Method Article

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

DOI:

10.3791/54214

⸱

July 9th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli beyin dokusundan mitokondriyal görselleştirme ve analiz zorlu bir iştir. Burada, bu kritik enerji üreten organelin morfolojik ve hacimsel analizi hakkında bilgi edinmek için seri blok yüz taramalı elektron mikroskobundan (SBFSEM) elde edilen üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon analizinin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan beyni ağırlıklı bir yakıt kaynağı olarak glikoz dayanan bir yüksek enerji tüketen organdır. Glukoz adenosin trifosfat (ATP) şeklinde hücresel enerji üretmek için glikoliz, tri-karboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) yollar ile beyin mitokondrilerde katabolize edilir. mitokondriyal ATP üretimi düşüklüğü belirgin nörolojik ve myopatik semptomlar ile klinik mevcut mitokondriyal bozukluklar neden olur. Mitokondrial kusurlar da nöro bozuklukları (örneğin otizm spektrum bozukluğu) ve nörodejeneratif bozukluklarda mevcut (örneğin, amiyotrofik lateral skleroz, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları). Böylece, sağlıklı ve hastalık durumları hem altında mitokondriyal morfolojisi, yapısı ve dağıtım 3D analizini gerçekleştirmek için alanında artan bir ilgi var. Beyin mitokondriyal morfoloji özellikle bazı mitokondri ile bu son derece çeşitlidirsinaptik bölge geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü sınırının altındadır <200 nm çaplı aralığında olmak. beyinde mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteinini (GFP) ifade anlamlı konfokal mikroskopi ile organel algılama arttırır. Ancak, büyük ölçekli mitokondri görüntüleri oversaturating olmadan nispeten küçük ölçekli mitokondri saptanmasının duyarlılığı üzerindeki kısıtlamaları aşmak değil. seri geçirimli elektron mikroskobu başarıyla nöronal sinaps mitokondri karakterize etmek için kullanılmış olsa da, bu teknik son derece zaman alıcı birden fazla numune karşılaştırırken özellikle olduğunu. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBFSEM) tekniği, doku ve veri toplama görüntüleme blokları kesit bir otomatik süreç gerektirir. Burada, hızla yeniden ve mitokondriyal morfolojisi görselleştirmek için kemirgen beyin tanımlanmış bir bölgenin SBFSEM gerçekleştirmek için bir protokol sağlar. bu teknolojinique da tanımlanan bir beyin bölgesi mitokondriyal sayısı, hacmi, boyutu ve dağılımı üzerindeki doğru bilgi temin etmek için kullanılabilir. Elde edilen görüntü çözünürlüğü (genellikle 10 nm altında) yüksek olduğundan herhangi bir brüt mitokondriyal morfolojik bozukluklar da tespit edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri hücre iskeleti ile sıkı etkileşim içinde, onların şekil ve hücresel ipuçları ve ihtiyaçlarına bağlı olarak konumunu değiştirmek dinamik organelleri vardır ve bu tür nöronlar 1 kalsiyum kanal akımlarının gibi hücresel olaylara yanıt olarak. Diğer hücre organelleri sırayla kendi dinamiklerini ve metabolizmasını 2 düzenleyen endoplazmik retikulum, örneğin ile mitokondri de etkileşim. Mitokondriyal morfolojisi yani farklı hücre tiplerinde heterojenitesini gösterir. organelle şekli bu levhalar, çuvallar ve oval 3 oluşan için boru şeklinde değişir. Mitokondriyal füzyon ve fisyon döngüsü proteinleri yer, boyut, şekil ve mitokondri 4 dağılımını düzenler gösterilmiştir. Ayrıca, mitokondriyal şekil değişimleri nörodejenerasyon, nöronal plastisite, kas atrofisi, kalsiyum sinyali, reaktif oksijen türleri üretimi gibi ömrü ve hücre ölümü karıştığı THA ile ilişkilidirT hücre spesifik mitokondriyal morfolojisi normal hücresel fonksiyonun 5-11 bakımı için kritiktir.

Mitokondri önemli bioenergetic fonksiyonu TCA döngüsü yoluyla tam besin dağılımı (yani, glükoz, yağlı asitler ya da amino asitler) içerir ve OXPHOS 12 geçiş yolu, metabolik reaksiyonlar bir dizi yürüterek adenosin trifosfat (ATP) üretmektir. İnsan beyni vücut ağırlığının sadece% 2 ancak ~ o organı 13 zorlu bir derece enerji verme üretilen toplam enerjinin% 20'sini tüketir oluşturmaktadır. İnsanlarda mitokondriyal fonksiyon bozukluğu, nörolojik belirtiler 14-17 çok sayıda yol açtığı şaşırtıcı değildir. Genetik ~ 1 bir prevalans ile bozuklukların klinik heterojen bir grup olan mitokondriyal hastalıkların 17,18, ATP nesil açar bozan OXPHOS bileşenleri mutasyonlar: 5.000 birey ve m en yaygın nedenlerinden biridirçocuklarda ve erişkinlerde etabolic bozukluklar. Mitokondri türevi ATP açığı, beyin, kalp ve iskelet kasları ağırlıklı bu hastalarda 14,17,18 de etkilenen gibi yüksek enerji gerektiren organları ile çoklu organ sistemleri etkiler. Son yıllarda, birçok çalışma nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların 15-17,19,20 hem mitokondriyal disfonksiyon için kanıtlar sağlamıştır. mitokondri temel ve beyin gelişimi ve işlevi için kritik olduğundan, hem sağlıklı ve hastalıklı devletlerin altında beyin mitokondriyal morfoloji, yapısı, büyüklüğü, sayısı ve dağılımında değişikliklere analiz protokolleri geliştirmek zorunludur. Mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteini (GFP) sıçan modelleri beyin 21,22 mitokondriyal hareketleri ve lokalizasyon görselleştirmek için üretilmiştir. Bu mitokondriyal hareketliliği ve genel dağılımını incelemek son derece yararlı bir araç olsa da, includ bazı dezavantajları vardırE sınırlı çözünürlük ve floresan mikroskobu duyarlılığı. Bu nitelikler zor nispeten küçük ölçekli mitokondri izlemek için yapmak. Benzer şekilde, seri transmisyon elektron mikroskobu başarıyla sinaptik mitokondri 23 görüntülemek için kullanılan, ancak bu yöntem çok zaman alıcı değil. Mitokondriyal morfoloji, sürekli fizyon ve füzyon döngülerine tabi olarak son derece dinamik olduğu bilinmektedir ve çoğu hücrelerde mitokondri son derece bağlı bir ağ 24-26 korumak olduğunu. Nöronlar çok onlar bu neurites yollarını (Şekil 1) yapmak gibi ayrı gerekebilir birden dendritler ve genişletilmiş akson ve hücre gövdesinde bağlı bir retiküler ağ oluşturmak mitokondri hücreleri polarize edilir. Bu boyut ve şekil son derece çeşitli beyin mitokondri yapar. Örneğin, bir seri bloğu yüz tarama elektron mikroskobu kullanılarak (SBFSEM) tekniği, daha önce gözlenen extrasynaptic mitochondr hacmi ya da boyut olarak farklılıkon altı 27 kat olarak sinir uçlarında bulunan mitokondri ia kadar olabilir.

Sesi gerçekleştirmek için çeşitli yaklaşımlar vardır ultramicrotome SEM 30 toplama seri bölüm TEM 29, otomatik bant içeren, 28 analizleri, iyon ışın SEM 31 ve SBFSEM 32 duruldu. SBFSEM analizi, beyin 1 mm'ye kadar alanda mitokondri gibi morfolojik şekil, boyut, dağıtım ve organellerin sayısal verisi sağlamak için çözünürlüğü sahip olduğu avantajlara sahiptir. Teknik çalışma bir önceki EM deneyim eksikliği birçok biyolojik laboratuvarlar yetenekleri dahilinde veri toplama ve analizi ile, aynı zamanda en az talep ediyor. Seri bölüm benzeri görüntüler üretmek için ticari araçların gelişi dokuların 3D ultrastrüktürel analiz yapmıştır ayrıca hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde 28 tarafsız bir hacimsel analizini veren bir rutin teknik, Sup. SBFSEM sonra ilk nöronal devrenin 34 rekonstrüksiyonu analizinde önemli bir araç olarak bu tekniği kurduk 1981 yılından bu yana 33. Birden çalışmalarda Leighton tarafından tanıtılan bir fikrine dayanan, 2004 32 nörobiyoloji alanında tanımlanan ve kullanılmıştır. Ayrıca, birçok küçük ölçekli projeler için, hücresel organellere 27,35-39 belirlemek için yeniden analiz sağlar. Bu yana, edinilen görüntüler alçak gerilim geri saçılım elektron türetilmiştir, bilinen farklı ağır metal boyama tekniklerini birleştiren yeni boyama protokolleri çözünürlüğü 40 artırmak için geliştirilmiştir.

Bu yazıda, 3D elektron mikroskopi görüntüleme ve daha önce bize ve diğerleri 38,39,41 tarafından kullanılmış olan yöntemlere dayalı beyin mitokondri hacimsel analizini kullanan bir protokol sağlar. Doku sonrası işleme yöntemleri, daha önce Deerinck ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir kullanılan40.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Dikkat: Bu protokolde kullanılan çeşitli parçaların kullanımında ve atarken aşırı önlemler alınmalıdır. Kullanmadan önce, kurumsal düzenlemeler ve iş sağlığı ve güvenliği uygulamaları yerel özellikle bir ağır metal ve radyoaktivite kaynağı ve kurşun nitrat hem uçucu ve son derece zehirli olan osmiyum tetroksit, uranil asetat, için, kurulmuş ve takip edilmelidir bir ağır metal zehir. Tiyokarbohidrazid (TCH) yanlış kullanılırsa, patlayıcı ve zehirli gazlar üretmek için ayrıştırmak. Birçok kurum bu reaktifler rutin kullanılmaktadır ve yardım sağlayabilir hangi bir EM çekirdek tesisine sahip olacak.

Beyin Dokusu ve SBFSEM Görüntüleme 1. Hazırlık

  1. % 5 isoflura - 4 kullanarak - (4 aylık ~ 2) C57 siyah fare (C57BL / 6J suşu) genç uyutmakne kurumsal yönergeleri izleyerek. kas tonusu, istemli hareketlerin ve kuyruk tutam gibi caydırıcı uyaranlara yanıtları eksikliği kaybı izleyerek anesthetization onaylayın.
  2. Bir diseksiyon tepsi üzerinde fare Pin ve ventral orta hat boyunca deri üzerinde bir kesi yapmak. fare göğüs kafesini maruz deride daha kesiler olun. diyaframı insizyon ve dikkatli bir şekilde kalpte ortaya çıkarmak için çevresi boyunca göğüs boşluğunu teşrih ve sağ atrium bir kesi yapmak.
  3. Bir kelebek kanül kullanılarak, sol ventrikül kanüle. kan kaybı karaciğer renkte bir değişiklik ile teyit edilene kadar, fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.2 içinde 20 ml - transkardiyal 10 kullanılarak fare serpmek.
    Not: Karaciğer renk değişikliği kan kaybından kapsamını belirlemek için bir rehber olarak kullanılır. kırmızımsı kahverengi karaciğer renk değişiklikleri pembe soluk onaylayın.
  4. % 2 Glutaraldehit 20 ml - transcardially 10 kullanarak fare serpmekaldehid ve% 4 paraformaldehid içinde hızlı bir şekilde beyin dokusu düzeltmek için, 0.10 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde yapılır. Sabitleme kuyruk sertleşme gözlemleyerek tarafından izlenir.
    pH ayarı, ve su ile 100 ml hacmi oluşturmak için hidroklorik asit ilave, 80 ml su içinde bir sodyum kakodilat içinde 2.14 g çözülerek 0.10 M kakodilat tamponu (pH 7.2) hazırlayın: edin.
  5. Perfüzyon sonrasında, fare decapitate 4 O ° C'de 48 saat süre ile 0.10 M sodyum kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) ihtiva eden% 2 glutaraldehid ve% 4 paraformaldehid içinde fiksasyonu takiben beyin, teşrih
  6. 48 saat sonra, bir vibratome kullanarak 400 mikron koronal kesitler yapmak ve daha sonra dikkatli bir şekilde diseksiyon mikroskobu 42 uyarınca (örneğin, hipokampus) beyindeki ilgili bölgeyi incelemek. Dikkatle doku Döşeme ve yönlendirmesini korunması için bir resim çekin.
    Not: SBFSEM doku boyama Mesaj işleme yöntemleri ağır metal boyama yöntemleri çeşitli birleştirirSipariş çözünürlüğü artırmak için ve Deerinck ve ark 40 tarafından daha önce geliştirilen yönteme dayanır.
  7. glutaraldehid ile sabitlenmiş dokular 3 defa 5 dakika 0.1 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde, her bir yıkama.
  8. 0.1 M sodyum kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde tannik asit çözülmesiyle% 0.1 tanik asit çözeltisi hazırlayın. çözülene kadar girdap ve gerekirse, 0.45 um'lik bir filtreden filtre.
  9. Oda sıcaklığında 60 dakika - Postfix'i kakodilat olan dokular 30 1 mi reaktifi, inkübasyon yolu ile tanik asit,% 0.1 tamponlu.
    Not: kuluçka süresi doku büyüklüğüne bağlıdır, ancak 30 dakika çoğu dokuda en iyi şekilde çalışır.
  10. dokular 3 defa 5 dakika kakodilat tamponu içinde her birinin (pH 7.2) yıkanır.
  11. H2O damıtılmış 10 ml (dH 2 O) 0.3 g potasyum ferrosiyanat ve 0.86 g sodyum kakodilat eritin. Buz üzerinde potasyum ferrosiyanat çözüm tutun. Kullanımdan hemen önce,% 4 ozmiyum tetroksit (10 ml OsO 4) ekleyin.
  12. % 2 os ile dokuları LekeBuz üzerinde 90 dakika süreyle MIUM-ferrosiyanür çözeltisi. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın
  13. 10 ml dH 2 O 0.1 gr TCH çözerek% 1 tiyokarbohidrazid (TCH) çözümü hazırlayın tamamen çözünene kadar her 10 dakikada bir dönen 60 ° C'de çözülür. TCH tutarken kurumasına yüksek sıcaklık veya izin çözüm metallerin kullanımını, ısınmayı önlemek için özen özellikle güvenlik önlemlerine uyunuz.
  14. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca taze hazırlanmış% 1 TCH olan örnekleri tedavi edin. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın
  15. DH 2 O% 2 OsO 4% 4 seyreltilir, 1 saat süre ile inkübe edilerek% 2 sulu ozmiyum tetroksit ile leke dokular. DH 2 O. ile dokular 3 defa, 5 dakika her yıkayın
  16. 4 ° C'de dH 2 O içinde% 1 uranil asetat örnekleri O / N inkübe edin.
  17. (Deerinck ve arkadaşları 40 tarafından tarif edildiği gibi) Walton kurşun aspartat çözeltisi hazırlayın.
    1. 250 ml dH 2 O 0.998 g L-aspartat çözülürpH 5.5 ulaşıncaya kadar ve sonra da damla damla 10 N potasyum hidroksit (KOH) ekleyin. pH ayarlaması sonra 30 dakika boyunca 60 ° C, asit stok ve ısı aspartik 10 ml talebi nitrat, 0.066 g ekleyin.
  18. DH 2 O dokuları yıkayın ve 60 ° C fırın içinde 30 dakika boyunca Walton kurşun aspartat boyasıyla inkübe edin. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın
  19. % 100 etanol ile, ardından, her biri 5 dakika için% 20,% 50,% 75,% 85 ve% 95 etanol soğutulmuş solüsyonlar kullanılarak alkolün kademeli dizi 3 kez 10 dakika her biri numune kurutmak.
    Not: açılan etanol havadan su emer gibi yeni açılmış şişeden% 100 etanol kullanın ve başarısız olmasına gömme neden olur. Uzun inkubasyon büyük doku örnekleri ile gerekli olacaktır.
  20. Yıkama örnekleri 2 kez 15 dakika propilen oksidin her.
  21. (Süksinik anhidrit dodesenil) 25 ml reçine, 10.5 ml DDSA kullanarak plastik gömme reçine, 15.5 ml NMA (nadik metil anhidrit) ve 1 ml yapınDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). sallayarak reçineyi karıştırın. Spin ve reçine kabarcıklar çözülene kadar bekletin.
    Not: Bu standart orta sertlikteki reçetedir. Elektron mikroskopisi (EM) plastik reçine diğer tipleri kullanılabilir ancak tüm reçineler SBFSEM için çalışmaz gibi önceden bir esansiyel olmayan kontrol numunesi ile test edilmesi gerekir.
  22. - 10 saat, propilen oksit, yaklaşık 8 arasında bir süre boyunca buharlaşır, böylece 2 saat sonra, ilk başta daha sonra kapaksız kapaklı bir küçük şişe içinde, gömme reçine ve propilen oksidin 50 karışımı: 50 dokuların O / N inkübe edin.
  23. 2 saat boyunca temiz şişelerde% 100 taze gömme reçine dokuları aktarın.
  24. Düz kalıpların taze gömme reçinesi içinde yerleştirme örnekleri, kağıt etiketler basılmış ve 48 saat boyunca 60 ° C'de bir fırında tedavi içeren. yaklaşık 1 saat sonra, tekrar doku yerleşimi ve hizalamayı kontrol ve gerekirse ayarlayın.
  25. ilgi alanına örnekleri Trim ve gellin kullanarak bir alüminyum pim üzerine monteg siyanoakrilat superglue veya iletken epoksi reçine, daha sonra kolloidal gümüş ile kaplama alüminyum pin bir iletken yolu sağlamak için bloğun kenarlarına yapıştırın.
  26. Bir in-bölme ultramicrotome evre ve düşük kV geri-saçılmalı elektron detektörü 32 ile donatılmış bir tarama elektron mikroskobu sistemi kullanılarak doku örneklerinin incelenmesi.
    Not: taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanın Araca ve site eğitim alın ve yetkili kullanıcı olmak. Alternatif olarak, küçük projeler için bir araştırmacı veya çekirdek tesisi ile işbirliği mümkün olabilir. SEM röntgen oluşturmak gibi Radyasyon eğitimi de gerekli olabilir.
  27. örneklerin görüntü için aşağıdaki ayarları kullanın: 2.25 kV, 5 de - 10 nm / piksel çözünürlük, 80 arasında saha boyutları ile - x 250 mikron, y (diğer tarla mümkün boyutları) ve 50 dilim kalınlığı - 100 nm, 20 saat süre - 16 600 dilim - 250 toplamda.
    Not: Ayarlar farklı mikroskoplar arasında önemli ölçüde farklılık, indireysel örnekleri ve istenen çözünürlük. Bu ayarlar birçok örnekler için kolayca yorumlanabilir görüntüleri üretmek gerekir.

2. Görüntüleme DataSet Analizi

Not: Resim J / Fiji yazılım veri kümesini analiz etmek için kullanılan ve TrakEM2 eklentisi dayanmaktadır edilir. Ön işleme aşamaları yazılımı kullanarak çeşitli yapılabilir ve geniş ya da deneyim düzeyine bağlı minör olabilir ve yığınlar aldı. açık kaynak kodlu yazılım kullanarak ana dönüşümler burada açıklanmıştır (1.50b ver ImageJ, FIJI 1 Ekim 2015 indir).

  1. yazılımda açılması ve menü Eşyaları Görüntü → Tipi → 8 bit seçerek orijinal patentli 16-bit görüntülerden 8 bit TIFF formatında görüntüleri dönüştürmek.
    1. Bu adım sırasında otomatik kontrast / parlaklık dönüşüm görüntüler için ideal değilse, 16-bit görüntüleri yeniden ve basın Görüntü Parlaklık / Kontrast → ayarla →. Tüm fotoğraflar için çalışan bir dizi seçin ve basın uygulayın. Sonra c gerçekleştirinonversion. Not: Bazı SEM'ler, bu adım mikroskop üreticisi yazılımını gerektirebilir.
    2. Nedeniyle dilimleri arasında kabul edilemez görüntü hareketi, Gerekirse (örn., Nedeniyle şarj drift), / kayıt görüntü yığınlarını (menü öğeleri Eklentiler Doğrusal StackAlignmentWithSIFT → → Kayıt) hizalayın. En kayıt yazılımı olarak, "çeviri sadece" modunda ziyade "rijit gövde" için ayarlayın.
      Birçok yaklaşımlar ve yazılım işe yarayabilir: Not birçok uygulama için SIFT kayıt plug-in eserleri ve sanal bir yığın sürümü var.
      1. Gerekirse, kayıt öncesi (Görüntü → canvassize → ayarlayın) ya da (Crop → Görüntü) ilgi alanına azaltmak tuval boyutunu büyütmek.
        Bazı sürüklenme veya meyletme oluşabilir ve diğer eklentileri veya yazılım çalışırken daha iyi sonuçlar doğurabilir: Not. Manuel seçenekleri de (örneğin. ImageJ / FIJI, Eklentiler → Kayıt → ManualLandmarkSelection) bulunmaktadır.
    3. desir Eğered, daha küçük, daha yönetilebilir boyuta ölçekli görüntüleri (örn.% 25) ImageJ (Görüntü → Ölçeği) kullanarak.
  2. yazılım, Dosya → ithalat → görüntü sırası başlatın ve ardından tiff dosyaları seçin.
  3. (Boş) Yeni → TrakEM2 Dosya → seçerek eklenti başlatın. İki pencere açılacaktır; bir projeye ve area_lists yönetir ve diğer izleme yönetir ve tuval "olarak adlandırılır.
  4. tuval ithalatına sağ tıklama yaparak eklenti içine görüntü yığınını yükleyin. ithalat seçin ve ithalat yığının üzerine tıklayın. Pop-up seçeneklerinde sanal yığınlarının kutusunu işaretleyin.
    Not: Görüntü yığınları zaten yazılım açıldı rağmen, onlar da eklenti açılmalıdır. Sanal yığınları kutusu işaretlendiğinde ise bilgisayar daha sorunsuz çalışabilir.
  5. Eşleşme oluşturulur ve yığın yüklendikten sonra, sağ eklenti pencerenin altında proje adı için tıklayın. Sağ şablon col 'yeni bir proje' üzerine tıklayınUMN ve bu proje için 'yeni çocuk eklemek' seçeneğini seçin. Sağ 'area_list' seçmek için tekrar tıklayın.
  6. Tuval üzerine sağ tıklayarak orijinal elektron mikroskobu ayarları ile kabul projenin Z ekseni ölçeği ayarlama, sonra ekranı tıklayın ve kalibrasyonu seçin. Ayrıca, eklenti penceresindeki tüm katmanları seçerek Z-ölçek ayarlamak, doğru ölçek Z ve kalınlığı seçmek için tıklatın.
  7. Tıklayın ve 'proje' ve proje tuval penceresinde 'Z boşluk' sekmesi altında 'alan listeleri' oluşturmak için bölüm nesneleri içine tüm 'çocuk' sürükleyin.
  8. 'Alan listesini seçin ve sağ seçin ve bir renk ayarlamak için tıklayın. Şimdi, elektron mikroskobu görüntüleri, mitokondri gibi nesneleri izlemek için boya fırçası aracını kullanın. Kullan 'Shift + tık' kapalı bir daire içinde doldurmak için, 'Ctrl + kaydırma' ve uzaklaştırmak için, ve bir silgi içine boya fırçası imlecini açmak için 'Alt + tık'.
  9. 15 mikron - ~ 10 iki alanları seçin10 tarafından - resmin sol üst köşesinde ve sağ alt köşesinde 15 mikron ve her veri kümesi içinde mitokondri tarafsız örnekleme izin vermek için bu alanlarda tüm mitokondri tespit.
  10. 'Tuval' Açık, gözlemlemek ve bölümler boyunca mitokondri iz. Not: Mitokondri benzer büyüklükteki oldukça karanlık / yoğun görünen organeller, çapı ve gevşek silindirik. iç zarı tarafından oluşturulan benzersiz kristalarında bu organel içinde kolaylıkla ayırt edilebilir.
  11. izleme bittiğinde, sağ, Z uzay sekmesinin altında area_list tıklayın '3D göster' seçeneğini seçin. Bu takip görüntünün 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntülemek için 3D görüntüleyici eklenti başlatacak.
    1. mitokondriyal hacim ölçümleri, 3D görüntüleyici seçin nesne gerçekleştirmek için, 'Düzenle' sekmesine tıklayın ve 'Object Properties' seçiniz. mitokondriyal hacim tahmini birkaç diğer ölçümlerle birlikte listelenir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin mitokondriyal morfolojisi ve boyutu farklı nöronal alt bölümlerinde heterojen olduğunu göstermektedir. Lentivirüs mitokondriyal hedefli yeşil flüoresan protein ifade ile dönüştürülmüş düşük yoğunluklu nöronal kültürlerinde mikroskopisi uzak neurites kalanların ayrı uzatılmış morfoloji (Şekil 1 AB) sergilemek ise nöronal soma ikamet eden mitokondri, bir retiküler ağ oluştururlar olduğunu gösterdi. SBFSEM teknik kullanılarak, mitokondriyal morfolojisi, boyut, hacim v...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinir sisteminin karmaşıklığı, yeterli çözünürlüğe sahip mitokondri gibi büyük doku hacimleri yeniden ve morfolojisi ve organellerin dağılımı analiz önemli bir sorun teşkil etmektedir. Nöronlar, oligodendrosit ve üç boyutlu olarak uzatılmış çok sayıda süreçlerle astrositlerin dahil olmak üzere birden hücreler, beyin dokusu 43 içinde etkileşimde. Mitokondri hücreleri ve uzak süreçlerin soma hem de bulunduğu için, mitokondriyal morfolojisi sinir sistemi (Şekil 1) son derece pleomorfik olup. Yet...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Emily K Benson, Renovo Neural Inc.'in ücretli bir çalışanıdır ve Grahame J Kidd, seri blok yüzlü SEM hizmetleri ve analizinin ticari sağlayıcısı olan Renovo Neural Inc.'de 3DEM'in Bilimsel Direktörü olarak görev yapmaktadır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik yardım sağladığı için Sidney Walker'a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (1R01EY024712-01A1) bir hibe ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL / 6J farelerJackson laboratuvarı  664
IsofluraneVETone, ticari adı Fluriso501017
Diseksiyon tepsisiFisher scientific S65105 
Diseksiyon makasıTed Pella Inc.1316
Kelebek kanülExel International26704
Fosfat tampon salinSigma-AldrichP4417-100TAB
Filtre (0.45 mikron)EMD MilliporeNC0813356
Diseksiyon mikroskobuOlympusSZ61
Vibratom kesit sistemiTed Pella, Inc.Vibratom 3000
Sodyum KakodilatEMS12300
Tanik AsitEMS21700
Potasyum FerrosiyanürJ.T. Baker14459-95-1
Osmiyum Tetroksit %4 ÇözeltiEMS19150
TiyokarbohidrazidEMS21900
L-Aspartik AsitSigma-AldrichA93100
Potasyum HidroksitAcros Organics43731000
Kurşun NitratEMS17900
EMbed-812 GÖMME KİTİ EMS14120Embed 812 ve nbsp; reçine, DDSA, NMA ve DMP-30 içerir.
Gluteraldehit% 25 EM SınıfPolibilimler A.Ş.1909
ParaformaldehitEMS19202
Uranil AsetatEMS22400
EtanolEMS15055
Propilen OksitEMS20400
Gömme KalıbıEMS70907
Alüminyum numune pimiEMS70446
Kolloidal Gümüş SıvıEMS12630
Tıraş BıçağıEMS72000
Süper Yapıştırıcı (Loctite Jel Kontrolü)Loctite234790Hırdavat/el sanatları mağazaları bu ürünü taşır
İletken epoksiTed Pella Inc.16043
Taramalı elektron mikroskobuZeissSigma VP
Gatan Inc.için oda ultramikrotomunda3View2Diğer SEM'ler için tasarlanabilir
Pim hazırlama için kırpma mikroskobuGatan Inc.3View sisteminin
Düşük kV geri saçılan elektron dedektörüGatan Inc.3V-BSED
ImageJ / Fiji işleme paketi ImageJ ver 1.50b, FIJI indir 1 Ekim 2015http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/<
http://fiji.sc/TrakEM2
, SEM bir parçası olarak sağlanırtd colspan="4">

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185(2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68(2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918(2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011(2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29(2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Serial Block Face Scanning Electron MicroscopyMitochondrial Morphology AnalysisBrain Mitochondria ImagingElectron Microscopy TechniqueMitochondria Volume MeasurementMitochondria Distribution StudyMitochondria Number QuantificationRodent Brain Tissue PreparationUltrastructural Characteristics AnalysisMitochondria Compartment Classification

Related Articles