Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için Coxiella burnetii SiRNA susturma sırasında

Coxiella burnetii zoonotik insan enfeksiyon Q ateşe neden benzersiz bir hücre içi patojen olduğunu. Bu hastalık asemptomatik serokonversiyon sıklıkla maruz sonra ¹ endokardit yıl olarak tezahür hayatı tehdit kronik enfeksiyona uzanan klinik sunumlar geniş bir yelpazede ile ilişkilidir. İnsan enfeksiyon öncelikle geviş getiren, özellikle, süt inek, koyun ve keçilerde enfeksiyonu için önemli rezervuar, kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla gerçekleşir. Bu hayvanlarda Coxiella enfeksiyonu genellikle subklinik olmasına rağmen, enfeksiyon kürtaj tetikleyebilir ve doğum sıvısı ve plasentanın içinde hatırı sayılır bakteriyel yük yerel çevreyi ¹ kirletebilir. Halk sağlığı ve tarım sektöründe hem son zamanlarda Hollanda'da ² meydana gelen Q humması salgını gözlendi üzerinde büyük bir yük gibi bir kontaminasyon örneğidir olabilir. 2007 ve arasında2010 Q humması 4.000 'den fazla insan vakası teşhis edildi ve bu salgın keçi çiftlikleri ³ önemli kirlenme bağlıydı. Ayrıca, Coxiella şiddetli morbidite ve mortaliteye ⁴ neden bakteri ve gerekli düşük bulaşıcı dozun çevresel istikrara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sınıflandırılmış olarak, bir potansiyel biyolojik silahtır.

Coxiella iki aşamada vardır: doğal kaynaklardan izole Faz I organizmalar, son derece öldürücü ve Faz II organizmalar yüksek in vivo zayıflatılmaktadır. Örneğin, Coxiella burnetti dokuz Mile Faz I organizmaların çeşitli in vitro geçiş sonrası, Faz II bakteri kesik lipopolisakarit ile sonuçlanan geri dönüşü olmayan bir kromozom silme içeren üretildi (LPS) ^5. Bu suş, C. burnetii NMII, doku kültürü modelleri I Faz fenotipik benzer ve daha güvenli bir modu sağlarAraştırmacılar laboratuvarlarda ⁵ Coxiella hastalık oluşumunun incelenmesinde l. Son yıllarda birçok atılımlar hızla Coxiella genetik alanında gelişmiş var. En önemlisi, aksenik ortam geliştirilmesi (sitrat sistein orta asitleştirildi - ACCM-2) hem sıvı ve katı ortam ^6,7 ile Coxiella hücresiz büyüme sağlamıştır. Bu uyarılabilir gen sentezleme sistemi için, mekik vektörleri ve rasgele transpozon sistemleri ^8-11 de dahil olmak üzere Coxiella için genetik araçlar doğrudan gelişmeler ile sonuçlandı. En son, hedeflenen gen inaktivasyonu için iki yöntem de belirli virülans gen adayları ¹² incelenmesi için önünü geliştirilmiştir.

Alveoler makrofajlar tarafından içselleştirilmesi ardından, Coxiella membrana bağlı bölme içinde yüksek sayılara çoğaltır vakuol (CCV) içeren Coxiella- adlandırılan. CCV konak endositik ticaretini inci gerektirirkaba erken ve geç endozomlar bir lizozom kökenli organel ¹³ içine olgunlaşır kadar. Bu süreç boyunca, CCV ya geçici görünür ya da dahil olmak üzere, vakuol ile ilişkili, ancak Rab5, Rab7, CD63 ve ^LAMP-13-15 Ocak, bunlarla sınırlı olmamak kalır konakçı faktörleri kazanır. Konak hücreleri içinde Coxiella çoğaltma tamamen işlevsel Dot / ICM Tipi IVB salgılanması Sistemi (T4SS) ^8,16,17 tamamen bağlıdır. Bu salgı sistemi ancestrally konjugasyon sistemleri ile ilgili bir çok protein yapısı ve bakteriyel proteinler sunmak için hem bakteriyel ve vakuoler membranlar yayılan, ev sahibi sitoplazmada ¹⁸ içine, etkileyiciler olarak adlandırılan. Coxiella T4SS işlevsel Legionella pneumophila ^19,20 iyi karakterize Tip IVB Nokta / ICM salgılama sistemine çok benzer. Coxiella asidik lizozom türetilmiş ulaşıncaya kadar İlginç bir şekilde, T4SS ve daha sonra efektör translokasyon aktivasyonu oluşmazorganel, yaklaşık 8 saat sonrası enfeksiyon ^17,21. Bugüne kadar, 130 üzerinden Nokta / ICM efektörler ^9,17,22-24 tespit edilmiştir. Bu etkileyiciler çoğu büyük olasılıkla konak hücreleri içinde Coxiella replikasyonu sırasında önemli rol oynamaktadır; Bununla birlikte, sadece bir kaç efektör işlevsel ^25-29 karakterize edilmiştir.

Bu çalışmada, konakçı hücre sitoplazması içinde β-laktamaz aktivitesi ile (bundan sonra Bam alt-tabaka olarak da adlandırılır) CCF2-AM FRET alt-tabaka (Şekil 1) bölünmesi dayanan bir floresans bazlı translokasyon deneyi kullanmaktadır. ilgi konusu genin yapısal ekspresyonu sağlayan bir raportör plasmidi ile β-laktamaz (Bam)-1 TEM kaynaştırılır. Bam alt-tabaka, bir FRET çifti oluşturan iki florofor (kumarin ve floresein) oluşmaktadır. floresein ve efektör translokasyon yokluğunda yeşil floresan emisyon FRET içinde kumarin sonuçlarının Tahrik olma; Bununla birlikte, Bla halindeM-efektör füzyon proteini, konakçı sitoplazma içerisine doğru olan, elde edilen β-laktamaz aktivitesi böler uyarma aşağıdaki mavi floresan emisyon üretiminde FRET çifti ayırma Bam substratın β-laktam halkası. Bu translokasyon tahlil de C dahil olmak üzere farklı hücre içi ve hücre dışı bakterilerin bir dizi, efektör proteinleri tespit etmek bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır burnetti, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatojenik E. E. coli, Salmonella ve Brucella ^17,30-35.

Coxiella efektör translokasyon belirli konak faktörlerinin rolünü belirlemek için biz özellikle küçük müdahale RNA (siRNA), RNA girişim olarak bilinen gen susturma için köklü bir yöntem kullanmaktadır. Başlangıçta Caenorhabditis elegans tespit RNA interferans doğal Defe için kullanılan korunmuş bir endojen hücresel süreçvirüslere karşı nse yanı sıra gen regülasyonu ^36,37. Diziye özgü siRNA bağlanmasından sonra, mRNA degradasyonu özgü gen susturma ve demonte ³⁸ elde (RNA-bağlı susturulması kompleksi) RISC yoluyla ortaya çıkar. Bu çalışmada, siRNA endositik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir, iki ana protein, Rab5A ve Rab7A, hedef için kullanılmıştır. Efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ve Rab7A susturma etkisi C. kullanarak tespit edildi burnetti pBlaM-CBU0077. Bir önceki Coxiella ¹⁷ Nokta / ICM salgılama sistemi transloke gösterilmiştir gibi CBU0077 seçildi.

SiRNA gen susturulması ve burada açıklanan fluorescencebased translokasyon tahlil hem kullanarak, biz Coxiella tarafından efektör proteinlerin translokasyonu konak faktörlerinin rol kurmaya başlıyor. Bu yaklaşım, benzer secretio sahip hem hücre içi ve hücre dışı bakterilerin geniş bir aralığına uygulanabilmektedirefektör protein translokasyonu sorumlu n sistemleri.

Not: Coxiella burnetii RSA439 NMII büyümesini veya manipülasyon içeren tüm prosedürleri Fiziksel Muhafaza Seviye 2 Laboratuvar ve yerel kurallara uygun bir biyolojik güvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Aşağıda tarif ters transfeksiyon ve translokasyon tahlil iş akışı şematik diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir.

C 1. Hazırlık burnetti Kültür ß-laktamaz için (pBlaM-CBU0077) CBU0077 sigortalı ifade (1. GÜN)

1. Hazırlayın 1X ACCM-2 ^6:
   1. Tablo 1 'de listelenen bileşenleri birleştirin. (Otoklav değil) 6 M NaOH ile 4.75 pH ve filtre sterilize ayarlayın. ACCM-2, 4 ° C'de saklanan, yaklaşık üç hafta boyunca stabildir.
2. C oluşturmak burnetti pBlaM-CBU0077 stokları.
   1. C ile HeLa 229 hücreleri enfekte Büyük vacuol kadar pBlaM-CBU0077 ve geçit taşıyan burnetii suşuES hücrelerinin çoğunda görülmektedir.
      1. C büyümek % 5 _CO2,% 2.5, O _2, 37 ° C 'de 7 gün süre ile havalandırılmış bir kap ile 75 ^cm2 doku kültürü şişesi içinde 20 mL ACCM-2 ihtiva eden 3 mg / ml kloramfenikol bölgesindeki pBlaM-CBU0077 taşıyan burnetii'nin soyu.
      2. C santrifüj oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü.
      3. Yeniden askıya +% 10 fetal dana serumu (FCS) + 3 | ig / ml kloramfenikol (bakım ortamı), 20 ml DMEM içinde pelet. HeLa 229 hücreleri% 50 konfluent 75 ^cm2 şişeye ortamı çıkarın. Ekle yeniden askıya C. HeLa 229 hücreleri burnetti. HeLa 229 hücreleri enfeksiyona izin% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de 2 gün süreyle inkübe edilir.
      4. 175 cm ² doku kültürü şişesi içine hücreleri bölün.
         1. 75 cm ² balona ortamı çıkarın ve 10 ml önceden ısıtılmış PBS ile iki kez tek tabaka yıkayın.
         2. 1 mi O eklentif 3 37 ° C ±% 5 _CO2 seviyesinde% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ve bir yer hücreleri - 5 dakika hücreleri ayırmak için.
         3. Bakım medya 10 ml hücrelerin yeniden askıya. Bakım ortamının 38 mi ihtiva eden bir 175 ^cm2 şişeye yeniden askıya hücreleri 2 ml ekle.
         4. % 100 konfluansa ulaşılana ve büyük vakuoller gözlenen kadar 5 gün - ilave 3% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Enfekte HeLa 229 hücreleri kapsar ve enfekte hücreleri lize etmek için 15 dakika boyunca inkübasyona 10 mi dH ₂ O ekleyin 175 ^cm2 şişeye süpernatant toplayın.
   3. Oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da süpernatan ve lize hücreleri ve pelet birleştirin.
   4. Yeniden askıya 10 ml DH ₂ O. pelet arka arkaya, 10 ml şırınganın en az 20 kez bağlanmış bir 23G iğne ile yeniden süspansiyon geçirilmesiyle daha Hücreleri,. 5 dakika boyunca 500 x g'de Pelet selüler artığın ayrılması için.
   <li> çıkarın ve pelet yüzer 15,000 x g'de toplamak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca burnetti.
3. C yeniden askıya DMEM +% 10 FCS burnetti ve 4 uyarınca bakteri sayısını ölçmek. -80 ° C de DMEM +% 10 FCS +% 10 dimetil sülfoksit (DMSO), kısım 50 ul stok mikrofüj tüplerine ve mağaza kullanılarak 1 x 10 ⁹ genomları / mL'ye seyreltilir.

2. Ters SiRNA NAKLİ VE HeLa Tohum 229 Hücreler (GÜN 4)

1. ilk kez deney siRNA kullanıldığında hazırlanmasısiRNA aşağıdaki gibidir:
   1. Kısaca SiRNA pelet tüpün dibinde toplanan sağlamak için liyofilize siRNA santrifüj.
   2. 1x siRNA tamponu (Tablo 2) uygun hacimde pipetleme 20 mcM son stok konsantrasyonu topak haline siRNA yeniden askıya.
   3. çözümü Pipet ve 3 aşağı - 10 dk - 5 kez tüp her 5 tersini, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir yörünge mikser üzerinde karıştırmak ve yer için.
   4. Kısaca SiRNA tüpün alt kısmında toplanır emin olmak için tüp santrifüj.
   5. gerekene kadar -20 ° C'de mikrofüj tüpleri ve deposunda 50 ul alikotları siRNA kısım.
   6. gerektiğinde siRNA konsantrasyonunu çalışma 1 mcM oluşturmak için, pipet 1X siRNA 950 ul 50 ul kısım stokunun (20 uM) içine tampon. Not: Bu, 1 uM çalışma konsantrasyonu tekrar Transfeksiyonlar için birden çok kez dondurularak çözülmüş olabilir.
2. DMEM +% 10 FCS yerleştirin30 dakika süre ile 37 ° C su banyosu (veya eşdeğeri) içinde% 0.05 tripsin-EDTA ile yıkandı ve PBS kullanımdan önce ısınmaya.
3. Transfeksiyon bileşenlerinin hazırlanması:
   Not: Aşağıdaki protokol siyah duvarlar ve düz, şeffaf dipli, 96 oyuklu bir mikro-HeLa 229 hücreleri optimize edilmiştir. transfeksiyon reaktifi miktarı optimizasyonu, hücre siRNA'nın konsantrasyon ve tohum yoğunluğu farklı hücre hatları için gerekli olabilir.
   1. Her bir 0.1 ul transfeksiyon reaktifi kullanım için, 15.9 ul indirgenmiş serum orta ve 1 uM siRNA (40 nM nihai siRNA konsantrasyonu oluşturur) 4 ul (minimum temel ortam Malzemelerin Tablo bakınız Transfeksiyonlar için kullanılır). OTP, PLK1, Rab5A ve Rab7A için ayrı mikrofuge'de tüpleri kullanın. üç kez, her deney durumu ölçülür. 96 oyuklu bir plaka taslağına bir örneği, Şekil 3'te gösterilmiştir.
      Not: OTP ve PLK1: Bu protokol iki denetim kullanımını içermektedir. OTP isehedef dışı etkilerini azaltmak için optimize edilmiştir ve bu nedenle OTP negatif olmayan hedefleme kontrol olarak kullanılır dört toplanmış SiRNA oluşmaktadır. Şifreli siRNA bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. pro-apoptotik yollar uyarılması ve bu nedenle PLK1 siRNA hücre ölümü transfeksiyon verimi ilişkilidir transfeksiyon için pozitif kontrol olarak kullanılan hücre hatları, bir dizi geniş hücre ölümüne PLK1 ifade sonuçlarının kaybı.
      1. Her deneysel siRNA Transfeksiyon için, bağımsız bir mikrofüj tüpü içinde 0.4 ul transfeksiyon reaktifi 63.6 ul indirgenmiş serum ortamı birleştirir. Tüm mikrofüj tüpler ve oda sıcaklığında 5 dakika için karmaşık bileşenler izin vorteksleyin.
      2. transfeksiyon kompleksi ihtiva eden karşılık gelen mikrofüj tüplerine her deney siRNA 16μl ekleyin. Vorteks ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Not: 30 dakika aşmamak önemlidir, transfeksiyon verimi düşecektir olarak.
4. 20 dk inc sırasındaubation (2.3.1.2), 20 transfeksiyon reaktifi ul + indirgenmiş serum ortamı ilave + siRNA steril, siyah düz, şeffaf dipli, 96 gözlü tepsi uygun kuyulara karıştırın.
5. En kısa zamanda 20 dakika kuluçka süresi, tam tohum / oyuk 229 hücreleri, 3.92 x 10 ³ hücre yoğunluğunda HeLa gibi.
   1. Hasat HeLa önceden ısıtılmış DMEM konfluent veya alt konfluent 75 cm ² doku kültür şişesi 229 hücreleri% 10 FCS ve standart yöntemlerle göre 4,9 x 10 ⁴ hücre / ml bir nihai yoğunluk için hücrelerin yeniden askıya. Verimlilik tehlikeye atmayacak transfeksiyon sağlamak için, 20 dakika kuluçka dönemi (2.3.1.2) sırasında hücreler hazırlamak.
      1. önceden ısıtılmış 10 ml PBS ile 229 hücreler iki kez HeLa tek tabaka yıkayın.
      2. 5 dakika hücreleri ayırmak için 3 - 37 ° C ile + 5% _CO2% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ve yeri, HeLa 229 hücreleri 1 ml ilave edilir.
      3. Önceden ısıtılmış, DMEM +% 10 FC 9 ml hücreleri toplamakS, bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı ve DMEM +% 10 FCS ile 4.9 x 10 ⁴ hücre / ml'lik bir son yoğunluğa hücreleri hazırlamak.
   2. Transfeksiyon reaktifi + indirgenmiş serum ortamı + siRNA karışımı içeren her kuyuya 229 hücreleri, 4.9 x 10 ⁴ hücre / ml yoğunlukta HeLa Pipet 80 ul. Bu / oyuk 3.92 x 10 ³ hücre, bir hücre yoğunluğuna karşılık gelir.
      Not: Arka çıkarma Bam alt-tabaka için gereklidir.
      1. Hücreleri veya siRNA katmayın için "boş" kuyular (Şekil 3). Bunun yerine, üç kopya halinde kuyulara DMEM +% 10 FCS, 80 ul ekle.
   3. 37 ° C ile + 5% _CO2 seviyesinde 24 saat süre ile inkübe edilir.

3. Değişim Medya (GÜN 5)

1. 24 saat sonra, çok kanallı bir pipet ile bir vakum kaynağına veya el bağlanmış bir çok kanallı adaptörü kullanarak ortamını çıkarın ve taze Prewarm 100 ul ile yerineEd DMEM +% 10 FCS.
2. 37 ° C +% 5 _CO2 seviyesinde ilave bir 48 saat daha inkübe edilir.
3. Bu noktada, görsel olarak, standart bir ışık mikroskobu kullanılarak hücrelerin canlılığı kontrol. Arka transfeksiyon başarılı olursa, çok hücre ölümü OTP siRNA ile karşılaştırıldığında PLK1 siRNA içeren kuyucuklara gözlenecektir.

QPCR kullanarak Niceleme Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Uzama 4. (GÜN 7)

1. 10 mi C _CO2,% 2.5 O ₂ (1.3), santrifüj,% 5 37 ° C'de ACCM-2 büyüme 7 gün sonra oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü.
2. Önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS, 10 ml bakteriyel pelet yeniden askıya. 1:10 ve 1 hazırlayın: DH ₂ O. kullanarak kültür (örnek) 100 dilüsyonları
3. qPCR için gerekli bileşenleri ayarlayın.
   Not: gDNA ekstraksiyon önceden yapılmış ve -20 ° C UNT saklanabiliril gereklidir.
   1. standart hazırlanması:
      1. 7 gün, üreticinin talimatlarına göre, bir gDNA ekstre etme kiti kullanılarak% 5 _CO2,% 2.5 O _2, 37 ° C 'de ACCM-2 yetiştirilen Coxiella burnetti RSA439 NMII yabani tip suştan gDNA'sından ekstrakte edin.
      2. 260 nm 'lik bir emişteki NanoDrop (ya da eşdeğeri) kullanılarak gDNA konsantrasyonu (g / ml) ölçülür.
      3. Aşağıdaki aşağıdaki formül kullanılarak ul başına genom kopya sayısını hesaplayın ve genomları / ml sayısına dönüştürmek.
         
      4. DH ₂ O kullanarak yeni bir mikrofüj tüpe (100 ul'lik bir son hacim içinde) 10 ⁹ / ml genomları / ml sayısını ayarlama Bu 10 dakika süre ile kaynatıldı ve gerekene kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      5. Enfeksiyonun gün, 10 ⁹ genomundan 10 ⁵ genomlar / ml 10 ⁸ genomları / ml 10-kat seri dilüsyonları oluşturmaks / ml stok.
         1. Pipet dH ₂ O 90 ul halinde 10 ⁹ genomları / ml, 10 ul 10 ⁸ genomları / ml üretir. Vortex karıştırın. Pipet dH ₂ O 90 ul halinde 10 ⁸ genomları / ml, 10 ul 10 ⁷ genomları / ml üretir. 10 ⁵ genomları / ml kadar Vortex ve tekrarlayın.
   2. qPCR reaksiyonu ayarlayın. 25 kuyu herhangi bir pipetleme hataları hesaba katmak için bir master karışımı oluşturun. Her biri için de, 10 ul qPCR Master Mix kullanın; OmpA primer karışımının 2 ul (4.3.2.2) ve dH ₂ O 3 ul
      Not: OmpA C'lik bir dış zar proteinidir Daha önce tarif edildiği gibi ⁴⁰ burnetti ^'39 ve yüksek oranda korunan bir bölge içinde, bir 82-baz-çifti bölümü bir prob olarak kullanılmak için seçilmiştir.
      1. Her standart (dH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ genomları / ml) ve örnek (1 ayarlayın:10 ve 1: 100 seyreltme) 96 gözlü PCR sırasıyla iki kopya ya da üç kopya halinde) (Non-etekli plaka yırtılacak. Uygun oyuklara numune veya standarda 5 ul ekle.
      2. (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') ve ters primer OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') 4 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar, ompA ileri primer hem de seyreltik aynı mikrofüj tüpü içine birleştiren, DH ₂ O kullanılması.
         Not: ompA primer karışımı önceden hazırlanmış ve gerekene kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      3. 250 ul qPCR Master Mix, 50 ul ompA primer karışımı, 75 ul dH ₂ O ve karıştırmak için girdap birleştirin. standartları veya numune ya içeren kuyulara bu ana karışımı 15 ul ekleyin.
      4. Her şeyi sağlamak için PCR tüpleri tüplerin alt toplanır uygun kuyulara ve nabız santrifüj üzerine 8-kapak PCR şerit kapakları yerleştirin.
      5. Bir kantitatif PCR ma aşağıdaki program kurmakÇin: 1 saniye 95 ° C'lik 45 döngü, 20 saniye (Şekil 4A), 60 ° C'de, ardından 2 dk, 10 dakika boyunca 95 ° C, 50 ° C.
   3. qPCR dan Ct (döngüsü eşik) değerleri analiz:
      1. Programın ihracat işlevini kullanarak bir elektronik tabloya Ct değerleri aktarın.
      2. ⁹ ila 10 genomları / ml (günlük değerleri olarak ifade edilen) yoluyla aykırı 10 ⁵ genomlar / ml'lik bir scatterplot oluşturun. üçlü numuneler arasında herhangi bir bariz outliers atın. logaritmik bir eğilim çizgisi oluşturmak ve grafiğin denklemi belirler.
      3. 4.3.3.2 oluşturulan denklem kullanılarak numunede genomları / ml toplam sayısını hesaplayın. Numunelerin: (100 01:10 ve 1) ilk seyreltme için hesap unutmayın.

5. Ters enfeksiyon Transfekte hücreler (GÜN 7)

1. C. toplam genomları / ml hesaplandıktan sonra burnetii pBlaM-CBU0077 kültürü 50 ul / oyuk önceden ısıtılmış kullanılarak DMEM +% 10 FCS bir son hacim içinde 300 MOI hücreleri enfekte etmek için yeniden süspansiyon haline bakteri kültürü ayarlamak bulaşmasına kullanılır.
   Not: 72 saat sonra, normal bir iki katına çıkma süresi ile tohumlanmış, HeLa 229 hücreleri beklenen yoğunluk de 3,136 x 10 ⁴ hücre / olup. 300 bir MOI'da enfekte için gereken bakteri miktarı, 1.88 x 10 ⁸ bakteri / ml eşittir 50 ul içinde 9.408 x 10 ^6.
   1. QPCR (genomları / ml) hesaplanan değeri (4.3.3.3) kullanarak, ters transfekte hücreleri enfekte 2 ml lik bir nihai hacim içinde önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteriler seyreltin.
2. Boş mevcut ortamı çıkarın ve transfekte hücreler ters.
3. Uygun oyuklara seyreltilmiş bakteri (1.88 x 10 ⁸ bakteri / ml) 50 ul ekle. Boş ve u, her iki DMEM +% 10 FCS, 50 ul ekleninfected kuyular.
4. 37 ° C ile + 5% _CO2 seviyesinde 24 saat süre ile inkübe edilir.

Blam Yüzey 6. eklenmesi Translokasyon düzeyini belirleme (GÜN 8)

1. Blam substrat 6x yükleme çözümü için çözümler hazırlayın.
   Not: Çözelti A, B ve C Blam substrat kiti (Malzeme Tablo bakınız) içinde sağlanır. Çözelti B, oda sıcaklığında bir çökelti oluşturabilir. kullanımdan önce ve çökelti çözülür gerekir 37 ° C, bu çözüm ısıtın.
   1. ilk seti kullanıldığında, sonra kurutulmuş Çözelti A'ya (Bam alt-tabaka kiti ile birlikte), DMSO 185 ul -20 ° C 'de yeniden süspansiyon haline çözelti bir saklayın.
   2. gerekene kadar -20 ° C'de 1 ml'lik alikolar içinde önceden ve mağaza 0.1 M probenisit çözeltisi hazırlayın.
      1. 0.4 M NaOH (100 mi dH ₂ O 1.6 g) hazırlanır.
      2. 100 mM Na-fosfat tamponu pH 8 (1.56 g NaH ₂ PO ₄ .2H hazırlanması ₂ O 1.41 gr ₂ Na HPO _4).
      3. sert ajitasyon 0.4 M NaOH 22 ml probenisit 1.25 g çözündürülür.
      4. (Parçalı dönecek çözelti) ve oluşan çökelti çözülene kadar karıştırılır, 100 mM Na-fosfat tamponu pH 8 22 ml ilave edilir.
      5. 1 M NaOH / HCl ile pH 8 (gerekirse) ayarlayın.
      6. kuvvetlice karıştırın ve hafif ısı (<50 ° C) çözümü çoğunlukla netleşene kadar.
      7. 1 mi hacim filtresini (0.2 um gözenek boyutu) ve kısım. -20 ° C'de saklayın alikotları.
2. her bir kuyunun, 0.06 ul çözelti A, 0.54 ul Çözüm B, 7.9 ul Çözüm C ve 1.5 ul 0.1 M probenisid kullanın. İlk bir mikrofuge'de tüp içinde bir araya Çözüm A 1.8 ul ve Çözüm B 16.2 ul birleştirerek 30 kuyuları için bir master karışımı oluşturun. bir girdap kullanarak iyice karıştırın. C çözeltisi, 237 ul 0.1 M probenisit 45 ul ekle. Vortex tüm componen birleştirmekts.
   Not: 6x yükleme çözümü 4 saat kadar (karanlıkta) stabildir ancak kullanımdan önce mümkün olduğunca yakın hazırlanmalıdır.
3. Mevcut medya çıkarmadan doğrudan tüm boş ve transfekte ters kuyu içine 6x yükleme solüsyonu 10 ul ekleyin.
4. karanlıkta 2 saat oda sıcaklığında inkübe plakası.
5. translokasyon seviyesini belirlemek için, bir mikro levha okuyucusu kullanarak floresan miktarını belirlemek.
   Not: Aşağıdaki prosedür ClarioSTAR mikroplaka okuyucu özgüdür. Eşdeğer mikroplak okuyucular da kullanılabilir.
   1. okuma modu olarak uç noktasını kullanarak yeni bir floresan yoğunluğu protokolünü oluşturun.
   2. aşağıdaki gibi temel parametreleri ayarlayın:
      1. 96 çukurlu bir mikrolevhadaki seçin.
      2. optik ayarlar altında, aşağıdaki kullanıcı tanımlı ayarlarla 2 multichromatics belirleyin: (1) Giriş 410-10 nm uyarma ve 520-10 nm emisyon. (2) giriş 410-10 nm eksitasyon ve 450-10 nm emisyon. iyi mult sağlamakichromatics seçilir.
      3. 3 mm kadar bir çapa sahip yörünge ortalamasını belirleyin.
      4. optik altında, alt optik seçin.
      5. hız ve hassasiyet altında, hassas seçin. Bu oyuk başına sekiz bölgelerine karşılık gelir.
   3. numunelerin uygun kuyu seçerek plaka düzeni ayarlayın.
   4. Seç başlangıç ​​ölçümü.
   5. Kapağı çıkarın ve plaka okuyucu içine tepsiye yerleştirin. Maksimum floresan değerleri ulaşan önlemek için, kazanç değeri ayarlanır emin olun. Bunu yapmak için, ters OTP siRNA transfekte edilmiş enfekte kuyulardan birinde bir kazanç ayarı yapmak. Bu yüksek beklenen translokasyon karşılık gelir.
   6. Seç başlangıç ​​ölçümü sırasıyla 450 nm ve mavi ve yeşil floresan 520 nm hem de bir 410 nm uyarma ve emisyon dip floresan kullanan tüm uygun kuyular ölçmek için.

Sonuçların 7. analizi:

1. oranını hesaplayınTüm numuneler için 520 nm (yeşil, mavi) 450 nm boş azalma takip ve enfekte olmamış OTP örneğine göre ifade eder.
   Not: Aşağıdaki analiz adımları basit bir elektronik tablo programı verilmektedir.
   1. Mikroplaka okuyucu ihracat işlevini kullanarak, 520 nm ve bir elektronik tabloya 450 nm emisyon dalga boylarında (6.5) hem de elde edilen ham floresan değerlerini aktarın.
   2. Ham 520 nm floresan değerler ekleyerek ve kuyu sayısına göre bölerek 520 nm dalga boyundaki için "boş" okumalar (medya sadece, hiçbir hücreleri) ortalamasını hesaplayın (3). Boş 450 nm dalga boyu değerleri kullanarak tekrarlayın. Bu değerler nedeniyle 96-çukurlu plaka ve ortama arka floresan temsil etmektedir.
   3. Arka plan floresan çıkarın. 7.1.2 elde edilen değerler kullanılarak tüm numune 520 nm floresan değerlerinden boş 520 nm dalga boyundaki ortalamasını çıkarın. 450 nm dalga boyu değerleri için tekrarlayın.
   4. 520 nm oranı boş düzeltilmiş değerleri kullanın (7.1.3): 450 edinin. onun 520 nm değeri karşılık gelen her bir numune 450 nm floresan değerini bölün.
   5. (7.1.4 itibaren) 520 nm oranı değerleri ve kuyular (3) sayısına göre bölünmesi: 450 ekleyerek bulaşmamış OTP oranı değerlerin ortalamasını hesaplayın.
   6. 7.1.5 hesaplanan bulaşmamış OTP oranı değerinin ortalama 7.1.4 hesaplanan 520 nm oranı: 450 bölerek enfekte olmamış OTP göre örneklerin oranını hesaplayın.

Çekirdekler Leke 8. eklenmesi Translokasyon Testi sonra Hücre sayısı belirleme (GÜN 8)

1. floresans miktarının başlangıç ​​materyalleri olarak tüm oyuklara ya çok kanallı bir pipet ile bir vakum kaynağına veya el bağlanmış bir çok kanallı adaptöründen 6x yükleme çözeltisi içeren ortamı çıkarın.
2. % 4 PFA (paraformaldehit) çözeltisi 50 ul eklePBS tüm uygun kuyulara hücreleri düzeltmek için. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
3. (8.1 göre)% 4 PFA PBS çözeltisi çıkarın ve PBS 75 ul hücreler iki kez yıkayın.
4. Her bir oyuğa, örneğin DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol), bir hücre geçirgen Nükleer soya 50 ul ekle. Bir fluoresan mikroskobu ile görüntü alımı, ImageJ ⁴¹ gibi uygun görüntü analizi yazılımını kullanarak iyi siRNA tedaviden sonra her birinde mevcut çekirdeklerin sayısını ölçmek.

Bu çalışma için, C. CBU0077 önce Coxiella Nokta / ICM salgılama sistemine 17 bir translokasyon efektör olduğu gösterilmiştir gibi burnetti pBlaM-CBU0077 soyu seçildi. Enfeksiyondan önce yedi günlük C. genomları / ml toplam sayısı burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanılarak sayilmistir. 4 döngü eşiğinin bir örnek gösterir Şekil (Ct) değerleri qPCR izleyen hem standartlar ve numuneler bekleniyor. 4.3.3 tarif edildiği gibi (Amplifikasyon çizim (Şekil 4B) ve sayısal olarak (Şekil 4C) 'de grafik olarak ifade edilir), Ct değerleri, dışa ve analiz edildi. Gösterilen Örnek verilere göre, 10 ml yeniden süspansiyon haline bakteri kültürü (Şekil 4D), 2.31 ​​x 10 8 genomları / ml vardı. Uygun bakteriyel seyreltme oluşturmak için (1.88 × 10 8 genomları / ml in, 2 mi), yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteri 1.63 mi, taze, önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS 370 ul ilave edildi. SiRNA ile transfekte ters Hücreler daha sonra C ile enfekte edildi 24 saat boyunca 300 MOl'de burnetti pBlaM-CBU0077.

ters inkübasyondan sonra efektör translokasyon Bam alt-tabaka miktarının ile transfekte enfekte edilmiş hücreler bir floresan plaka okuyucu kullanarak belirlenebilir. 7 de tarif edildiği gibi analiz sonra, enfekte olmamış OTP normalize olan tüm oran değerleri, aynı zamanda, enfekte ATP'ye normalleştirilebilir. konakçı genlerinde susturma sonra efektör translokasyon seviyesi enfekte OTP kontrol ile karşılaştırıldığında sonra üç sonuçlara gruba ayrılabilir: (1) herhangi bir değişiklik; (2) efektör translokasyon artması; (3) efektör translokasyon Azalmış. Daha sonra istatistiksel analiz, örneğin, bir Öğrenci t testi için, gözlenen herhangi bir fark, t önemini belirlemek için kullanılabiliro OTP kontrol bulaşmış. Üç ayrı deneyden elde edilen efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ya Rab7A ya susturulması sonucu Şekil 5A'da gösterilmiştir. Blam-CBU0077 translokasyon düzeyinde anlamlı azalma OTP kontrol (p değeri = 0.0088 (Rab5A) ve p değeri = 0.0059 (Rab7A), eşleştirilmiş Student t testi) ile karşılaştırıldığında Rab5A ve Rab7A hem susturma sırasında meydana geldi. hücre canlılığı üzerinde siRNA tedavisinin etkisi de kurulmuştur. Translokasyon tahlilinde sonra hücreler, sabit olduğu bir çekirdek boyası ile boyandı ve daha sonra ölçülebilir. OTP kontrolü (% 12 ve% 31, sırasıyla) ile karşılaştırıldığında, hücre canlılığında bir düşüşe Rab5A ya Rab7A sonuçları ile tedavi, bu azalma PLK1 (% 97), bilinen bir gen gibi ağır olmasa da, Şekil 5C'de gösterildiği gibi, hücre ölümüne sebep (p-değeri = 0,0102 (Rab5A) p-değeri = 0.0081 (Rab7A) p-değeri <0.0001 (PLK1), eşleştirilmiş Student t-testi). ge konağın susturma nasıl Bu sonuçlarsiRNA kullanarak nes olumsuz bakteriyel efektör translokasyonu seviyelerini değiştirebilir.

Şekil 1. Enfeksiyon sırasında Blam Yüzey Etki mekanizması. C. burnetii'nin konakçı hücreler tarafından ve lizozom türevi vakuol Coxiella içeren yeni vakuol olarak adlandırılan oluşturur. 24 saat Enfeksiyondan hücreler β-laktamaz, yani Bam-CBU0077 effektör Resim translokasyon, kumarin uyarma yokluğunda. FRET çifti (A) oluşturan iki florofor sahip membran geçirgen Blam alt-tabaka ile yüklenir yeşil floresan sinyali (520 nm) (B) gözlenen floresan FRET 410 nm ile sonuçlanır. fonksiyonel Nokta / ICM salgılama sistemi durumunda, Bam-CBU0077 füzyon proteini, konakçı hücre içerisine doğru olacak ve Cı olacakİki boya ayrılmasına neden olur ve FRET bozulması ve 410 nm (C) uyarma sonra mavi bir flöresan sinyalinin (450 nm) 'de elde edilen, β-laktamaz aktivitesi ile, Bam substratı eave. Hem yeşil ve mavi flüoresan sinyalleri, bir floresan plaka okuyucu kullanarak tespit edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Şekil 2. Ters NAKLİ VE Translokasyon Testi İş Akışı Şematik Bakış 1. Gün: C hazırlayın burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü Gün 4: a. 96-kuyu tepsi içinde / oyuk 3.92 x 10 3 hücre nihai yoğunlukta 40 nM siRNA ve tohum HeLa 229 hücreleri kullanılarak Ters transfeksiyonu Gün 5:. Change medya 7. Gün:. C. toplam genomları / ml niceliğini burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanarak ve daha sonra 300 Gün 8 bir İçişleri Bakanlığı ile ters transfekte hücreleri enfekte., 6x yükleme boyası ekleyin floresan ölçmek ve hücre sayısını ölçmek , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. Ters Transfeksiyon ve HeLa 229 Hücrelerinin Seeding kurma için kullanılır 96-kuyu Plaka Düzeni. (Kırmızı ile gösterilen) "boş" kuyu medya sadece içerir ve siRNA veya HeLa 229 hücreler ya eklenmesini gerekmez. o şekilde optimize edilmiştir beri OTP siRNA (bulaşmamış kuyu ve enfekte kuyuları için lacivert için açık mavi gösterilir), olmayan bir hedefleme kontrol olarak kullanılıraz hedef dışı etkileri vardır. kestane ve yeşil kuyular sırasıyla Rab5A ve Rab7A siRNA temsil etmektedir. PLK1 ifade kaybı hücre hatları büyük çoğunluğu pro-apopitotik yollar ve geniş hücre ölümünü teşvik gibi (sarı gösterilir) PLK1 siRNA transfeksiyon verimliliği bir ölçüsü olarak kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Temsilcisi qPCR Ct Değerleri C. genomları / ml toplam sayısı ölçmek için kullanılabilecek burnetti pBlaM-CBU0077 Kültürü (A). Coxiella kültürlerinde genomları / ml sayısını saymak qPCR kullanılan çevrim koşulları. Standartlar ve numuneler için Ct değerleri, grafik (B) ve sayısal (C) yer almaktadırbiçimleri. (D) standart Ct değerleri, ortalama grafikle ve logaritmik eğilim çizgisi hesaplanmıştır bulundu. Denklemi ve örnek ortalamaları kullanılarak Ct C. genomları / ml toplam sayısını değerleri burnetti pBlaM-CBU0077 kültür × 10 8 2.31 ​​olarak belirlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

SiRNA Rab5A ve susturma ve Rab7A. HeLa 229 hücre sırasında Dot / ICM Efektör Blam-CBU0077 Şekil 5. Translokasyon ters Rab5A özgü siRNA (kestane çubuklar), Rab7A (yeşil çubuklar), OTP (mavi bar) ya da PLK1 ile transfekte edildi (sarı çubuklar) ve C ile enfeksiyondan önce 72 saat süreyle inkübe 24 saat boyunca 300 MOl'de burnetti pBlaM-CBU0077 soyu. t sonraO Bam alt-tabakanın eklenmesi, floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür (A) Tablo 450 ile birlikte, tek bir deneyden elde edilen ham floresans değerlerini gösterir. boş değerler çıkarıldıktan sonra enfekte olmamış OTP kontrolüne 520 nm oranı görece (ortam sadece hücre yok). Translokasyon (B) ve hücre yaşayabilirliği (C) 'nin düzeyi yüzdesi olarak sunulmuştur, üç bağımsız deneyin OTP ters transfekte enfekte hücrelere ± standart sapma oranının ortalaması. * P değeri <0.05; ** P değeri <0.01; **** P-değeri <0.0001 (eşleştirilmiş Student t-testi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1. Bileşenleri Gerekli 1x ACCM-2 yapmak.

Uygun Konsantrasyon Nemlendirici Liyofilize siRNA için gerekli 1x siRNA Tampon Tablo 2. Cilt.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.