Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için

10.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54210

⸱

6 Temmuz 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Bu makalede

Özet

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Özet

Coxiella burnetii, Q humması etkeni bir yineleme niş kurmak Tip IV Dot / ICM Salgı Sistemi dayanan bir hücre içi patojen olduğunu. efektör kohort ana işlemleri değiştirmek ve replikasyon için benzersiz bir lizozom türetilmiş vakuol kurulmasına izin vermek için konakçı hücreye Bu sistem sayesinde transloke edilmiştir. özgü gen siRNA kullanarak susturma ve β-laktamaz aktivitesinin dayanan bir FRET tabanlı substrat kullanılarak efektör translokasyon ölçümü: Burada sunulan yöntem, iki köklü teknikleri kombinasyonunu içermektedir. Bu iki yaklaşım uygulamak, bakteriyel salgı sistemi fonksiyonu ve efektör translokasyon ev sahibi faktörlerin rolünü anlamaya başlayabiliriz. Bu çalışmada, Rab5A ve Rab7A hem endositik trafik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir rolü incelenmiştir. Bu efektör translocatio bir azalma ya da proteinleri de ekspresyonunu susturma göstermektedirn verimlilik. Bu yöntemler de kolayca salgı sistemlerini kullanan diğer hücre içi ve hücre dışı patojenlerin incelemek için modifiye edilebilir. Bu şekilde, bakteriyel efektör translokasyon katılan ana faktörler hakkında genel bir tablo ortaya çıkarılabilir.

Giriş

Coxiella burnetii zoonotik insan enfeksiyon Q ateşe neden benzersiz bir hücre içi patojen olduğunu. Bu hastalık asemptomatik serokonversiyon sıklıkla maruz sonra 1 endokardit yıl olarak tezahür hayatı tehdit kronik enfeksiyona uzanan klinik sunumlar geniş bir yelpazede ile ilişkilidir. İnsan enfeksiyon öncelikle geviş getiren, özellikle, süt inek, koyun ve keçilerde enfeksiyonu için önemli rezervuar, kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla gerçekleşir. Bu hayvanlarda Coxiella enfeksiyonu genellikle subklinik olmasına rağmen, enfeksiyon kürtaj tetikleyebilir ve doğum sıvısı ve plasentanın içinde hatırı sayılır bakteriyel yük yerel çevreyi 1 kirletebilir. Halk sağlığı ve tarım sektöründe hem son zamanlarda Hollanda'da 2 meydana gelen Q humması salgını gözlendi üzerinde büyük bir yük gibi bir kontaminasyon örneğidir olabilir. 2007 ve arasında2010 Q humması 4.000 'den fazla insan vakası teşhis edildi ve bu salgın keçi çiftlikleri 3 önemli kirlenme bağlıydı. Ayrıca, Coxiella şiddetli morbidite ve mortaliteye 4 neden bakteri ve gerekli düşük bulaşıcı dozun çevresel istikrara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sınıflandırılmış olarak, bir potansiyel biyolojik silahtır.

Coxiella iki aşamada vardır: doğal kaynaklardan izole Faz I organizmalar, son derece öldürücü ve Faz II organizmalar yüksek in vivo zayıflatılmaktadır. Örneğin, Coxiella burnetti dokuz Mile Faz I organizmaların çeşitli in vitro geçiş sonrası, Faz II bakteri kesik lipopolisakarit ile sonuçlanan geri dönüşü olmayan bir kromozom silme içeren üretildi (LPS) 5. Bu suş, C. burnetii NMII, doku kültürü modelleri I Faz fenotipik benzer ve daha güvenli bir modu sağlarAraştırmacılar laboratuvarlarda 5 Coxiella hastalık oluşumunun incelenmesinde l. Son yıllarda birçok atılımlar hızla Coxiella genetik alanında gelişmiş var. En önemlisi, aksenik ortam geliştirilmesi (sitrat sistein orta asitleştirildi - ACCM-2) hem sıvı ve katı ortam 6,7 ile Coxiella hücresiz büyüme sağlamıştır. Bu uyarılabilir gen sentezleme sistemi için, mekik vektörleri ve rasgele transpozon sistemleri 8-11 de dahil olmak üzere Coxiella için genetik araçlar doğrudan gelişmeler ile sonuçlandı. En son, hedeflenen gen inaktivasyonu için iki yöntem de belirli virülans gen adayları 12 incelenmesi için önünü geliştirilmiştir.

Alveoler makrofajlar tarafından içselleştirilmesi ardından, Coxiella membrana bağlı bölme içinde yüksek sayılara çoğaltır vakuol (CCV) içeren Coxiella- adlandırılan. CCV konak endositik ticaretini inci gerektirirkaba erken ve geç endozomlar bir lizozom kökenli organel 13 içine olgunlaşır kadar. Bu süreç boyunca, CCV ya geçici görünür ya da dahil olmak üzere, vakuol ile ilişkili, ancak Rab5, Rab7, CD63 ve LAMP-13-15 Ocak, bunlarla sınırlı olmamak kalır konakçı faktörleri kazanır. Konak hücreleri içinde Coxiella çoğaltma tamamen işlevsel Dot / ICM Tipi IVB salgılanması Sistemi (T4SS) 8,16,17 tamamen bağlıdır. Bu salgı sistemi ancestrally konjugasyon sistemleri ile ilgili bir çok protein yapısı ve bakteriyel proteinler sunmak için hem bakteriyel ve vakuoler membranlar yayılan, ev sahibi sitoplazmada 18 içine, etkileyiciler olarak adlandırılan. Coxiella T4SS işlevsel Legionella pneumophila 19,20 iyi karakterize Tip IVB Nokta / ICM salgılama sistemine çok benzer. Coxiella asidik lizozom türetilmiş ulaşıncaya kadar İlginç bir şekilde, T4SS ve daha sonra efektör translokasyon aktivasyonu oluşmazorganel, yaklaşık 8 saat sonrası enfeksiyon 17,21. Bugüne kadar, 130 üzerinden Nokta / ICM efektörler 9,17,22-24 tespit edilmiştir. Bu etkileyiciler çoğu büyük olasılıkla konak hücreleri içinde Coxiella replikasyonu sırasında önemli rol oynamaktadır; Bununla birlikte, sadece bir kaç efektör işlevsel 25-29 karakterize edilmiştir.

Bu çalışmada, konakçı hücre sitoplazması içinde β-laktamaz aktivitesi ile (bundan sonra Bam alt-tabaka olarak da adlandırılır) CCF2-AM FRET alt-tabaka (Şekil 1) bölünmesi dayanan bir floresans bazlı translokasyon deneyi kullanmaktadır. ilgi konusu genin yapısal ekspresyonu sağlayan bir raportör plasmidi ile β-laktamaz (Bam)-1 TEM kaynaştırılır. Bam alt-tabaka, bir FRET çifti oluşturan iki florofor (kumarin ve floresein) oluşmaktadır. floresein ve efektör translokasyon yokluğunda yeşil floresan emisyon FRET içinde kumarin sonuçlarının Tahrik olma; Bununla birlikte, Bla halindeM-efektör füzyon proteini, konakçı sitoplazma içerisine doğru olan, elde edilen β-laktamaz aktivitesi böler uyarma aşağıdaki mavi floresan emisyon üretiminde FRET çifti ayırma Bam substratın β-laktam halkası. Bu translokasyon tahlil de C dahil olmak üzere farklı hücre içi ve hücre dışı bakterilerin bir dizi, efektör proteinleri tespit etmek bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır burnetti, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatojenik E. E. coli, Salmonella ve Brucella 17,30-35.

Coxiella efektör translokasyon belirli konak faktörlerinin rolünü belirlemek için biz özellikle küçük müdahale RNA (siRNA), RNA girişim olarak bilinen gen susturma için köklü bir yöntem kullanmaktadır. Başlangıçta Caenorhabditis elegans tespit RNA interferans doğal Defe için kullanılan korunmuş bir endojen hücresel süreçvirüslere karşı nse yanı sıra gen regülasyonu 36,37. Diziye özgü siRNA bağlanmasından sonra, mRNA degradasyonu özgü gen susturma ve demonte 38 elde (RNA-bağlı susturulması kompleksi) RISC yoluyla ortaya çıkar. Bu çalışmada, siRNA endositik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir, iki ana protein, Rab5A ve Rab7A, hedef için kullanılmıştır. Efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ve Rab7A susturma etkisi C. kullanarak tespit edildi burnetti pBlaM-CBU0077. Bir önceki Coxiella 17 Nokta / ICM salgılama sistemi transloke gösterilmiştir gibi CBU0077 seçildi.

SiRNA gen susturulması ve burada açıklanan fluorescencebased translokasyon tahlil hem kullanarak, biz Coxiella tarafından efektör proteinlerin translokasyonu konak faktörlerinin rol kurmaya başlıyor. Bu yaklaşım, benzer secretio sahip hem hücre içi ve hücre dışı bakterilerin geniş bir aralığına uygulanabilmektedirefektör protein translokasyonu sorumlu n sistemleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Coxiella burnetii RSA439 NMII büyümesini veya manipülasyon içeren tüm prosedürleri Fiziksel Muhafaza Seviye 2 Laboratuvar ve yerel kurallara uygun bir biyolojik güvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Aşağıda tarif ters transfeksiyon ve translokasyon tahlil iş akışı şematik diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir.

C 1. Hazırlık burnetti Kültür ß-laktamaz için (pBlaM-CBU0077) CBU0077 sigortalı ifade (1. GÜN)

  1. Hazırlayın 1X ACCM-2 6:
    1. Tablo 1 'de listelenen bileşenleri birleştirin. (Otoklav değil) 6 M NaOH ile 4.75 pH ve filtre sterilize ayarlayın. ACCM-2, 4 ° C'de saklanan, yaklaşık üç hafta boyunca stabildir.
  2. C oluşturmak burnetti pBlaM-CBU0077 stokları.
    1. C ile HeLa 229 hücreleri enfekte Büyük vacuol kadar pBlaM-CBU0077 ve geçit taşıyan burnetii suşuES hücrelerinin çoğunda görülmektedir.
      1. C büyümek % 5 CO2,% 2.5, O 2, 37 ° C 'de 7 gün süre ile havalandırılmış bir kap ile 75 cm2 doku kültürü şişesi içinde 20 mL ACCM-2 ihtiva eden 3 mg / ml kloramfenikol bölgesindeki pBlaM-CBU0077 taşıyan burnetii'nin soyu.
      2. C santrifüj oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü.
      3. Yeniden askıya +% 10 fetal dana serumu (FCS) + 3 | ig / ml kloramfenikol (bakım ortamı), 20 ml DMEM içinde pelet. HeLa 229 hücreleri% 50 konfluent 75 cm2 şişeye ortamı çıkarın. Ekle yeniden askıya C. HeLa 229 hücreleri burnetti. HeLa 229 hücreleri enfeksiyona izin% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 2 gün süreyle inkübe edilir.
      4. 175 cm 2 doku kültürü şişesi içine hücreleri bölün.
        1. 75 cm 2 balona ortamı çıkarın ve 10 ml önceden ısıtılmış PBS ile iki kez tek tabaka yıkayın.
        2. 1 mi O eklentif 3 37 ° C ±% 5 CO2 seviyesinde% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ve bir yer hücreleri - 5 dakika hücreleri ayırmak için.
        3. Bakım medya 10 ml hücrelerin yeniden askıya. Bakım ortamının 38 mi ihtiva eden bir 175 cm2 şişeye yeniden askıya hücreleri 2 ml ekle.
        4. % 100 konfluansa ulaşılana ve büyük vakuoller gözlenen kadar 5 gün - ilave 3% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Enfekte HeLa 229 hücreleri kapsar ve enfekte hücreleri lize etmek için 15 dakika boyunca inkübasyona 10 mi dH 2 O ekleyin 175 cm2 şişeye süpernatant toplayın.
    3. Oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da süpernatan ve lize hücreleri ve pelet birleştirin.
    4. Yeniden askıya 10 ml DH 2 O. pelet arka arkaya, 10 ml şırınganın en az 20 kez bağlanmış bir 23G iğne ile yeniden süspansiyon geçirilmesiyle daha Hücreleri,. 5 dakika boyunca 500 x g'de Pelet selüler artığın ayrılması için.
    5. çıkarın ve pelet yüzer 15,000 x g'de toplamak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca burnetti.
    6. C yeniden askıya DMEM +% 10 FCS burnetti ve 4 uyarınca bakteri sayısını ölçmek. -80 ° C de DMEM +% 10 FCS +% 10 dimetil sülfoksit (DMSO), kısım 50 ul stok mikrofüj tüplerine ve mağaza kullanılarak 1 x 10 9 genomları / mL'ye seyreltilir.
  3. C 20 ul ile önceden ısıtılmış ACCM-2 ihtiva eden 3 mg / ml kloramfenikol 10 ml inoküle havalandırmalı kapak ile 25 cm 2 doku kültürü şişesi içinde (-80 ° C'de saklanan 1.2 oluşturulan stoktan) burnetti pBlaM-CBU0077 streyn 17. % 5, 37 ° C 'de 7 gün süre ile, CO2,% 2.5, O 2 bakteri kültürü büyütün.

2. Ters SiRNA NAKLİ VE HeLa Tohum 229 Hücreler (GÜN 4)

  1. ilk kez deney siRNA kullanıldığında hazırlanmasısiRNA aşağıdaki gibidir:
    1. Kısaca SiRNA pelet tüpün dibinde toplanan sağlamak için liyofilize siRNA santrifüj.
    2. 1x siRNA tamponu (Tablo 2) uygun hacimde pipetleme 20 mcM son stok konsantrasyonu topak haline siRNA yeniden askıya.
    3. çözümü Pipet ve 3 aşağı - 10 dk - 5 kez tüp her 5 tersini, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir yörünge mikser üzerinde karıştırmak ve yer için.
    4. Kısaca SiRNA tüpün alt kısmında toplanır emin olmak için tüp santrifüj.
    5. gerekene kadar -20 ° C'de mikrofüj tüpleri ve deposunda 50 ul alikotları siRNA kısım.
    6. gerektiğinde siRNA konsantrasyonunu çalışma 1 mcM oluşturmak için, pipet 1X siRNA 950 ul 50 ul kısım stokunun (20 uM) içine tampon. Not: Bu, 1 uM çalışma konsantrasyonu tekrar Transfeksiyonlar için birden çok kez dondurularak çözülmüş olabilir.
  2. DMEM +% 10 FCS yerleştirin30 dakika süre ile 37 ° C su banyosu (veya eşdeğeri) içinde% 0.05 tripsin-EDTA ile yıkandı ve PBS kullanımdan önce ısınmaya.
  3. Transfeksiyon bileşenlerinin hazırlanması:
    Not: Aşağıdaki protokol siyah duvarlar ve düz, şeffaf dipli, 96 oyuklu bir mikro-HeLa 229 hücreleri optimize edilmiştir. transfeksiyon reaktifi miktarı optimizasyonu, hücre siRNA'nın konsantrasyon ve tohum yoğunluğu farklı hücre hatları için gerekli olabilir.
    1. Her bir 0.1 ul transfeksiyon reaktifi kullanım için, 15.9 ul indirgenmiş serum orta ve 1 uM siRNA (40 nM nihai siRNA konsantrasyonu oluşturur) 4 ul (minimum temel ortam Malzemelerin Tablo bakınız Transfeksiyonlar için kullanılır). OTP, PLK1, Rab5A ve Rab7A için ayrı mikrofuge'de tüpleri kullanın. üç kez, her deney durumu ölçülür. 96 oyuklu bir plaka taslağına bir örneği, Şekil 3'te gösterilmiştir.
      Not: OTP ve PLK1: Bu protokol iki denetim kullanımını içermektedir. OTP isehedef dışı etkilerini azaltmak için optimize edilmiştir ve bu nedenle OTP negatif olmayan hedefleme kontrol olarak kullanılır dört toplanmış SiRNA oluşmaktadır. Şifreli siRNA bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. pro-apoptotik yollar uyarılması ve bu nedenle PLK1 siRNA hücre ölümü transfeksiyon verimi ilişkilidir transfeksiyon için pozitif kontrol olarak kullanılan hücre hatları, bir dizi geniş hücre ölümüne PLK1 ifade sonuçlarının kaybı.
      1. Her deneysel siRNA Transfeksiyon için, bağımsız bir mikrofüj tüpü içinde 0.4 ul transfeksiyon reaktifi 63.6 ul indirgenmiş serum ortamı birleştirir. Tüm mikrofüj tüpler ve oda sıcaklığında 5 dakika için karmaşık bileşenler izin vorteksleyin.
      2. transfeksiyon kompleksi ihtiva eden karşılık gelen mikrofüj tüplerine her deney siRNA 16μl ekleyin. Vorteks ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Not: 30 dakika aşmamak önemlidir, transfeksiyon verimi düşecektir olarak.
  4. 20 dk inc sırasındaubation (2.3.1.2), 20 transfeksiyon reaktifi ul + indirgenmiş serum ortamı ilave + siRNA steril, siyah düz, şeffaf dipli, 96 gözlü tepsi uygun kuyulara karıştırın.
  5. En kısa zamanda 20 dakika kuluçka süresi, tam tohum / oyuk 229 hücreleri, 3.92 x 10 3 hücre yoğunluğunda HeLa gibi.
    1. Hasat HeLa önceden ısıtılmış DMEM konfluent veya alt konfluent 75 cm 2 doku kültür şişesi 229 hücreleri% 10 FCS ve standart yöntemlerle göre 4,9 x 10 4 hücre / ml bir nihai yoğunluk için hücrelerin yeniden askıya. Verimlilik tehlikeye atmayacak transfeksiyon sağlamak için, 20 dakika kuluçka dönemi (2.3.1.2) sırasında hücreler hazırlamak.
      1. önceden ısıtılmış 10 ml PBS ile 229 hücreler iki kez HeLa tek tabaka yıkayın.
      2. 5 dakika hücreleri ayırmak için 3 - 37 ° C ile + 5% CO2% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ve yeri, HeLa 229 hücreleri 1 ml ilave edilir.
      3. Önceden ısıtılmış, DMEM +% 10 FC 9 ml hücreleri toplamakS, bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı ve DMEM +% 10 FCS ile 4.9 x 10 4 hücre / ml'lik bir son yoğunluğa hücreleri hazırlamak.
    2. Transfeksiyon reaktifi + indirgenmiş serum ortamı + siRNA karışımı içeren her kuyuya 229 hücreleri, 4.9 x 10 4 hücre / ml yoğunlukta HeLa Pipet 80 ul. Bu / oyuk 3.92 x 10 3 hücre, bir hücre yoğunluğuna karşılık gelir.
      Not: Arka çıkarma Bam alt-tabaka için gereklidir.
      1. Hücreleri veya siRNA katmayın için "boş" kuyular (Şekil 3). Bunun yerine, üç kopya halinde kuyulara DMEM +% 10 FCS, 80 ul ekle.
    3. 37 ° C ile + 5% CO2 seviyesinde 24 saat süre ile inkübe edilir.

3. Değişim Medya (GÜN 5)

  1. 24 saat sonra, çok kanallı bir pipet ile bir vakum kaynağına veya el bağlanmış bir çok kanallı adaptörü kullanarak ortamını çıkarın ve taze Prewarm 100 ul ile yerineEd DMEM +% 10 FCS.
  2. 37 ° C +% 5 CO2 seviyesinde ilave bir 48 saat daha inkübe edilir.
  3. Bu noktada, görsel olarak, standart bir ışık mikroskobu kullanılarak hücrelerin canlılığı kontrol. Arka transfeksiyon başarılı olursa, çok hücre ölümü OTP siRNA ile karşılaştırıldığında PLK1 siRNA içeren kuyucuklara gözlenecektir.

QPCR kullanarak Niceleme Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Uzama 4. (GÜN 7)

  1. 10 mi C CO2,% 2.5 O 2 (1.3), santrifüj,% 5 37 ° C'de ACCM-2 büyüme 7 gün sonra oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü.
  2. Önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS, 10 ml bakteriyel pelet yeniden askıya. 1:10 ve 1 hazırlayın: DH 2 O. kullanarak kültür (örnek) 100 dilüsyonları
  3. qPCR için gerekli bileşenleri ayarlayın.
    Not: gDNA ekstraksiyon önceden yapılmış ve -20 ° C UNT saklanabiliril gereklidir.
    1. standart hazırlanması:
      1. 7 gün, üreticinin talimatlarına göre, bir gDNA ekstre etme kiti kullanılarak% 5 CO2,% 2.5 O 2, 37 ° C 'de ACCM-2 yetiştirilen Coxiella burnetti RSA439 NMII yabani tip suştan gDNA'sından ekstrakte edin.
      2. 260 nm 'lik bir emişteki NanoDrop (ya da eşdeğeri) kullanılarak gDNA konsantrasyonu (g / ml) ölçülür.
      3. Aşağıdaki aşağıdaki formül kullanılarak ul başına genom kopya sayısını hesaplayın ve genomları / ml sayısına dönüştürmek.
        figure-protocol-1
      4. DH 2 O kullanarak yeni bir mikrofüj tüpe (100 ul'lik bir son hacim içinde) 10 9 / ml genomları / ml sayısını ayarlama Bu 10 dakika süre ile kaynatıldı ve gerekene kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      5. Enfeksiyonun gün, 10 9 genomundan 10 5 genomlar / ml 10 8 genomları / ml 10-kat seri dilüsyonları oluşturmaks / ml stok.
        1. Pipet dH 2 O 90 ul halinde 10 9 genomları / ml, 10 ul 10 8 genomları / ml üretir. Vortex karıştırın. Pipet dH 2 O 90 ul halinde 10 8 genomları / ml, 10 ul 10 7 genomları / ml üretir. 10 5 genomları / ml kadar Vortex ve tekrarlayın.
    2. qPCR reaksiyonu ayarlayın. 25 kuyu herhangi bir pipetleme hataları hesaba katmak için bir master karışımı oluşturun. Her biri için de, 10 ul qPCR Master Mix kullanın; OmpA primer karışımının 2 ul (4.3.2.2) ve dH 2 O 3 ul
      Not: OmpA C'lik bir dış zar proteinidir Daha önce tarif edildiği gibi 40 burnetti '39 ve yüksek oranda korunan bir bölge içinde, bir 82-baz-çifti bölümü bir prob olarak kullanılmak için seçilmiştir.
      1. Her standart (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 genomları / ml) ve örnek (1 ayarlayın:10 ve 1: 100 seyreltme) 96 gözlü PCR sırasıyla iki kopya ya da üç kopya halinde) (Non-etekli plaka yırtılacak. Uygun oyuklara numune veya standarda 5 ul ekle.
      2. (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') ve ters primer OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') 4 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar, ompA ileri primer hem de seyreltik aynı mikrofüj tüpü içine birleştiren, DH 2 O kullanılması.
        Not: ompA primer karışımı önceden hazırlanmış ve gerekene kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      3. 250 ul qPCR Master Mix, 50 ul ompA primer karışımı, 75 ul dH 2 O ve karıştırmak için girdap birleştirin. standartları veya numune ya içeren kuyulara bu ana karışımı 15 ul ekleyin.
      4. Her şeyi sağlamak için PCR tüpleri tüplerin alt toplanır uygun kuyulara ve nabız santrifüj üzerine 8-kapak PCR şerit kapakları yerleştirin.
      5. Bir kantitatif PCR ma aşağıdaki program kurmakÇin: 1 saniye 95 ° C'lik 45 döngü, 20 saniye (Şekil 4A), 60 ° C'de, ardından 2 dk, 10 dakika boyunca 95 ° C, 50 ° C.
    3. qPCR dan Ct (döngüsü eşik) değerleri analiz:
      1. Programın ihracat işlevini kullanarak bir elektronik tabloya Ct değerleri aktarın.
      2. 9 ila 10 genomları / ml (günlük değerleri olarak ifade edilen) yoluyla aykırı 10 5 genomlar / ml'lik bir scatterplot oluşturun. üçlü numuneler arasında herhangi bir bariz outliers atın. logaritmik bir eğilim çizgisi oluşturmak ve grafiğin denklemi belirler.
      3. 4.3.3.2 oluşturulan denklem kullanılarak numunede genomları / ml toplam sayısını hesaplayın. Numunelerin: (100 01:10 ve 1) ilk seyreltme için hesap unutmayın.

5. Ters enfeksiyon Transfekte hücreler (GÜN 7)

  1. C. toplam genomları / ml hesaplandıktan sonra burnetii pBlaM-CBU0077 kültürü 50 ul / oyuk önceden ısıtılmış kullanılarak DMEM +% 10 FCS bir son hacim içinde 300 MOI hücreleri enfekte etmek için yeniden süspansiyon haline bakteri kültürü ayarlamak bulaşmasına kullanılır.
    Not: 72 saat sonra, normal bir iki katına çıkma süresi ile tohumlanmış, HeLa 229 hücreleri beklenen yoğunluk de 3,136 x 10 4 hücre / olup. 300 bir MOI'da enfekte için gereken bakteri miktarı, 1.88 x 10 8 bakteri / ml eşittir 50 ul içinde 9.408 x 10 6.
    1. QPCR (genomları / ml) hesaplanan değeri (4.3.3.3) kullanarak, ters transfekte hücreleri enfekte 2 ml lik bir nihai hacim içinde önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteriler seyreltin.
  2. Boş mevcut ortamı çıkarın ve transfekte hücreler ters.
  3. Uygun oyuklara seyreltilmiş bakteri (1.88 x 10 8 bakteri / ml) 50 ul ekle. Boş ve u, her iki DMEM +% 10 FCS, 50 ul ekleninfected kuyular.
  4. 37 ° C ile + 5% CO2 seviyesinde 24 saat süre ile inkübe edilir.

Blam Yüzey 6. eklenmesi Translokasyon düzeyini belirleme (GÜN 8)

  1. Blam substrat 6x yükleme çözümü için çözümler hazırlayın.
    Not: Çözelti A, B ve C Blam substrat kiti (Malzeme Tablo bakınız) içinde sağlanır. Çözelti B, oda sıcaklığında bir çökelti oluşturabilir. kullanımdan önce ve çökelti çözülür gerekir 37 ° C, bu çözüm ısıtın.
    1. ilk seti kullanıldığında, sonra kurutulmuş Çözelti A'ya (Bam alt-tabaka kiti ile birlikte), DMSO 185 ul -20 ° C 'de yeniden süspansiyon haline çözelti bir saklayın.
    2. gerekene kadar -20 ° C'de 1 ml'lik alikolar içinde önceden ve mağaza 0.1 M probenisit çözeltisi hazırlayın.
      1. 0.4 M NaOH (100 mi dH 2 O 1.6 g) hazırlanır.
      2. 100 mM Na-fosfat tamponu pH 8 (1.56 g NaH 2 PO 4 .2H hazırlanması 2 O ve 100 ml dH 2 O 1.41 gr 2 Na HPO 4).
      3. sert ajitasyon 0.4 M NaOH 22 ml probenisit 1.25 g çözündürülür.
      4. (Parçalı dönecek çözelti) ve oluşan çökelti çözülene kadar karıştırılır, 100 mM Na-fosfat tamponu pH 8 22 ml ilave edilir.
      5. 1 M NaOH / HCl ile pH 8 (gerekirse) ayarlayın.
      6. kuvvetlice karıştırın ve hafif ısı (<50 ° C) çözümü çoğunlukla netleşene kadar.
      7. 1 mi hacim filtresini (0.2 um gözenek boyutu) ve kısım. -20 ° C'de saklayın alikotları.
  2. her bir kuyunun, 0.06 ul çözelti A, 0.54 ul Çözüm B, 7.9 ul Çözüm C ve 1.5 ul 0.1 M probenisid kullanın. İlk bir mikrofuge'de tüp içinde bir araya Çözüm A 1.8 ul ve Çözüm B 16.2 ul birleştirerek 30 kuyuları için bir master karışımı oluşturun. bir girdap kullanarak iyice karıştırın. C çözeltisi, 237 ul 0.1 M probenisit 45 ul ekle. Vortex tüm componen birleştirmekts.
    Not: 6x yükleme çözümü 4 saat kadar (karanlıkta) stabildir ancak kullanımdan önce mümkün olduğunca yakın hazırlanmalıdır.
  3. Mevcut medya çıkarmadan doğrudan tüm boş ve transfekte ters kuyu içine 6x yükleme solüsyonu 10 ul ekleyin.
  4. karanlıkta 2 saat oda sıcaklığında inkübe plakası.
  5. translokasyon seviyesini belirlemek için, bir mikro levha okuyucusu kullanarak floresan miktarını belirlemek.
    Not: Aşağıdaki prosedür ClarioSTAR mikroplaka okuyucu özgüdür. Eşdeğer mikroplak okuyucular da kullanılabilir.
    1. okuma modu olarak uç noktasını kullanarak yeni bir floresan yoğunluğu protokolünü oluşturun.
    2. aşağıdaki gibi temel parametreleri ayarlayın:
      1. 96 çukurlu bir mikrolevhadaki seçin.
      2. optik ayarlar altında, aşağıdaki kullanıcı tanımlı ayarlarla 2 multichromatics belirleyin: (1) Giriş 410-10 nm uyarma ve 520-10 nm emisyon. (2) giriş 410-10 nm eksitasyon ve 450-10 nm emisyon. iyi mult sağlamakichromatics seçilir.
      3. 3 mm kadar bir çapa sahip yörünge ortalamasını belirleyin.
      4. optik altında, alt optik seçin.
      5. hız ve hassasiyet altında, hassas seçin. Bu oyuk başına sekiz bölgelerine karşılık gelir.
    3. numunelerin uygun kuyu seçerek plaka düzeni ayarlayın.
    4. Seç başlangıç ​​ölçümü.
    5. Kapağı çıkarın ve plaka okuyucu içine tepsiye yerleştirin. Maksimum floresan değerleri ulaşan önlemek için, kazanç değeri ayarlanır emin olun. Bunu yapmak için, ters OTP siRNA transfekte edilmiş enfekte kuyulardan birinde bir kazanç ayarı yapmak. Bu yüksek beklenen translokasyon karşılık gelir.
    6. Seç başlangıç ​​ölçümü sırasıyla 450 nm ve mavi ve yeşil floresan 520 nm hem de bir 410 nm uyarma ve emisyon dip floresan kullanan tüm uygun kuyular ölçmek için.

Sonuçların 7. analizi:

  1. oranını hesaplayınTüm numuneler için 520 nm (yeşil, mavi) 450 nm boş azalma takip ve enfekte olmamış OTP örneğine göre ifade eder.
    Not: Aşağıdaki analiz adımları basit bir elektronik tablo programı verilmektedir.
    1. Mikroplaka okuyucu ihracat işlevini kullanarak, 520 nm ve bir elektronik tabloya 450 nm emisyon dalga boylarında (6.5) hem de elde edilen ham floresan değerlerini aktarın.
    2. Ham 520 nm floresan değerler ekleyerek ve kuyu sayısına göre bölerek 520 nm dalga boyundaki için "boş" okumalar (medya sadece, hiçbir hücreleri) ortalamasını hesaplayın (3). Boş 450 nm dalga boyu değerleri kullanarak tekrarlayın. Bu değerler nedeniyle 96-çukurlu plaka ve ortama arka floresan temsil etmektedir.
    3. Arka plan floresan çıkarın. 7.1.2 elde edilen değerler kullanılarak tüm numune 520 nm floresan değerlerinden boş 520 nm dalga boyundaki ortalamasını çıkarın. 450 nm dalga boyu değerleri için tekrarlayın.
    4. 520 nm oranı boş düzeltilmiş değerleri kullanın (7.1.3): 450 edinin. onun 520 nm değeri karşılık gelen her bir numune 450 nm floresan değerini bölün.
    5. (7.1.4 itibaren) 520 nm oranı değerleri ve kuyular (3) sayısına göre bölünmesi: 450 ekleyerek bulaşmamış OTP oranı değerlerin ortalamasını hesaplayın.
    6. 7.1.5 hesaplanan bulaşmamış OTP oranı değerinin ortalama 7.1.4 hesaplanan 520 nm oranı: 450 bölerek enfekte olmamış OTP göre örneklerin oranını hesaplayın.

Çekirdekler Leke 8. eklenmesi Translokasyon Testi sonra Hücre sayısı belirleme (GÜN 8)

  1. floresans miktarının başlangıç ​​materyalleri olarak tüm oyuklara ya çok kanallı bir pipet ile bir vakum kaynağına veya el bağlanmış bir çok kanallı adaptöründen 6x yükleme çözeltisi içeren ortamı çıkarın.
  2. % 4 PFA (paraformaldehit) çözeltisi 50 ul eklePBS tüm uygun kuyulara hücreleri düzeltmek için. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. (8.1 göre)% 4 PFA PBS çözeltisi çıkarın ve PBS 75 ul hücreler iki kez yıkayın.
  4. Her bir oyuğa, örneğin DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol), bir hücre geçirgen Nükleer soya 50 ul ekle. Bir fluoresan mikroskobu ile görüntü alımı, ImageJ 41 gibi uygun görüntü analizi yazılımını kullanarak iyi siRNA tedaviden sonra her birinde mevcut çekirdeklerin sayısını ölçmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışma için, C. CBU0077 önce Coxiella Nokta / ICM salgılama sistemine 17 bir translokasyon efektör olduğu gösterilmiştir gibi burnetti pBlaM-CBU0077 soyu seçildi. Enfeksiyondan önce yedi günlük C. genomları / ml toplam sayısı burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanılarak sayilmistir. 4 döngü eşiğinin bir örnek gösterir Şekil (Ct) değerleri qPCR izleyen hem standartlar ve numuneler bekleniyor. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Salgılama sistemleri ve bakteriyel efektör proteinler konakçı hücrelerin sitoplazmasına bu sistemler nakliye, bir çok patojen bakteriler özgü replikatif niş içinde bir enfeksiyona neden kullanan önemli hastalık oluşturma bileşenidir. Birçok araştırma grupları odağı bakteriyel etkileyiciler ve konak proteinler ve ana hücresel yollardaki bu etkileyiciler var etkisi arasındaki etkileşimi araştırmak olmuştur. Çok sınırlı bir araştırma, eğer varsa, ev sahibi proteinleri başarılı bakteriyel efektör translokasyon için gerekli ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, HJN'ye verilen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) hibeleri (Hibe Kimliği 1062383 ve 1063646) tarafından desteklenmiştir. EAL, Avustralya Yüksek Lisans Ödülü ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
Sitrik asitSigmaC0759ACCM-2 orta bileşenli
Sodyum sitratSigmaS4641ACCM-2 orta bileşenli
Potasyum fosfatSigma60218ACCM-2 orta bileşenli
Magnezyum klorürCalbiochem442611ACCM-2 ortamı bileşen
Kalsiyum klorürSigmaC5080ACCM-2 orta bileşen
Demir sülfatFisherS93248ACCM-2 orta bileşen
Sodyum klorürSigmaS9625ACCM-2 orta bileşen
L-sisteinSigmaC6852ACCM-2 orta bileşen
Bacto-neopeptoneBD211681ACCM-2 ortamı bileşen
kasamino asitlerFisherBP1424ACCM-2 orta bileşenli
Metil beta siklodekstrinSigmaC4555ACCM-2 orta bileşenli
RPMI + GlutamaxThermoFisher Scientific61870-036ACCM-2 orta bileşenli
KloramfenikolSigmaC0378Bakteri kültürü için
ON-TARGETplus Hedeflemesiz Kontrol Havuz (OTP)DharmaconD-001810-10-05Hedeflemesiz kontrol
siGENOME İnsan PLK1 (5347) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-003290-01-005Hücre ölümüne neden olur; transfeksiyon verimliliğinin ölçülmesi
siGENOME İnsan RAB5A (5968) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-004009-00-0005
siGENOME İnsan RAB7A (7879) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-010388-00-0005
5x siRNA tamponuDharmaconB-002000-UB-1005x siRNA tamponunu 1x siRNA tamponuna seyreltmek için steril RNaz içermeyen su kullanın
TransfeksiyonDharmaFECT-1 Transfeksiyon ReaktifiDharmaconT-2001-01
Opti-MEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific51985-034Transfeksiyon için kullanılan azaltılmış serum ortamı
DMEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific10567-014Hücre kültürü ve enfeksiyon için
Isı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS)Thermo ScientificSH30071.03Alternatif eşdeğer ürün
DMSOSigmaD8418kullanabilir Coxiella suşunun depolanması için
PBSHücre kültürü için
% 0.05 Tripsin + EDTAThermoFisher Scientific25300-054Hücre kültürü için
dH2OqPCR için numunelerin ve standartların seyreltilmesi için
Quick-gDNA Mini PrepZYMO ResearchD3007gDNA'yı çıkarmak için alternatif eşdeğer ürün kullanabilir
SensiFAST SYBR No-ROX KitiBiolineBIO-98020qPCR reaksiyonu için alternatif eşdeğer qPCR ana karışım ürünü kullanabilir
LiveBLAzer FRET-B/G CCF2-Invitrogen içeren yükleme kitiK1032Floresan kullanılarak translokasyon ölçümü ve 6X yükleme çözeltisinin üretilmesi için (Çözelti A, B, C ve DMSO içerir)
Sodyum hidroksitMerck106469Probenicid çözelti bileşeni
Sodyum fosfat monobazikSigma71505Probenicid çözelti bileşeni
di-Sodyum hidrojen ortofosfatMerck106586Probenicid çözeltisi bileşen
ProbenicidSigmaP8761Probenicid çözeltisi bileşen
DRAQ5 Floresan Prob Çözeltisi (5 mM)ThermoFisher Scientific62251Hücre canlılığını belirlemek için çekirdek boyası. PBS'de seyreltilmiş 1:4000 kullanın.
PBS Sigma P6148'de %4 PFA (paraformaldehit) çözeltisiHeLa 229 hücreleri için sabitleme solüsyonu
25 cm2 havalandırmalı kapaklı doku kültürü şişesiCorning430639Bakteri suşunun büyümesi için
96 Kuyu Düz Şeffaf tabanlı Siyah Polistiren TC ile Tedavi Edilmiş Mikroplakalar, Ayrı ayrı sarılmış, Kapaklı, SterilCorning3603
75 cm2 havalandırmalı kapaklı doku kültürü şişesiCorning430641HeLa 229 hücrelerinin büyümesi için
175 cm2 Havalandırmalı kapaklı doku kültürü şişesiCorning431080HeLa 229 hücrelerinin büyümesi için
HemositometreHeLa 229 hücrelerinin miktar tayini için
Tear-A-Way 96 Kuyulu PCR plakalarıqPCR için 4titude4ti-0750/TA reaksiyon
8 kapaklı zincir, düzSarstedt65.989.002qPCR reaksiyonu için
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Equipment
Tezgah üstü mikrofüj
Tezgah üstü girdap
Orbital karıştırıcı
SantrifüjEppendorf5810 RBakteri kültürünü peletlemek için
NanodropgDNA miktar tayini için
Mx3005P QPCR makinesiAligent Technologies4014567 günlük kültür ClarioSTAR mikroplakasında Coxiella genomlarının miktar tayini için
Floresan ölçümü içinBMG LabTech
için okuyucu

Kaynaklar

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97(2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056(2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566(2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117(2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252(2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013(2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

FRET AnaliziRab5A SusturulmasıRab7A SusturulmasıBlaM RaportörüKonak-Patojen EtkileşimiHücresel MikrobiyolojiFloresans Ölçümü
Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.