saat medya değişiminden sonra, sadece birkaç hücre balonuna (Şekil 3B) bağlı olacaktır ve hücreler daha yoğun genişletilmiş MKH önemli ölçüde farklı görünecektir. Bazı enkaz ve eritrositler yüzen veya ekli topaklar olarak görülebilir ve bu MKH büyümesine engel olmaz. Şişenin dibine yapıştırılmış uzun fibroblastik hücreler, MSC, hematopoietik hücreler de dahil olmak üzere bir karışımı olması muhtemeldirtrofoblastik veya endotel hücreleri. Yine olmayan MSC hücreleri bu hücreler genellikle MSC kültür koşullarında fazla 1-2 geçişleri hayatta olmayacak gibi, MSC kültürleri ödün vermeyiz. kültürlerin ilk görünüşte bazı varyasyon rağmen, daha sonraki genişleme sonuçları genellikle tutarlıdır.

zamanla MSC kültürlerin Morfoloji.
Olmayan MSC hücreleri, yuvarlak olarak görülebilir ya da gevşek bağlı hücreleri (Şekil 4A). Yapışmış hücreler ilk olarak oluşturan bir "koloni birimi olarak adlandırılan ne olmasına rağmen bu Örnek örnekte, yalıtım aşağıdaki yedi gün küçük fibroblastik MSC koloniler görünür Daha sonra -fibroblast "(CFU-F) ¹⁷ ve MSC ¹⁸ olarak adlandırılan. On üç gün ayrılmasından sonra, fibroblastik MSC koloniler büyük (Şekil 4B) idi. Genel olarak, tek-tabakalı, bu noktada% 80-90 ortak akışlı olacak ve hücreler Passa olmalıdır ged. Geçit 2 itibaren itibaren, plasenta MSC tek tabakalı izdiham (Şekil 4C) karakteristik girdap gibi morfoloji gelişecektir. hücreler düşük yoğunlukta geçişli edilmiştir, CFU-E formasyonu artık gözlemlenecektir. Düşük yoğunlukta, plasental türetilmiş MSC yetişkin kemik iliğinden türetilen MSC ¹ den daha küçük, squarer görünüme sahiptir. Plasental türetilmiş MSC ve kemik iliği türevli MSC içindeki proliferasyon oranları sergiler ise, plasental türetilmiş hücreler, hızlı yaşlanma ⁵ daha az yatkındır.

In vitro olarak plasental MSC karakterizasyonu.
Her genişletilmiş hücre popülasyonu o (1) plastik bağlılık (2) mezenkimal yüzey belirteçlerinin varlığı ve hematopoetik yüzey belirteçlerinin yokluğunda, ve mezodermal geçmesi (3) kapasitesi de dahil olmak üzere standart MSC kriterlerine ^16, uygun olmasını sağlamak için karakterize olmalıdır farklılaşma.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Plasental MKH plastik yapışık.
Şekil 4'te gösterildiği gibi, kültürde MSC'ler yapışan plastik bir fibroblastik-şeklinde bir yapıya sahiptir; Bu hücreler MSC ¹⁶ tanımlayan ilk kriterlere uygun olduğunu doğrular.

Plasenta MSC ekran mezenkimal yüzey belirteçleri.
Ikinci tanımlama MSC özelliği mezenkimal yüzey belirteçleri varlığı ve hematopoietik yüzey markörlerinin ¹⁶ yokluğudur. kesin bir MSC belirleme yeteneğine sahip tek bir işareti de olduğu gibi belirteçlerin panelleri genellikle ancak hematopoietik, mezenkimal olan hücreleri tespit etmek akış sitometri analizi ile bağlantılı olarak kullanılır. Burada sağlanan Örnek veri seti (Şekil 5A), biz mezenkimal belirteçleri CD73, CD105, CD90, CD146 ve CD44, hematopoietik belirteçleri CD45 CD34 ve HLA-DR, wel olarak hücre ifadesi değerlendirildiendotel işaretleyici CD31 olarak l. Bu plasental MSC karakterizasyonu işleminde kullanılan antikorların tüm Malzemeleri / Ekipman tabloda listelenmiştir. Burada ¹⁹ anlatılan analiz yöntemleri ile, üretici talimatlarına uygun olarak boyama yapılmıştır.

^5,20 beklendiği gibi hücreler, mezenkimal belirteçleri CD73, CD105, CD44, ve hücre yüzeyi işaretçileri CD45, CD34, HLA-DR ve CD31 negatif pozitifti. Yaklaşık% 37 ve temsilcimiz veri setinde hücrelerin% 57 sırasıyla, CD90 ve CD146 ²¹ pozitifti. CD90 ve CD146 Hem yaygın MSC ²¹ işaretleme kalemler kullanılır. MSC hücre yüzey işaretleyici profilleri MSC doku kaynağı, orta kompozisyon, veya geçit sayısı ²² bağlı olarak farklı olabilir. tecrübesi uzun yıllar, biz 1-2 p aşağıdaki olmayan mezenkimal hücreler ile plasental kaynaklı MSC uzun vadeli kontaminasyonu gözlenen değilassages ^5,11.

Plasenta MSC ekran mezenkimal farklılaşma potansiyeli
Tanım olarak, MSC in vitro mezodermal farklılaşma kapasitesi ^5,13 sahip olmalıdır. Mezodermal farklılaşma potansiyeli yaygın tri veya iki soy farklılaşma deneyleri ya değerlendirilmektedir. tri-soy deneyleri ayrıca kondrojenik farklılaşma kapasitesinin değerlendirilmesi sırasında Bi-soy analizleri genellikle osteojenik ve adipogenic farklılaşma kapasitesini değerlendirmek. Burada yer alan Örnek sonuçları olarak, genişletilmiş MSC popülasyonu her iki osteojenik farklılaşma gösterge kireçlenme, ve lipid hücre arası boşluklar, adipogenesis gösterge (Şekil 5B) oluşturmak göstermektedir.

Burada bildirilen MSC popülasyonları için, indüksiyon ortamı, 1 ml 6 x 10 ⁴ hücre 24 kültür kuyulara hücreleri tohumlanır. orta bileşimalınan parçaları Malzemeleri / Ekipman tabloda listelenmiştir. endüksiyon ortamı formülasyonlar literatürde yaygın olsa da, geçme formülasyonlarda önemli farklılıklar vardır. Bu nedenle kısaca burada bizim indüksiyon orta formülasyonları ve boyama yaklaşımları listeler. Osteojenik endüksiyon ortamı DMEM-HG,% 10 FBS, 1 x antibiyotik antimikotik solüsyon, 10 mM β-gliserol Fosfat, 100 nM deksametason ve 50 uM L-askorbik asit 2-fosfat içermektedir. Adipojenik endüksiyon ortamı DMEM-HG,% 10 FBS, 1 x antibiyotik antimikotik solüsyon, 10 ug / mL arasında insülin, 100 nM deksametason, 200 uM indometasin, 500 uM 3-izobutil-1-metil ksantin ihtiva etmiştir. Burada, kültürler 37 ° C,% 5 _CO2 kuluçka makinesi içinde tutulmuştur ve 14 gün süreyle kültüre edildi. İndüksiyon ortamı, kültür süresi boyunca haftada iki kez değiştirildi. indüksiyon 14 gün sonra, kültürler eden prev göre, kemik benzeri bir matris (osteojenez) ya da lipid vakuol (adipogenesis) başına karakterize edilmiştirious yayını ^5. Osteojenik kalsiyum matriks birikimi analiz önce, orta aspire 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile kültürleri sabitleme DPBS ile tek tabaka yıkama ve daha sonra, imalatçının talimatına göre, Alizarin Kırmızısı S ile boyama ile elde edilmiştir. Adipojenik endüksiyon, üretici talimatlarına göre, Yağ Kırmızı O solüsyonu ile, orta aspire 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile kültürleri sabitleme tek tabaka yıkama ve boyama ile değerlendirildi. Vitray kireçlenme ve yağ vakuoller sonra ışık mikroskobu ile görüntülendi ve görüntüler ileride başvurmak için kaydedildi.

Önceki yayınlarda, biz daha yaygın ^4,5'ten plasental kaynaklı MSC farklılaşma potansiyelinin nitelendirmiştir. Adipogenesis plasental türetilmiş MSC ^5, genel olarak daha az etkili iken, plasental türetilmiş MSC osteogenez ^<, kemik iliği kaynaklı MSC benzer/ Sup>. Bu daha önce plasental-MSC ⁵ için bizim tarafımızdan bildirilmiş olmasına rağmen, rutin, birçok nedenden dolayı kondrojenik farklılaşma yürütmek yoktur. Mezodermal farklılaşma kapasitesi MSC belirleyici bir özelliği ise Birincisi, terapötik yararı MSC parakrin salgıları ²⁶ türetilmiş olması muhtemeldir özellikle burada, ikincil öneme ^23-25 ​​muhtemeldir. Dominici ve ark., Insan yetişkin kemik iliğinden türetilmiş MSC ^16, klinik üretimi için en az kriterleri önerilen, ancak farklı niş Farklı doğal özellikleri ve farklılaşma yetenekleri ^5,13,27-32 sahiptirler İkinci olarak, daha yeni çalışmalar, MSC göstermektedir. Aslında, Parolini ve ark., Plasenta türevi MSC "bir veya daha fazla mezodermal" soy yerine üç soyları ¹⁰ farklılaşırlar gerektiğini önerdi. benzer bir yoluyla gerçekleşir Son olarak, bir çok MSC çalışmaları kondrojenik farklılaşma dahilosteogeneze olarak hücre içi sinyal yolu (TGFβ aile yolu) ^33-35.

Plasental MSC başlangıç ​​malzemesinin anatomik konuma rağmen, bu kültür yöntemi kullanarak kökenli anne bulunmaktadır.
Birçok yayın hücreler kültür ¹⁴ üzerine fetal koryon verimi cenin MSC izole olduğunu varsayalım. Daha önce ⁵ rapor ettiği gibi, ancak, bütün kültürlerin hızlı sezgisel anne desidual MSC kültürleri için beklenir gibi maternal MSC zenginleşir bu protokolü kullanılarak fetal koryon türetilen. kolayca genişletilmiş hücre popülasyonları fetal ve maternal hücre katkısını tanımlamak için mümkün olduğunu bu yüzden bu temsilcisi sonuçları biz erkek bebeklerden plasenta dokusu kullanılır. Bu çalışmalar için biz Malzemeleri / Ekipman Tablosu'nda listelenen XY BALIK kiti kullanılan ve üreticilerin talimatlarına.

(Şekil 6) . geçit 2 ile, maternal doku türetilen hücre popülasyonları (XX) ~% 100 anne hücreler ve fetal hücreler, (XY) tespit edilememiştir. Bu anne dokusunun fiziksel diseksiyon sonraki kültürlerde anne hücrelerin zenginleşmesine yol açtığını göstermektedir. Ancak, fetal koryonik villus ve koryon plaka kaynaklı kültürlerden gelen kültür sonuçlarını dikkate almak önemlidir. Geçit 0 anda, fetal koryonik villus ve koryon hem plaka elde edilen kültürler hedeflenen diseksiyon fetal hücreleri (Şekil 6) için zenginleştirilmiş belirten ~% 85 XY, veya fetal kökenliydi. geçit 0, her iki kültür ~% 15 anne hücre (XX) kontaminasyon ihtiva etmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, geçit 2, her iki cenin kültürler ~% 100 anne hücreleri (XX) ve fetal hücreler (XY) ile doldurulanartık tespit edildi. XY FISH analizi anne hücreleri (XX kromozomları) hızla ve sürekli devir kültürleri fetal koryonik dokulardan elde edilen ortaya koymaktadır. Bu durum genellikle ⁵ gözden kaçan önemli bir kültür gözlemdir. o DMEM fetal kaynaklı nüfusu desteklemek için tasarlanmış ek faktörler olmadan kullanılırsa% 10 FBS ile desteklenmiş zaman anne hücreleri hızla tüm kültürleri doldurmak çok önemli bir gözlem göstermektedir çünkü bu analizin ayrıntı bu protokolde yer almaktadır.

Şekil 1:. Plasental MSC izolasyon prosedürü Özeti (Adım 1) plasenta anatomisi ile kendinizi yolunuzu. (Adım 2) El desidua, koryonik villus veya makas kullanarak koryonik plaka birinden doku 10 gr teşrih. (Aşama 3) Kıyma to makas veya neşter ile ince parçalar halinde desidua, koryonik villus veya koryon plaka dokuların bölümlerini disseke.
(Aşama 4) dispaz ve kolajenaz I'de 1-2 saat sindirimi yoluyla küçük parçalar hücreleri kurtarmak
(Aşama 5) darbe santrifüj ve / veya bir hücre süzgecinden yıkayarak fibröz doku hücreleri ayırın. Toplayın ve kültür ortamında hücreleri tekrar süspansiyon ve kültür şişelerine konuldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Mezenkimal stromal hücreler (MSC), plastik yapışma ve hayatta ve kültür ortamında çoğalma kapasitesi eğilimleriyle göre seçilecektir. Son olarak, sonuçlar bölümünde genişletilmiş MSC karakterize edilebilir ve ileride deneylerde kullanılmak üzere saklanır.

Şekil 2:. Bu prosedür izole insan vadeli plasenta ve dokuların anatomisi hasat ilk doku anne desidua olduğunu. Desidua o (desidua yeşil belirteçleri ile tanımlanır) uterus duvarından döken sonra plasentanın yüzeyinde ince bir tabaka halinde kalır dokudur. Plasentanın iç hasat edilecek ikinci doku fetal koryonik villus (mavi belirteçler) 'dir. Hasat edilecek üçüncü doku (referans ³⁶ uyarlanmıştır) fetal koryonik plaka (kırmızı belirteçler) 'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: 48 saat izolasyon ve yeniden sonrasında kültürlerin Morfolojidoku artıkları hareketli. (A) kültür yüzer görünümü artıkları kapalı yıkamadan önce plasenta donörler arasında önemli ölçüde değişebilir. Örnek kültürleri 1 ve 2, bu değişimi göstermektedir. Bu iki izolasyonlar aynı anda gerçekleştirilen, ancak iki farklı plasenta gelen bulundu. daha sonra genleşme sonucu, genel olarak tutarlı Örnek 3'te gösterildiği gibi, bir kez yıkandı, kültür eritrosit ve doku enkaz açıktır. 48 saat ortam değiştirildikten sonra (B), sadece bir kaç hücre şişeye eklenir. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. Zaman MSC kültürlerin morfolojisinin (A) izolasyondan sonra yedi gün sonra küçük bir folmayan MSC hücreleri de yuvarlak veya gevşek bağlı hücreler olarak mevcut olacaktır, ancak ibroblastic MSC koloniler görebilir. (B) izolasyondan sonra 13 gün, fibroblastik MSC kolonileri büyük ve sık sık MSC tek tabakalı birleşen ve geçit hazırdır. Geçit 2 itibaren itibaren (C), MSC tek tabaka izdiham karakteristik girdap gibi morfoloji gelişecektir. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5:., Akış sitometrisi ve mezodermal farklılaşma MSC karakterizasyonu (A), plasental koriyonik villi türetilmiş MSC Akışkan sitometri analizi ile klasik bir MSC markör profili gösteren bu hücre yüzey markörleri için, her ne kadar Expression insan MSC her türlü benzer. Her histogram, y-ekseni (maksimum% 'si) normalize hücre sayısı karşısında sinyal yoğunluğu (x-ekseni) gösterilmektedir. belirlenen bu temsili veriler hücreler hematopoetik belirteçler CD45 ve CD34 ve HLA-DR CD73, CD105 ve CD44 pozitif ve negatif idi. (B) Plasental MSC Ancak genel (C) adipojenik farklılaşma kemik iliği kaynaklı MSC ile daha az etkili olabilir, sağlam bir osteojenik farklılaşma tabi tutulur. Başlıkları B ve C Görüntüler 40X büyütmede alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6: Plasental MSC başlangıç ​​malzemesinin anatomik konuma rağmen, bu kültür yöntemi kullanarak kökenli anne bulunmaktadır.araziler, fetal (erkek, XY) ve maternal her saniye geçit de desidual, koryonik villus ve koryon plaka dokularından izole plasental MSC kültürlerin (dişi, XX) hücre kompozisyon ölçümü gösterir. Anne hücreleri (XX) hızla ve tekrarlanabilir fetal koryon dokulardan elde edilen kültürler devralacak. Fetal = erkek = Tek bir hücrenin tespit XY kromozom, tek bir hücre tespit anne = kadın = XX kromozomları. Burada sunulan veriler, XY FISH için boyandı ve her bir veri noktası için sayılan 100 hücre, minimum bir erkek bebeklerde N = 3 bağımsız verici plasenta oldu. Barlar ortalamasını temsil etmektedir ve hata çubukları, bir standart sapma yansıtır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Plasenta, fetal veya maternal MSC ²² izole edilebildiği bir fiziksel büyük Fetomaternal organdır. Burada, özellikle desidua (anne), koryonik villuslar (cenin) ve koryonik plaka (fetal) doku (2.2-2.4 Adım) incelemek için nasıl plasental anatomi ve öğretim detaylı bir bakış sağladı. Daha sonra, bu üç dokuların (2.5-2.6 Adım) her birinden MSC izolasyon sağlayan güçlü bir protokol özetlenen. Plasental MSC genişletme etkilidir ve kültürler, kemik iliğinden türetilmiş MSC kültürleri (Şekil 3 ve 4) benzer şekilde görünür. Adipojenik farklılaşma, genellikle (Şekil 5C) ⁵ daha az etkili iken, osteojenik farklılaşma, (Şekil 5B) güvenilirdir.

alanına birçok yeni gelenler fetal koryonik villus veya koryon plaka dokulardan elde edilen kültürler fetal MSC için zenginleştirilmiş olacağını tahmin edecektir. Ancak, elimizde fetal hücre zenginleştirme sadece geçici olduğunda böyle DMEM-LG + gibi standart MSC genişleme orta FBS ⁵ kullanılmaktadır% 10. Burada bir erkek bebek türetilmiş plasental dokular kullanılarak temsilcisi sonuçlar vermektedir. Anne hücreleri XX kromozom sahip olarak tanımlanabilir ise bir erkek bebeğin plasenta dokusu kullanılarak, fetal hücreler, kolayca identifiably XY kromozom sahip gibidir. 6 temsili kültür için XY FISH sonuçlarını göstermektedir. Fetal MSC (XY) fetal koryonik villus veya koryon plaka dokulardan elde edilen ilk kültürlerinde (% 80 kadar) zenginleştirilmiş ise, bu aynı kültürleri hızla ilk iki pasaj üzerinde (~% 100) maternal tarafından (XX) MSC sollandığınızda . Standart bir ortamda, DMEM-LG +% 10 FBS, fetal dokular kültür fetal türetilmiş hücreler outcompete kontamine birkaç anne kaynaklı MSC oluşan.

Bu protokolde belirtilen kritik bir adım plasental anatominin ve nerede fetal bir takdir olduğunuve anne doku en etkili hasat edilebilir. temsilcisi sonuçları bölümünde belirtildiği gibi, fetal doku diseksiyonu, fetal kaynaklı MSC için geçici zenginleştirme izin yok. genişleme orta formülasyonunda Gelişmeler, belirli eksojen büyüme faktörü ortamı desteği ile fetal kaynaklı MSC popülasyonlarının seçici genişleme izin ve (bizim grup şu anda böyle orta formüller geliştiriyor) fetal ziyade anne hücreleri için zenginleştirilmiş bir hücre ürün üretimi olmalıdır. Fetal MSC daha anjiogenezisi ve eşdeğer anne MSC nüfus ³⁷ daha immünosupresif özelliklere sahip sözde olarak fetal MSC nüfus imalatı, bir çok avantaj olabilir.

tarif edilen izolasyon protokoller her birinde, doku yaklaşık 10 g kullanılır. Bütün bir plasenta genellikle 500-750 gr olup, önceki çalışmalarında biz göstermiştir ki otomatik dokuda sindirimi ve bir hücre genişleme biyoreaktör proc yoluylamümkün olmalıdır esses tek plasenta ^4'ten 7.000 'den fazla klinik hücre dozları üretmek için. Bu sayılar ne olursa olsun (fetal veya maternal) MSC kökenli plasental kaynaklı allojenik MSC terapiler MSC ve bu yöntemin önemi potansiyel uygunluğunu vurgulayın. Terapötik açıdan bakıldığında, kullanıcıların hücre ürünü ve güvenilir bu hücre ürün üretimi için kapasite tam bir anlayışa sahip olduğunu en kritiktir. Bizim video plasenta anatomisini anlamaya plasenta MSC izole ve onların kültürlerinin olası fetal veya maternal hücre bileşimini tahmin araştırmacıların yardımcı olacağını umuyoruz.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifler< / güçlü >
HBSS	Gibco / Invitrogen	14185-052	Uzun adı: Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi
FBS	Gibco/Invitrogen		Uzun adı: Fetal Sığır Serumu
tripsin ikamesi	Gibco/Invitrogen	12563-029	Kısa adı: TrypLE Select
DMEM-LG	Gibco/Invitrogen	11885-092	Kısa adı: Dulbecco' s Modifiye Eagles Orta-Düşük Glikoz
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Uzun adı: Dulbecco' s Modifiye Eagles Orta-Yüksek Glikoz (4.5 g / L)
PBS (Mg + Ca + içermez)	Gibco / Invitrogen	14190-250	Uzun adı: Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salin, magnezyum ve kalsiyum içermez
Anti-anti-Gibco	/ Invitrogen	15240-062	Uzun adı: antibiyotik-antimikotik çözelti x100
paraformaldehit tozu veya% 4 çözelti	any
Kollajenaz I	Invitrogen	17100-017	2.500 U/ml
Dnase I	Sigma	D5025	10 mg / ml in  0.15 M NaCl
Dispase	Invitrogen	17105-041	10 mg / ml su içinde (20.000 U / ml).
Malzeme< güçlü > <	güçlü > Şirket< / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü > Tek kullanımlık: < / güçlü >
50 ml santrifüj tüpleri	Falcon veya herhangi bir marka
petri kabı, steril plactic (25 cm ve 10 cm çap)	Nunc
Hücre süzgeçleri (100 μ m)	Becton Dickinson	352340
175 ve 75 cm 2< / sup> (T175 ve T75) doku kültürü şişeleri	Nunc
5 ml, 10 ml, 25 ml steril seroljik pipetler	herhangi bir marka
Malzeme< / güçlü > <	güçlü > Şirket< / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Yorumlar< / güçlü
>< güçlü > Ekipman: < / güçlü>
nbsp; Santrifüj
Doku Kültürü İnkübatörü 37 & derece; C,% 5 CO2< / sub>
Biyolojik güvenlik kabini
Steril makas ve cımbız
Tüp rafları
Pipet-boy veya eşdeğeri
Gilson tipi pipetleyiciler ve steril uçlar 1.000 & mikro; l, 200 ve mikro; l, 20 &l.
sallanan veya sallanan inkübatör (37 & derece; C)
kişisel koruyucu ekipman
temizleme solüsyonları (kan için uygun)
atık konteynerleri, doku / kan
MSC karakterizasyonu için reaktifler< / güçlü >
< güçlü > Antikor (Klon Kimliği) < / güçlü>	Üretici< / strong>	Katalog No.< / strong>	Isotype< / strong>
CD73 (AD2)	Miltenyi Biotec	130-095-183	Fare IgG1
CD105 (43A4E1)	Miltenyi Biotec	130-094-941	Fare IgG1
CD90/Thy-1 (AC122)	Miltenyi Biotec	130-095-403	Fare IgG1
CD45 (5B1)	Miltenyi Biotec	130-080-202	Fare IgG2a
CD34 (AC136)	Miltenyi Biotec	130-090-954	Fare IgG2a
HLA-DR (AC122)	Miltenyi Biotec	130-095-298	Fare IgG2a
CD31 (PECAM-1)	BD Pharmingen	555446	Fare IgG1
CD146 (541-10B2)	Miltenyi Biotec	130-092-849	Fare IgG1
CD44 (DB105)	Miltenyi Biotec	130-095-180	Fare IgG1
İzotip Kontrolleri (Klon Kimliği)	Üretici	Katalog No.
Mouse IgG1 İzotipi (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-214
Fare IgG1 İzotipi (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-212
Fare IgG1 İzotipi (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-213
Fare IgG2a (S43.10)	Miltenyi Biotec	130-091-837
Fare IgG2a (S43.10)	Miltenyi Biotec	130-098-849
MACS Tamponu	Miltenyi Biotec	130-091-221
Osteojenik farklılaşma	Üretici	Katalog No.
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Uzun adı: Dulbecco' s Modifiye Eagles Orta-Yüksek Glikoz (4.5 g / L)
FBS	Gibco / Invitrogen		Uzun adı: Fetal Sığır Serumu
Anti-anti-Gibco	/ Invitrogen	15240-062	Uzun adı: antibiyotik-antimikotik çözelti x100
Deksametazon	Sigma	D4902
ve beta; -Gliserol Fosfat	Sigma	50020
L-askorbik asit 2-fosfat	Sigma	A8960-5G
Alizarin Kırmızı S	Sigma	A5533-25G	Kalsiyum matris boyama için
Adipojenik farklılaşma< / güçlü>	Üretici< / güçlü>	Katalog No.< / güçlü >
DMEM-HG	Gibco / Invitrogen	11965118	Uzun adı: Dulbecco' s Modifiye Eagles Orta-Yüksek Glikoz (4.5 g / L)
FBS	Gibco / Invitrogen		Uzun adı: Fetal Sığır Serumu
Anti-anti-Gibco	/ Invitrogen	15240-062	Uzun adı: antibiyotik-antimikotik çözelti x100
insülin	Sigma	I2643
Deksametazon	Sigma	D4902
İndometasin	Sigma	I7378
3-izobütil-1-metil ksantin	Sigma	I5879
Yağ Kırmızı O çözeltisi	Sigma	O1391-250ML	Lipid vakuol boyama için
hücrelerin fetal veya maternal kökenini belirlemek için FISH kiti< / güçlü >
XY homozom FISH kiti	Vysis (Abbott Moleküler)	07J20-050	Uzun adı: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Doğrudan Etiketli Floresan DNA Prob Kiti